利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法
【專利摘要】本發明適用于酵母篩選【技術領域】，提供了一種利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，包括：選取產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區能源作物；將重金屬污染區能源作物提取總糖；以該總糖為原料配制成酵母培養液；利用重金屬含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對酵母菌進行篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株；利用產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對重金屬耐受性高的酵母菌株進一步篩選，獲得最優酵母。本發明還提供一種利用本發明的酵母篩選方法得到的酵母生產乙醇的方法。
【專利說明】利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于酵母篩選【技術領域】，尤其涉及一種利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法和生物乙醇的制備方法。
【背景技術】
[0002]能源和人類的活動息息相關，沒有了能源，人類社會的發展就無從談起，現代社會文明就無法繼續。生物燃料乙醇作為一種可再生的新型能源，因為無污染、用途廣，其重要性日益凸顯。目前，我國普遍采用木薯、甘蔗、甜高粱、農作物秸桿等非糧作物生產燃料乙醇，其中，甘蔗和木薯是經濟效益最顯著的非糧經濟作物。發展以甘蔗和木薯等能源作物作為原料生產乙醇，可以緩解“能源與人爭糧”的現象，但不可忽略的是，存在著“能源與糧爭地”的局面。
[0003]我國目前礦區累計破壞的土地面積達500萬公頃，復墾率僅為12%，受礦山污染的耕地面積達2000萬公頃，約占耕地面積的1/6。這些土壤不適于種植糧食作物，但經改良后種植非食用性的能源作物——能源甘蔗、能源木薯、能源薯蕷卻有極大的可行性。大面積存在的礦區重金屬污染土壤和邊緣化土壤，為發展燃料乙醇等生物質能源提供了大量可利用的土地資源。對礦區重金屬污染土壤合理利用，是打破“能源與糧爭地”局面最有效的措施。
[0004]酵母菌種是乙醇發酵的核心所在，因此酵母菌種的篩選研究就尤其重要，目前對酵母菌的篩選方法有:
[0005](I)誘變篩選法。這是通過傳統誘變技術處理酵母的原始菌株，對誘變后的菌株進行篩選目的菌株。
[0006](2)細胞融合法。主要是利用原生質體融合技術，該技術可克服細胞壁的天然屏障，排除接合型的限制，實現多基因重組，并且可以直接采用生產性能好的菌株作為親株。原生質體融合技術是國內外選育優良酵母比較常用的研究方法，如日本三井造船株式會社選育酵母菌株AM12。
[0007](3)基因工程技術。目前，該技術成為世界研究的熱點，主要包括基因工程改造法，外源基因導入構建工程菌，基因敲除技術等。袁振宏等(2006)采用基因導入的方法，將樹干畢赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖醇脫氫酶基因xyl2,及休哈塔假絲酵母(CandidaShehatae)木糖還原酶基因xyll轉入釀酒酵母(S.cerevisiae),構建成木糖發酵的釀酒酵母重組工程菌。史文慧等(2002)和趙麗娟等(2005)通過基因敲除技術，使酵母ADH2基因失活，不利用乙醇做碳源，提高乙醇利用率。
[0008]上述酵母篩選方法均利用復雜的技術和設備實現，操作成本高，因此開發簡便易行的且具有針對性的酵母篩選方法將有重要意義。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法。
[0010]本發明的另一目的在于提供一種生物乙醇的制備方法。
[0011]為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下:
[0012]選取產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區能源作物；
[0013]利用該重金屬污染區能源作物提取總糖；
[0014]以提取的總糖為原料配制成酵母培養液；
[0015]利用重金屬含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對待篩選的酵母菌進行重金屬耐受性篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株；
[0016]利用產量、總 糖含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對重金屬耐受性高的酵母菌株進一步篩選，選取發酵效率最高的酵母菌種，該發酵效率通過發酵液中糖轉化率和乙醇含量體現。
[0017]以及，一種生物乙醇的制備方法，包括采用酵母對重金屬污染區能源作物發酵獲取乙醇的步驟，其中，所述酵母是經上述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法獲得。
[0018]本發明的篩選酵母方法利用生長于重金屬污染區的能源作物對酵母菌進行篩選，該方法充分利用了生長于重金屬污染區的能源作物，該方法篩選出的酵母菌可將作物中的糖分充分轉化為乙醇，有利于恢復重金屬污染土地的生態恢復并促進燃料乙醇的生產，該篩選方法操作簡便，成本低，針對性強。
[0019]本發明的生物乙醇的制備方法，能充分利用重金屬污染區作物，且其中使用的酵母具有較強針對性，該制備方法具有高的乙醇轉化率，實現了資源的優化配置。
【具體實施方式】
[0020]為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0021]本發明實施例提供一種利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，包括以下步驟:
[0022](I)選取產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區能源作物；
[0023](2)利用步驟(I)的所述兩類重金屬污染區能源作物提取總糖；
[0024](3)以提取的所述總糖為原料配制成酵母培養液；
[0025](4)利用步驟所述重金屬含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對待篩選的酵母菌進行重金屬耐受性篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株；
[0026](5)利用所述產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對步驟(4)中篩選出的重金屬耐受性高的酵母菌株進一步篩選，選取發酵效率最高的酵母菌種，所述發酵效率通過發酵液中糖轉化率和乙醇含量體現。
[0027]具體地，在步驟(I)中的重金屬污染區可以為礦山污染土壤，也可以為邊際化土壤，該能源作物為甘蔗、木薯或薯蕷。
[0028]在步驟(I)中，當能源作物為甘蔗時，甘蔗選取的方法如下:[0029]用游標卡尺和直尺量取甘蔗植株的直徑和株高；提取甘蔗汁，采用錘度計直接測定甘蔗汁錘度，采用旋光儀測定經澄清過濾后的蔗汁的轉光度；上述指標為甘蔗的生理指標，可以用來衡量甘蔗的產量。同時利用DNS還原法測定甘蔗汁中總糖含量。采用現有重金屬含量測定方法測定蔗渣和蔗汁中總重金屬含量，測量的該重金屬為鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)。
[0030]當能源作物為木薯或薯蕷時，其選取的方法如下:
[0031]測量木薯或薯蕷的塊莖重量；在將木薯或薯蕷液化糖化后用DNS法測量總糖。DNS即二硝基水楊酸，該測量方法是利用堿性條件下，二硝基水楊酸(DNS)與還原糖發生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內顏色深淺與還原糖含量成比例關系的原理，用比色法測定還原糖含量。因其顯色的深淺只與糖類游離出還原基團的數量有關，而對還原糖的種類沒有選擇性，故DNS方法適合用在多糖(如纖維素、半纖維素和淀粉等)水解產生的多種還原糖體系中。采用現有重金屬含量測定方法測定木薯或薯蕷塊莖中總重金屬含量，測量的該重金屬為鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)。
[0032]在所述能源作物為甘蔗時，步驟(2)中提取總糖的方法為取甘蔗榨汁，總糖包含于該甘蔗汁中；在所述能源作物為木薯或薯蕷時，取木薯或薯蕷的塊莖粉碎，加入水中高溫糊化，然后加入糖化酶糖化，所得溶液含有總糖。
[0033]在步驟(3)中，當該重金屬污染區能源作物為甘蔗時，該酵母培養液的配制方法為:提取后的甘蔗汁為含有總糖的溶液，向該甘蔗汁中加入其體積0.1-0.2%的尿素，用磷酸把pH調至3.3-3.6，90°C滅菌1-1.5h。
[0034]當該重金屬污染區能源作物為木薯或薯蕷時，該酵母培養液的配制方法為:將木薯或薯蕷淀粉液化糖化，制得含有總糖的溶液，向該溶液中加入0.25-0.5%的尿素，用磷酸把 pH 調至 4.5-5.0，90°C滅菌 `1-1.5h。
[0035]在步驟(4)中的酵母菌重金屬耐受性試驗為選取5株以上的工業酵母菌，該酵母可應用任何適用于發酵的菌株，在具體實施例中可使用薛瓦酵母(S.chevalieri)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、威爾酵母(S.wiIIianus)等，但不限于上述酵母。以步驟(I)中的重金屬含量最高的作物提取的總糖提取物進行培養篩選，該總糖提取物中含有鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)等重金屬，通過糖轉化率和乙醇產量選取耐受性高的3-5株菌株。
[0036]該步驟(4)中，將篩選得到的耐受性高的3-5酵母菌株分別接種至酵母培養液中的接種量為5-10%，優選的接種量為10%。
[0037]本發明的篩選酵母方法利用生長于重金屬污染區的能源作物對酵母菌進行篩選，該方法充分利用了生長于重金屬污染區的能源作物，該方法篩選出的酵母菌可將作物中的糖分充分轉化為乙醇，有利于恢復重金屬污染土地的生態恢復并促進燃料乙醇的生產，該篩選方法操作簡便，成本低，針對性強。
[0038]本發明實施例還提供了一種生物乙醇的制備方法，包括提取能源作物的總糖獲得溶液，向該溶液中加入酵母進行發酵，獲得乙醇，其中，所述酵母是經上文所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法獲得。
[0039]本發明實施例的生物乙醇的制備方法，能充分利用重金屬污染區作物，且其中使用的酵母具有較強針對性，該制備方法具有高的乙醇轉化率，實現了資源的優化配置。[0040]以下結合具體實施例對本發明進行詳細描述。
[0041]實施例1甘蔗相關指標檢測
[0042]1.植株產量及含糖量檢測
[0043]在礦山污染土壤中，種植耐受重金屬、高光合量和高生物量的甘蔗品種。種植一年后計算五米行長甘蔗數及10株甘蔗重量，分別用游標卡尺和直尺量取甘蔗樣品的直徑和株高，每個樣品取十個重復。以此分析比較甘蔗產量。
[0044]采用錘度計直接測定蔗汁錘度；采用旋光儀測定經澄清過濾后的蔗汁的轉光度；采用分光光度法測定蔗汁糖分:在酸性介質中，蔗糖將磷鑰黃還原成磷鑰藍，磷鑰藍最大吸收波長為820nm，利用比色法可測定甘蔗中的蔗糖含量；利用還原糖與DNS的顯色反應在520nm測定吸光值，由還原糖的量與光吸收值呈線性關系，利用比色法可測定甘蔗中的還原 糖含糖量。
[0045]2.蔗汁重金屬含量測定
[0046]取200mL燒杯，經稀硝酸浸泡過夜，并用雙蒸水沖洗干凈,量取甘蔗汁樣品IOmL加入該燒杯中。加入硝酸30mL，混合均勻，蓋上表面皿，過夜。在通風櫥中，往燒杯中加入IOmL高氯酸，然后放在電熱板上加熱，110°C，煮到澄清透明直到剩余f2mL，冷卻，加水定容到50mL。以原子吸收分光光度計(YXF-1201型)上分別檢測溶液中鋅(Zn)、銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)的含量。
[0047]3.蔗渣重金屬含量測定
[0048]準確稱取1.0Og磨碎甘蔗樣品于瓷坩堝中加熱，先在電爐上炭化完全后，放入馬福爐內(600°C)灰化(6h)。冷卻后取出，加入5mL2mol/L的HCl溶液溶解，然后轉移至50mL容量瓶中，用去離子水(或雙蒸水)沖洗坩堝，將洗液轉移至該容量瓶中，然后定容至50mL。用定量濾紙過濾后，取濾液在原子吸收分光光度計(YXF-1201型)上分別檢測溶液中鋅(Zn) JIf(Cu)Jg(Cd)Jg(Pb)的含量。
[0049]4.甘蔗汁總糖的測定
[0050]取甘蔗汁樣品5mL加入錐形瓶中，再向錐形瓶中加入6mol/L HCl溶液15mL，置沸水浴中加熱30min，冷卻后用NaOH溶液調節pH值至中性。加去離子水定容至50mL，然后過濾。吸取ImL濾液，加去離子水定容至50mL，得稀釋溶液，備用。
[0051]取上述稀釋溶液0.5mL加入試管中，再加入二硝基水楊酸(DNS)溶液0.5mL,該濃度為本領域技術人員熟知，在沸水浴中加熱5min，冷卻后再加入蒸餾水4mL。將混合均勻，用制作標準曲線的空白管(I號管)溶液調零點，測定它們在540nm的吸光值，從標準曲線上查出其相應的含糖量(μ g)。標準曲線制作過程為本領域技術人員熟知，在此不再贅述。
[0052]5.測量結果
[0053]測量結果如表1-4所示。
[0054]表1:不同甘鹿品種的產量
【權利要求】
1.一種利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，包括以下步驟: 選取產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物和重金屬含量高的重金屬污染區能源作物； 利用所述重金屬污染區能源作物提取總糖； 以提取的所述總糖為原料配制成酵母培養液； 利用所述重金屬含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對待篩選的酵母菌進行重金屬耐受性篩選，選取3-6株重金屬耐受性高的酵母菌株； 利用所述產量、總糖含量高的重金屬污染區能源作物對應的酵母培養液對所述重金屬耐受性高的酵母菌株進一步篩選，選取發酵效率最高的酵母菌種，所述發酵效率通過發酵液中糖轉化率和乙醇含量體現。
2.如權利要求1所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述耐受性高的酵母菌株分別接種至所述酵母培養液中的接種量為5%-10%。
3.如權利要求1所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區能源作物為甘蔗、木薯或薯蕷。
4.如權利要求3所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區能源作物為甘蔗，所述酵母培養液的配制方法:向含有所述總糖的甘蔗汁中加入所述甘蔗汁0.1-0.2%的尿素，并將pH調至3.3-3.6，90°C滅菌1-1.5h。
5.如權利要求3所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區能源作物為木薯或薯蕷，所述酵母培養液的配制方法:將所述木薯或薯蕷的總糖提取物糖化，再向糖化后的溶液中加入所述溶液0.25-0.5%的尿素，并將pH調至4.5-5.00
6.如權利要求1所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬耐受性試驗中的重金屬為鋅、銅、鎘和鉛。
7.如權利要求1所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法，其特征在于，所述重金屬污染區為礦山污染土壤區或邊際化土壤區。
8.—種生物乙醇的制備方法，其特征在于，包括采用酵母對重金屬污染區能源作物發酵獲取乙醇的步驟，其中，所述酵母是經權利要求1-7中任一項所述的利用重金屬污染區能源作物篩選酵母方法獲得。
【文檔編號】C12N1/16GK103451143SQ201310041520
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年2月1日 優先權日:2013年2月1日
【發明者】朱睿, 謝君, 劉艷霖 申請人:深圳信息職業技術學院