專利名稱：一種小紅酵母及其分離培養方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種小紅酵母及其分離培養方法與應用。
背景技術：
小紅酵母是環境真菌，少數種類為致病菌，可引起免疫抑制患者系統性感染(Thanos L,Mylona S，Kokkinaki A,Pomoni M, Tsiouris S，Batakis N. Multifocalskeletal tuberculosis with Rhodotorula minuta co-infection. Scand J InfectDis. 2006; 38 (4) :309-11.)。人類甲真菌病是由致病性真菌引起的甲板和甲下組織的真菌感染。甲真菌病主要由表皮癬菌如紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等，少數由酵母菌及非皮膚癬菌的絲狀真菌引起。為一常見病，多發病。目前，臨床將甲真菌病分為5種類型淺表白甲型(superficial white onychomycosis)、遠端側位甲下型(distal and lateral subungual onychomycosis)、近端甲下型(proximal subungual onychomycosis)、甲內型(endonyx onychomycosis)和全甲毀損型(total distropic onychomycosis)。糖尿病、免疫受損患者及正常人群菌可發生此病。目前尚無文獻報道分離成功可引起人類甲真菌病的小紅酵母，以及對該類小紅酵母的流行病學和致病機制的深入研究。
發明內容
本發明的目的在于分離培養純化一株新的可致人類甲真菌病的小紅酵母(Rhodotorula minuta)菌株,并提供其分離培養純化方法，以及該菌株在篩選抗真菌藥物中的應用。本發明提供了一株小紅酵母(Rhodotorula minuta),已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jias :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 6019。該菌株是于2011年長征醫院皮膚科在一名15歲免疫正常女性患者甲真菌病病甲中分離所得，經ITS測序和API 20C酵母鑒定試劑盒證實為小紅酵母。本發明的小紅酵母(Rhodotorula minuta)菌株CGMCC No. 6019屬擔子菌門(Basidiomycota),擔抱目(Sporidiales),紅酵母屬(Rhodotorula)。I.形態特征病甲用10%K0H處理后于光鏡下可見小的、橢圓形酵母，3. 5-6. 5X3. 5 μ m。2.培養特征該菌可在麥芽浸出培養基(MEA ；0xoid, Basingstoke, UK)上25°C培養時表現為粉紅色、光滑菌落，邊界清楚。3.碳源利用可同化葡萄糖、蔗糖、甘油、琥珀酸鹽。尿素試驗陽性。
所述小紅酵母ITS1、5. 8S rDNA和ITS2區擴增測序方法采用真菌通用引物上游引物ITS5:5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);下游引物ITS4:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID N0:2 所示)。以基因組擴增，PCR反應體系 50μ L :10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物8yL，10umol/L引物各lul，模板2ul，Taq酶O. 5ul，無菌水32. 5 μ L。PCR擴增條件94°C預變性5分鐘，94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，70°C延伸2分鐘，30個循環；72°C保存10分鐘。所得擴增產物由ABI 3730DNA自動測序儀雙向測序兩次。測序結果如SEQID NO: 3所示；將測序結果于NCBI網站講行序列比對(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast, cgi),同小紅酵母CBS4407比同源性99%。本發明還提供了所述的小紅酵母的分離培養純化方法，該方法包括 小紅酵母接種于沙氏瓊脂培養基平板，25°C，第3天生長，得到小紅酵母菌落；該方法還包括培養和保存步驟從-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并適當搖動30s，打開凍存管，取I接種環菌液接入新鮮沙氏斜面培養基上；保存時將菌液涂布平板，48小時后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEH)液體培養基中_70°C凍存。所述的沙氏斜面培養基的組分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121。。10分鐘滅菌后備用；所述的酵母浸出膏蛋白胨(YEPD)液體培養基的組分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。本發明還提供了該菌株在篩選抗真菌藥物中的應用。所述的抗真菌藥物具體為抗人類甲真菌病藥物。參照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),該小紅酵母對兩性霉素b、氟胞喃唳、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的藥物敏感性進行測定。其MIC值分別為〈0.5、〈4、16、〈0. 125、〈 μ8/ιΛ。本發明的小紅酵母可用于篩選新的抗真菌藥物。
圖I是本發明小紅酵母的KOH鏡檢圖；圖2是本發明小紅酵母的甲病理圖(PAS染色)。微生物保藏信息小紅酵母(LWQ2010,),分類命名小紅酵母Rhodotorulaminuta，已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為 CGMCC No. 6019。
具體實施例方式現結合實施例和附圖，對本發明作進一步描述，但本發明的實施并不僅限于此。實施例I :小紅酵母(Rhodotorula minuta)菌株 CGMCC No. 6019
小紅酵母(LWQ2010,),分類命名小紅酵母Rhodotorula minuta,屬擔子菌門(Basidiomycota),擔抱目(Sporidiales),紅酵母屬(Rhodotorula)。本發明的菌株由上海長征醫院皮膚科于甲真菌病患者病甲中分離和檢測鑒定。于2012年4月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏登記號為 CGMCCN0. 6019。I.形態特征病甲用10%K0H處理后于光鏡下可見小的、橢圓形酵母，3. 5-6. 5X3. 5μπι，如圖I、圖2所示。2.培養特征該菌可在麥芽浸出培養基(MEA ；0xoid, Basingstoke, UK)上25°C培養時表現為粉 紅色、光滑菌落，邊界清楚。3.碳源利用試驗方法參見工具書廖萬清等主編《真菌病學》，人民衛生出版社，1989年。可同化葡萄糖、蔗糖、甘油、琥珀酸鹽。尿素試驗陽性。4.菌株的分離培養及保存技術本發明的小紅酵母的菌種分離純化技術包括小紅酵母接種于沙氏瓊脂培養基平板(25°C)，第3天生長，得到小紅酵母菌落。所述小紅酵母的斜面培養和保存技術包括從-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并適當搖動30s，打開凍存管，取I接種環菌液接入新鮮沙氏斜面培養基上。沙氏培養基配方葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121°C 10分鐘滅菌后備用。保存時將菌液涂布平板，48小時后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEro液體培養基中-70°c凍存。YEro液體培養基配方ι%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。5.真菌鑒定技術所述小紅酵母ITS1、5. 8S rDNA和ITS2區擴增測序方法采用真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);下游引物ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID NO:2 所示)。以基因組擴增，PCR反應體系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物8yL，10umol/L引物各lul，模板2ul，Taq酶0. 5ul，無菌水32. 5 μ L。PCR擴增條件94°C預變性5分鐘，94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，70°C延伸2分鐘，30個循環；72°C保存10分鐘。所得擴增產物由ABI 3730DNA自動測序儀雙向測序兩次。測序結果GGGATTTTGCGTCTGATGATTTGAGATCTAAGCTTAAGTGCTATAAAGCGCATTAGAAGCACCTCTTATATTTGAAGAAGACGTCCTTAGCGAAATAATTATTACGCCAAGTCAAACCGTCTATTTCAATAGGGTTGCTCGTGTATTTCAGTTGAGCCGGCAATTACGCCGACAGACAACCATAATCCAAGCCCACGCCCATTTCATTACAAAATAGGGGGGTTGAGAGTTTCATGATACTCAAACAGACATACTCTTCGGAATACCAAAGAGTGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTTTATTTTTGTTTATGCTCAATTAAGAGACTATTACATTCTTATACTAATGTGTTAAAAGTGTGTGTAAAAAGAAGTGTGTGCACAGTGTAAGAAAATGAAATGGTCGGACTTCTAAAAAGAACGTCCTAAAATTCATTAATGATCCTTCCGCAGGTTGACCTACGGAAACCT.(如 SEQ ID NO: 3 所示)；將測序結果于 NCBI 網站進行序歹丨J 比對(http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi ),同小紅酵母 CBS4407 比同源f生99%。實施例2 :真菌藥敏實驗參照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),該小紅酵母 對兩性霉素b、氟胞喃唳、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的藥物敏感性進行測定。其MIC值分別為〈O. 5、〈4、16、〈O. 125、〈1μ g/mL。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.一株小紅酵母(Rhodotorula minuta),保藏編號為 CGMCC No. 6019。
2.根據權利要求I所述的小紅酵母的分離培養純化方法，其特征在于，該方法包括 小紅酵母接種于沙氏瓊脂培養基平板，25°C，第3天生長，得到小紅酵母菌落。
3.根據權利要求I或2所述的小紅酵母的分離培養純化方法，其特征在于，該方法包括培養和保存步驟如下從-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并適當搖動30s，打開凍存管，取I接種環菌液接入沙氏斜面培養基上；保存時將菌液涂布平板，48小時后放入4°C冰箱保存或放入含有25%甘油的酵母浸出膏蛋白胨液體培養基中_70°C凍存； 所述的沙氏斜面培養基的組分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121 °C 10分鐘滅菌后備用； 所述的酵母浸出膏蛋白胨液體培養基的組分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
4.一種如權利要求I所述的小紅酵母在篩選抗真菌藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的小紅酵母在篩選抗真菌藥物中的應用，其特征在于，所述的抗真菌藥物為抗人類甲真菌病藥物。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種小紅酵母及其分離培養方法與應用。本發明的目的在于分離培養純化一株新的可致人類甲真菌病的小紅酵母菌株，本發明提供了一株小紅酵母(Rhodotorula minuta)，已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.6019。本發明對該菌株的形態特征、培養特征、碳源利用作了進一步研究。本發明還提供了該菌株的分離培養純化方法，以及在篩選抗真菌藥物中的應用。
文檔編號C12N1/02GK102864085SQ20121035182
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者廖萬清, 潘煒華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學