一種酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法，該方法為：通過酵母宏觀培養特征、酵母菌落形態觀察、假菌絲的形成、酵母菌子囊孢子的觀察、擲孢子鏡檢對酵母形態學鑒定；通過采用杜氏管發酵法、采用液體培養法、氮源同化、接種于NYDA斜面35℃下生長情況、致死溫度和耐乙醇能力，對生長曲線測定，實現生理生化指標的測定；通過酵母菌4-4A總DNA的提取、rDNA-ITS區域PCR擴增、PCR產物回收純化、產物連接轉化、陽性克隆檢測、ITS片段測序及分析，實現ITS序列的分析；制備方法為：酵母4-4A的富集培養；酵母4-4A液體劑型的制備；酵母制劑中活菌數的測定。本發明的采用發病率和嚴重度分別下降64%～67%和89%～90%，將生防酵母與低劑量的農藥配合使用，提高防治效果。
【專利說明】一種酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于芒果炭疽病防治【技術領域】，尤其涉及一種酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，炭疽病在采前和采后危害芒果，造成很大的產量和品質損失，是芒果生產上的重要病害之一，其病原菌主要為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides (Penz)Penz.&Sacc.)。長期以來，該病害的田間防治主要依賴化學殺菌劑，隨著苯并咪唑類化學藥劑的長期大量使用，膠孢炭疽菌已經對該類殺菌劑產生了抗藥性，使得防效下降。病原菌的潛伏侵染會造成芒果在采后流通過程中的大量損失，采后炭疽病的防治也需要化學藥劑，隨著人們對環境保護和食品安全越來越重視，研發更加安全、環保的芒果炭疽病采前采后防治新技術，如生物防治，顯得更加迫切。
【發明內容】
[0003]本發明實施例的目的在于提供一種酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法，旨在解決現有的芒果炭疽病防治使用化學殺菌劑提高了病菌的抗藥性，不利于環境的保護和食品安全性的問題。
[0004]本發明實施例是這樣實現的，本發明實施例的酵母菌分離、篩選的方法，該酵母菌分離、篩選的方法包括以下步驟:
[0005]步驟一、通過酵母宏觀培養特征、酵母菌落形態觀察、假菌絲的形成、酵母菌子囊孢子的觀察、擲孢子鏡檢對酵母形態學鑒定；
[0006]步驟二、通過采用杜氏管發酵法、碳源同化采用液體培養法、氮源同化、接種于NYDA斜面35°C下生長情況、致死溫度和耐乙醇能力，對生長曲線測定，實現生理生化指標的測定；
[0007]步驟三、通過酵母菌4-4A總DNA的提取、rDNA-1TS區域PCR擴增、PCR產物回收純化、產物連接轉化、陽性克隆檢測、ITS片段測序及分析，實現ITS序列的分析。
[0008]進一步，步驟一的具體方法如下:
[0009]第一步，酵母宏觀培養特征
[0010]先將酵母菌接在NYDA斜面上，25°C培養2天~3天活化，然后取菌體I環接入含40mlNYDB液體培養基的100ml三角瓶中，25°C恒溫靜置培養3天；
[0011]第二步，酵母菌落形態觀察 [0012]將菌株活化培養2天~3天后，取一環接于NYDB培養基中，28°C振蕩培養24小時，稀釋后涂平板于NYDA固體培養基，28°C培養3天；
[0013]第三步，假菌絲的形成
[0014]將倒好的PDA平板倒置1天~2天使其表面干燥，用活化好的酵母劃線接種2條~3條，蓋上滅菌的蓋玻片，28°C下培養5天后取蓋玻片觀察劃線兩旁假菌絲形成情況及形態；
[0015]第四步，酵母菌子囊孢子的觀察
[0016]將已活化的酵母菌株接種至Gorodkowa瓊脂培養基、豆芽汁葡萄糖培養基、PDA培養基，25°C培養3天，鏡檢子囊孢子形成情況，凡未見孢子的時間延長至4周~6周，每周檢查子囊孢子出現情況；
[0017]第五步，擲孢子鏡檢
[0018]將倒好的PDA平板放置2天，然后將酵母菌株沿垂直直徑方向劃線接種，倒置放于另一個PDA平板上，放置一個無菌載玻片，將緊扣的兩個培養皿置于25°C培養三周，取出載玻片觀察載玻片上的孢子。 [0019]進一步，在步驟二中，生理生化指標測定具體方法如下:
[0020]第一步，糖發酵
[0021]將需要測試的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8種糖用蒸餾水配成質量分數20%的母液，細菌過濾器過濾后放在4°C冰箱內備用；
[0022]采用杜氏管發酵法，取口徑12mm的試管，每管加入7.2ml黃豆芽汁，將杜氏管倒置于大試管中包扎后121°C滅菌20min備用；分別于每支試管內注入20%的糖母液0.8ml，并使小管內外的糖擴散均勻，再將酵母分別接種于含糖試管中，28°C靜置培養7天后觀察；凡不產氣的試管可延長培養至10天再觀察，杜氏管內有氣泡計為陽性，無氣泡計為陰性；
[0023]第二步，碳源同化
[0024]采用液體培養法，在含0.5%碳源的基礎培養基中，接入酵母種子液，濃度達到IO4個/ml，以加入葡萄糖的基礎培養液為對照，28°C振蕩培養，觀察生長情況；
[0025]第三步，氮源同化
[0026]挑取底部較平整的滅菌培養皿，取20ml無氮源固體基礎培養基熔化，冷卻到50°C后注入酵母菌懸液Iml搖勻；待培養基凝固后，28°C倒置5小時；然后添加氮源并在培養皿底部標記氮源名稱，28°C培養2天，觀察酵母菌的生長情況，接種前，酵母菌需在無氮源基礎培養基中進行饑餓培養；
[0027]第四步，35°C下生長情況
[0028]將活化的酵母菌株劃線接種于NYDA斜面，35°C下培養3天~4天后觀察生長情況；
[0029]第五步，致死溫度
[0030]將NYDB液體培養基裝入口徑12_的試管中，每管4ml ;再加入酵母菌液1ml，水浴加熱，溫度上升到預定值時計時IOmin ;28°C過夜后涂板確定酵母是否全部死亡；從30°〇開始，5°C為梯度遞增，直到酵母全部死亡的溫度，然后從上一個溫度以1°C遞增即可；
[0031]第六步，耐乙醇能力
[0032]向試管中加入NYDB液體培養基和無水乙醇，先加NYDB滅菌后再加無水乙醇；將酵母菌株的培養物稀釋后取Iml加入上述培養基中，28°C培養3天~5天，在600nm下測定OD值；
[0033]第七步，生長曲線測定
[0034]采用NYDB液體培養基，將酵母菌株活化，取兩環接種于50ml種子培養基中，28°C培養24小時，取Iml種子液接入發酵培養基中，接入的體積比為50ml/250ml，28°C，200r/min搖床培養，每2小時取樣稀釋20倍后在600nm吸光度下測定其OD值，根據時間和菌液濃度繪制酵母的生長曲線圖。
[0035]進一步，在步驟三中，ITS序列分析的具體方法如下:
[0036]第一步，酵母菌4-4A總DNA的提取
[0037]使用TaKaRa的酵母基因組DNA提取試劑盒提取，取新鮮培養的含有I~2X IO8酵母菌的培養液至1.5ml離心管中，12000r/min離心Imin,除去上清，向沉淀中加入500 μ I的GenTLEYesatSolrtionA ;振蕩充分懸浮沉淀，于37°C溫浴I小時，期間振蕩，后加入 100 μ I 的 GenTLEYesatSolrtionB,振蕩后于 70°C 溫浴 IOmin ;加入 200 μ I 的GenTLEYesatSolrtionC ;振蕩后冰上冷卻5min, 12000r/min, 4°C離心5min,將上清移入新的離心管中，加入上清液1/2體積的異丙醇，混勻；12000r/min，4°C離心5min ;向沉淀中加Λ 500 μ I預冷的70%的乙醇，上下顛倒洗滌沉淀，12000r/min，4°C離心5min ;用移液器盡量除凈上清液，室溫下自然干燥，后加入40 μ ITEbuffer溶解基因組DNA ；
[0038]以DL2000為DNAMaker，上樣量4 μ 1，用1%瓊脂糖凝膠電泳40minl00V后檢測DNA ；
[0039]第二步，rDNA-1TS區域 PCR 擴增
[0040]PCR 擴 ±曾引物 ITSl: 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '；ITS4:5/ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';反應體系如下:
[0041]PCR 反應程序為:95°C預變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，反應共30個循環；72°C延伸10min，4°C保溫；
[0042]反應完成后，以DL2000為DNAMaker，上樣量5 μ I，用1%瓊脂糖凝膠電泳40minl00V 后檢測 DNA ；
[0043]第三步，PCR產物回收純化，利用DNA回收試劑盒進行PCR產物純化，方法如下:
[0044]I)切取含有目的片段的瓊脂糖凝膠后放入1.5mlEppendorf管；
[0045]2)加入400 μ IBufferGM,室溫15°C~25°C融化膠塊，振蕩混合，使膠徹底融化；
[0046]3)將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，將(2)中的溶液移至SpinColumn 中，12000r/min 離心 Imin ；
[0047]4)將收集管中的液體重新上柱，12000r/min室溫離心Imin ；
[0048]5)將 700 μ I 的 BufferffB 加入 SpinColumn 中，室溫 12000r/min 離心 30s,棄濾液；
[0049]6)重復 5);
[0050]7)將 SpinColumn 安置于 CollectionTube 上，室溫 12000r/min 離心 Imin ；
[0051]8)將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn的膜中央加入30 μ I的滅菌水,室溫靜置Imin ；
[0052]9) 12000r/min室溫離心Imin后收集離心管中的液體，即為回收的DNA片段，立即使用或保存于_20°C冰箱備用；
[0053]第四步，產物連接轉化，在0.5ml離心管中按以下連接體系加入各物質，混勻后在低溫水浴鍋中16 °C過夜連接；
[0054]取大腸桿菌感受態細胞100 μ I及連接產物5 μ I加入1.5ml離心管中，混勻后冰上放置3分鐘；42°C熱激90秒，置于冰上3分鐘~5分鐘；加入ImlLB液體培養基，于37°C下180r/min培養2小時；取100 μ I大腸桿菌涂皿，LB培養基中加入100 μ 120mg/ml的氨芐青霉素；37°C下培養16小時~24小時后觀察菌落，白色菌落為重組子；
[0055]第五步，陽性克隆檢測
[0056]隨機挑取上述白色菌落5個~10個，接種于加有ImlLB液體培養基的Eppendorf管中，于37°C下180r/min培養12小時；取I μ I菌液作模板用同一引物在相同反應條件下進行PCR擴增，將產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0057]第六步，ITS片段測序及分析，將回收純化后的產物測序，測序結果與GenBank中的核酸數據庫進行同源性比對。
[0058]本發明實施例的另一目的在于提供一種酵母菌生防菌劑的制備方法，該酵母菌生防菌劑的制備方法步驟如下:
[0059]步驟一、酵母4-4Α的富集培養；
[0060]步驟二、酵母4-4Α液體劑型的制備；
[0061]步驟三、酵母制劑中活菌數的測定。
[0062]進一步，酵母4-4Α的富集培養的方法如下:[0063]先采用NYDB液體培養基，將酵母菌株4-4Α活化后，取兩環接種于50ml種子培養基中，28°C培養24小時，取100 μ I種子液接入發酵培養基中，28°C下，200r/min搖床培養48小時；
[0064]發酵培養基按下述比例配制:牛肉膏8g/L，酵母浸膏5g/L，海藻糖10g/L，121°C,滅菌20分鐘。
[0065]進一步，酵母4-4A液體劑型的制備的方法如下:
[0066]將培養好的酵母發酵液裝入50ml離心管中，4000r/min離心15分鐘，倒掉上清液，用無菌水清洗兩次，所得的沉淀加入0.05mol/L的磷酸緩沖液制成菌懸液，使酵母的濃度為 lX109CFU/ml，備用；
[0067]選用蔗糖，半乳糖，海藻糖作為保護劑，用磷酸緩沖液配制溶液，溶液中Vc的濃度為 0.01% ；
[0068]取上述溶液各21.6ml，加入109CFU/ml的酵母母液2.4ml，混勻，分裝到1.5ml的離心管中，每管Iml，將每種保護劑所分裝的24管分為四組保存到_20°C，4°C，10°C，25°C中。
[0069]進一步，酵母制劑中活菌數的測定的方法如下:
[0070]制劑中初始的活菌數通過系列稀釋涂板確定，25°C保存的制劑每10天取一管測定活菌數，一 20°C，4°C，10°C每月取樣測定活菌數，統計制劑中酵母的存活率。
[0071]本發明提供的酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法，通過酵母菌分離、篩選，酵母4-4A的富集培養，酵母4-4A液體劑型的制備，酵母制劑中活菌數的測定制備的酵母菌液體生防菌劑，從開花期開始每月噴施一次可以有效減少芒果采后炭疽病的發生率，在初花期至采收期施用4次~6次防治芒果炭疽病，發病率和嚴重度分別下降了 64%~67%和89%~90%，另外，可以將生防酵母與低劑量的農藥配合使用，提高對病害的防治效果O
【專利附圖】
【附圖說明】
[0072]圖1是本發明實施例提供的酵母菌分離、篩選的方法的流程圖；[0073]圖2是本發明實施例提供的酵母菌生防菌劑的制備方法流程圖；
[0074]圖3是本發明實施例提供的海藻糖作為保護劑液體劑型中酵母的存活率示意圖；
[0075]圖4是本發明實施例提供的半乳糖作保護劑液體劑型中酵母的存活率示意圖；
[0076]圖5是本發明實施例提供的酵母在緩沖液和水中的存活率示意圖。
【具體實施方式】
[0077]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0078]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0079]如圖1所示，本發明實施例的酵母菌分離、篩選的方法包括以下步驟:
[0080]SlOl:通過酵母宏觀培養特征、酵母菌落形態觀察、假菌絲的形成、酵母菌子囊孢子的觀察、擲孢子鏡檢對酵母形態學鑒定；
[0081]S102:通過采用杜氏管發酵法、碳源同化采用液體培養法、氮源同化、接種于NYDA斜面35°C下生長情況、致死溫度和耐乙醇能力，對生長曲線測定，實現生理生化指標的測定;
[0082] S103:通過酵母菌4-4A總DNA的提取、rDNA-1TS區域PCR擴增、PCR產物回收純化、產物連接轉化、陽性克隆檢測、ITS片段測序及分析，實現ITS序列的分析。
[0083]本發明的具體步驟為:
[0084]步驟一、通過酵母宏觀培養特征、酵母菌落形態觀察、假菌絲的形成、酵母菌子囊孢子的觀察、擲孢子鏡檢對酵母形態學鑒定；
[0085]第一步，酵母宏觀培養特征
[0086]先將酵母菌接在NYDA斜面上，25°C培養2天~3天活化，然后取菌體I環接入含40ml NYDB液體培養基的100ml三角瓶中，25°C恒溫靜置培養3天；
[0087]第二步，酵母菌落形態觀察
[0088]將菌株活化培養2天~3天后，取一環接于NYDB培養基中，28°C振蕩培養24小時，稀釋后涂平板于NYDA固體培養基，28°C培養3天；
[0089]第三步，假菌絲的形成
[0090]將倒好的PDA平板倒置I天~2天使其表面干燥，用活化好的酵母劃線接種2條~3條，蓋上滅菌的蓋玻片，28°C下培養5天后取蓋玻片觀察劃線兩旁假菌絲形成情況及形態；
[0091]第四步，酵母菌子囊孢子的觀察
[0092]將已活化的酵母菌株接種至Goro&owa瓊脂培養基、豆芽汁葡萄糖培養基、PDA培養基，25°C培養3天，鏡檢子囊孢子形成情況，凡未見孢子的時間延長至4周~6周，每周檢查子囊孢子出現情況；
[0093]第五步，擲孢子鏡檢
[0094]將倒好的PDA平板放置2天，然后將酵母菌株沿垂直直徑方向劃線接種，倒置放于另一個PDA平板上，放置一個無菌載玻片，將緊扣的兩個培養皿置于25°C培養三周，取出載玻片觀察載玻片上的孢子。[0095]步驟二、通過采用杜氏管發酵法、碳源同化采用液體培養法、氮源同化、接種于NYDA斜面35°C下生長情況、致死溫度和耐乙醇能力，對生長曲線測定，實現生理生化指標的測定；
[0096]第一步，糖發酵
[0097]將需要測試的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8種糖用蒸餾水配成質量分數20%的母液，細菌過濾器過濾后放在4°C冰箱內備用；
[0098]采用杜氏管發酵法，取口徑12mm的試管，每管加入7.2ml黃豆芽汁，將杜氏管倒置于大試管中包扎后121°C滅菌20min備用；分別于每支試管內注入20%的糖母液0.8ml，并使小管內外的糖擴散均勻，再將酵母分別接種于含糖試管中，28°C靜置培養7天后觀察；凡不產氣的試管可延長培養至10天再觀察，杜氏管內有氣泡計為陽性，無氣泡計為陰性；
[0099]第二步，碳源同化
[0100]采用液體培養法，在含0.5%碳源的基礎培養基中，接入酵母種子液，濃度達到IO4個/ml，以加入葡萄糖的基礎培養液為對照，28°C振蕩培養，觀察生長情況；
[0101]第三步，氮源同化
[0102]挑取底部較平整的滅菌培養皿，取20ml無氮源固體基礎培養基熔化，冷卻到50°C后注入酵母菌懸液Iml搖勻；待培養基凝固后，28°C倒置5小時；然后添加氮源并在培養皿底部標記氮源名稱，28°C培養2天，觀察酵母菌的生長情況，接種前，酵母菌需在無氮源基礎培養基中進行饑餓培養；
[0103]第四步，35°C下生長情況
[0104]將活化的酵母菌株 劃線接種于NYDA斜面，35°C下培養3天~4天后觀察生長情況；
[0105]第五步，致死溫度
[0106]將NYDB液體培養基裝入口徑12mm的試管中，每管4ml ;再加入酵母菌液1ml，水浴加熱，溫度上升到預定值時計時IOmin ;28°C過夜后涂板確定酵母是否全部死亡；從30°〇開始，5°C為梯度遞增，直到酵母全部死亡的溫度，然后從上一個溫度以1°C遞增即可；
[0107]第六步，耐乙醇能力
[0108]按照表1向試管中加入NYDB液體培養基和無水乙醇，先加NYDB滅菌后再加無水乙醇；將酵母菌株的培養物稀釋后取Iml加入上述培養基中，28°C培養3-5d，在600nm下測定其OD值；
[0109]表1耐乙醇濃度測試
【權利要求】
1.一種酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，該酵母菌分離、篩選的方法包括以下步驟: 步驟一、通過酵母宏觀培養特征、酵母菌落形態觀察、假菌絲的形成、酵母菌子囊孢子的觀察、擲孢子鏡檢對酵母形態學鑒定； 步驟二、通過采用杜氏管發酵法、碳源同化采用液體培養法、氮源同化、接種于NYDA斜面35°C下生長情況、致死溫度和耐乙醇能力，對生長曲線測定，實現生理生化指標的測定；步驟三、通過酵母菌4-4A總DNA的提取、rDNA-1TS區域PCR擴增、PCR產物回收純化、產物連接轉化、陽性克隆檢測、ITS片段測序及分析，實現ITS序列的分析。
2.如權利要求1所述的酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，步驟一的具體方法如下: 第一步，酵母宏觀培養特征 先將酵母菌接在NYDA斜面上，25 °C培養2天~3天活化，然后取菌體I環接入含40mlNYDB液體培養基的100ml三角瓶中，25°C恒溫靜置培養3天； 第二步，酵母菌落形態觀察 將菌株活化培養2天~3天后，取一環接于NYDB培養基中，28°C振蕩培養24小時，稀釋后涂平板于NYDA固體培養基，28°C培養3天； 第三步，假菌絲的形成 將倒好的PDA平板倒置I天~2天使其表面干燥，用活化好的酵母劃線接種2條~3條，蓋上滅菌的蓋玻片，28°C下培養5天后取蓋玻片觀察劃線兩旁假菌絲形成情況及形態；第四步，酵母菌子囊孢子的觀察 將已活化的酵母菌株接種至Gorodkowa瓊脂培養基、豆芽汁葡萄糖培養基、PDA培養基，25°C培養3天，鏡檢子囊孢子形成情況，凡未見孢子的時間延長至4周~6周，每周檢查子囊孢子出現情況； 第五步，擲孢子鏡檢 將倒好的PDA平板放置2天，然后將酵母菌株沿垂直直徑方向劃線接種，倒置放于另一個PDA平板上，放置一個無菌載玻片，將緊扣的兩個培養皿置于25°C培養三周，取出載玻片觀察載玻片上的孢子。
3.如權利要求1所述的酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，在步驟二中，生理生化指標測定具體方法如下: 第一步，糖發酵 將需要測試的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8種糖用蒸餾水配成質量分數20%的母液，細菌過濾器過濾后放在4°C冰箱內備用； 采用杜氏管發酵法，取口徑12_的試管，每管加入7.2ml黃豆芽汁，將杜氏管倒置于大試管中包扎后121°C滅菌20min備用；分別于每支試管內注入20%的糖母液0.8ml，并使小管內外的糖擴散均勻，再將酵母分別接種于含糖試管中，28°C靜置培養7天后觀察；凡不產氣的試管可延長培養至10天再觀察，杜氏管內有氣泡計為陽性，無氣泡計為陰性； 第二步，碳源同化 采用液體培養法，在含0.5%碳源的基礎培養基中，接入酵母種子液，濃度達到IO4個/ml,以加入葡萄糖的基礎培養液為對照，28°C振蕩培養，觀察生長情況；第三步，氮源同化 挑取底部較平整的滅菌培養皿，取20ml無氮源固體基礎培養基熔化，冷卻到50°C后注入酵母菌懸液Iml搖勻；待培養基凝固后，28°C倒置5小時；然后添加氮源并在培養皿底部標記氮源名稱，28°C培養2天，觀察酵母菌的生長情況，接種前，酵母菌需在無氮源基礎培養基中進行饑餓培養； 第四步，35°C下生長情況 將活化的酵母菌株劃線接種于NYDA斜面，35°C下培養3天~4天后觀察生長情況； 第五步，致死溫度 將NYDB液體培養基裝入口徑12mm的試管中，每管4ml ;再加入酵母菌液1ml，水浴加熱，溫度上升到預定值時計時IOmin ;28°C過夜后涂板確定酵母是否全部死亡；從30°〇開始，5°C為梯度遞增，直到酵母全部死亡的溫度，然后從上一個溫度以1°C遞增即可； 第六步，耐乙醇能力 向試管中加入NYDB液體 培養基和無水乙醇，先加NYDB滅菌后再加無水乙醇；將酵母菌株的培養物稀釋后取Iml加入上述培養基中，28°C培養3天~5天，在600nm下測定OD值；第七步，生長曲線測定 采用NYDB液體培養基，將酵母菌株活化，取兩環接種于50ml種子培養基中，28°C培養24小時，取Iml種子液接入發酵培養基中，接入的體積比為50ml/250ml，28°C，200r/min搖床培養，每2小時取樣稀釋20倍后在600nm吸光度下測定其OD值，根據時間和菌液濃度繪制酵母的生長曲線圖。
4.如權利要求1所述的酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，在步驟三中，ITS序列分析的具體方法如下: 第一步，酵母菌4-4A總DNA的提取 使用TaKaRa的酵母基因組DNA提取試劑盒提取，取新鮮培養的含有I~2X108酵母菌的培養液至1.5ml離心管中，12000r/min離心Imin,除去上清，向沉淀中加入500 μ I的GenTLEYesatSolrtionA ;振蕩充分懸浮沉淀，于37°C溫浴I小時，期間振蕩，后加入 100 μ I 的 GenTLEYesatSolrtionB,振蕩后于 70°C 溫浴 IOmin ;加入 200 μ I 的GenTLEYesatSolrtionC ;振蕩后冰上冷卻5min, 12000r/min, 4°C離心5min,將上清移入新的離心管中，加入上清液1/2體積的異丙醇，混勻；12000r/min，4°C離心5min ;向沉淀中加Λ 500 μ I預冷的70%的乙醇，上下顛倒洗滌沉淀，12000r/min，4°C離心5min ;用移液器盡量除凈上清液，室溫下自然干燥，后加入40 μ ITEbuffer溶解基因組DNA ； 以DL2000為DNAMaker，上樣量4 μ 1，用1%瓊脂糖凝膠電泳40minl00V后檢測DNA ； 第二步，rDNA-1TS區域PCR擴增 PCR 擴 ±曾引 物 ITS 1: 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '；ITS4:5/ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';反應體系如下: PCR反應程序為:95°C預變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，反應共30個循環；72°C延伸10min，4°C保溫； 反應完成后，以DL2000為DNAMaker，上樣量5 μ 1，用1%瓊脂糖凝膠電泳40minl00V后檢測DNA ； 第三步，PCR產物回收純化，利用DNA回收試劑盒進行PCR產物純化，方法如下:1)切取含有目的片段的瓊脂糖凝膠后放入1.5mlEppendorf管； 2)加入400iUBufferGM，室溫15°C~25°C融化膠塊，振蕩混合，使膠徹底融化； 3)將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，將(2)中的溶液移至SpinColumn 中，12000r/min 離心 Imin ； 4)將收集管中的液體重新上柱,12000r/min室溫離心Imin； 5)將700 u I 的 BufferffB 加入 SpinColumn 中，室溫 12000r/min 離心 30s,棄濾液； 6)重復5)； 7)將SpinColumn 安置于 CollectionTube 上，室溫 12000r/min 離心 Imin ； 8)將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上,在SpinColumn的膜中央加入30 y I的滅菌水，室溫靜置Imin ； 9)12000r/min室溫離心Imin后收集離心管中的液體，即為回收的DNA片段，立即使用或保存于_20°C冰箱備用； 第四步，產物連接轉化，在0.5ml離心管中按以下連接體系加入各物質，混勻后在低溫水浴鍋中16 °C過夜連接； 取大腸桿菌感受態細胞100 u I及連接產物5 ill加入1.5ml離心管中，混勻后冰上放置3分鐘；42°C熱激90秒，置于冰上3分鐘~5分鐘；加入ImlLB液體培養基，于37°C下180r/min培養2小時；取100 U I大腸桿菌涂皿，LB培養基中加入100 u 120mg/ml的氨芐青霉素；37°C下培養16小時~24小時后觀察菌落，白色菌落為重組子； 第五步，陽性克隆檢測 隨機挑取上述白色菌落5個~10個，接種于加有ImlLB液體培養基的Eppendorf管中，于37°C下180r/min培養12小時；取I yl菌液作模板用同一引物在相同反應條件下進行PCR擴增，將產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測； 第六步，ITS片段測序及分析，將回收純化后的產物測序，測序結果與GenBank中的核酸數據庫進行同源性比對。
5.一種酵母菌生防菌劑的制備方法，其特征在于，該酵母菌生防菌劑的制備方法步驟如下: 步驟一、酵母4-4A的富集培養； 步驟二、酵母4-4A液體劑型的制備； 步驟三、酵母制劑中活菌數的測定。
6.如權利要求5所述的酵母菌生防菌劑的制備方法，其特征在于，酵母4-4A的富集培養的方法如下: 先采用NYDB液體培養基，將酵母菌株4-4A活化后，取兩環接種于50ml種子培養基中，28°C培養24小時，取100 ill種子液接入發酵培養基中，28°C下，200r/min搖床培養48小時； 發酵培養基按比例配制:牛肉膏8g/L，酵母浸膏5g/L，海藻糖10g/L，121°C，滅菌20分鐘。
7.如權利要求5所述的酵母菌生防菌劑的制備方法，其特征在于，酵母4-4A液體劑型的制備的方法如下: 將培養好的酵母發酵液裝入50ml離心管中，4000r/min離心15分鐘，倒掉上清液，用無菌水清洗兩次，所得的沉淀加入0.05mol/L的磷酸緩沖液制成菌懸液，使酵母的濃度為.lX109CFU/ml，備用； 選用蔗糖，半乳糖，海藻糖作為保護劑，用磷酸緩沖液配制溶液，溶液中Vc的濃度為.0.01% ； 取上述溶液各21.6ml，加入109CFU/ml的酵母母液2.4ml，混勻，分裝到1.5ml的離心管中，每管Iml，將每種保護劑所分裝的24管分為四組保存到_20°C，4°C，10°C，25°C中。
8.如權利要求5所述的酵母菌生防菌劑的制備方法，其特征在于，酵母制劑中活菌數的測定的方法如下: 制劑中初始的活菌數通過系列稀釋涂板確定，25°C保存的制劑每10天取一管測定活菌數，一 20°C，4°C，10 °C每月取樣測定活菌數，統計制劑中酵母的存活率。
【文檔編號】A01N63/04GK103740807SQ201310547291
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】蒲金基, 張賀, 陳照, 劉曉妹, 漆艷香, 張欣, 喻群芳, 陸英, 謝藝賢 申請人:中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所