控制害蟲的方法

控制害蟲的方法
【專利摘要】本發明涉及一種控制二點委夜蛾害蟲的方法，包括：將二點委夜蛾害蟲與Cry1A.105蛋白接觸。本發明通過植物體內產生能夠殺死二點委夜蛾的Cry1A.105蛋白來控制二點委夜蛾害蟲。與現有技術使用的農業防治方法和化學防治方法相比，本發明對植物進行全生育期、全植株的保護以防治二點委夜蛾害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩定、徹底，簡單、方便、經濟。
【專利說明】控制害蟲的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種控制害蟲的方法，特別是涉及一種用在植物中表達的CrylA.105蛋白來控制二點委夜蛾危害植物的方法。
【背景技術】
[0002]二點委夜蛾(Athetis I印igone)屬鱗翅目夜蛾科，為雜食性害蟲，目前發現其主要危害玉米作物，主要分布于我國黃淮海夏玉米種植區，在境外主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯、歐洲等地。二點委夜蛾主要在玉米氣生根處的土壤表層處危害玉米根部，咬斷玉米地上莖桿或淺表層根，受危害的玉米田輕者玉米植株東倒西歪，重者造成缺苗斷壟，玉米田中出現大面積空白地，危害嚴重地塊甚至毀種。
[0003]玉米是中國主要的糧食作物，2011年7月9日，中央電視臺新聞聯播首次報道二點委夜蛾在中國的發生情況，2011年秋季至2012年5月31日，國家玉米產業體系病蟲防控研究室通過多次田間調查，發現2012年度二點委夜蛾的越冬種群數量較大，蟲口基數偏高，一代幼蟲種群密度大，在黃淮海夏玉米苗期有繼續暴發為害的可能。為了防治二點委夜蛾，人們目前主要采用的防治方法有:農業防治和化學防治。
[0004]農業防治是對整個農田生態系統中多個因素的綜合協調管理，調控作物、害蟲、環境因素、創造一個有利于作物生長而不利于二點委夜蛾發生的農田生態環境，如及時清除玉米苗基部麥秸、雜草等覆蓋物至遠離植株的玉米大行間并裸露出地面，以便于后續用藥劑能直接接觸到二點委夜蛾。因農業防治必須服從作物布局和增產的要求，應用有一定的局限性，不能作為 應急措施，在二點委夜蛾爆發時就顯得無能為力。
[0005]化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是二點委夜蛾綜合治理的重要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是二點委夜蛾大發生的情況下，是必不可少的應急措施，它可以一定程度地在二點委夜蛾造成危害前降低蟲口密度。目前化學防治方法主要有毒餌法、毒土法、灌藥法和噴施農藥等。但化學防治也有其局限性，如使用不當往往會導致農作物發生藥害、害蟲產生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環境，使農田生態系統遭到破壞和農藥殘留對人、畜的安全構成威脅等不良后果；且因二點委夜蛾喜潮濕、陰暗環境，一般躲藏于麥秸等覆蓋物或者土表之下，使得化學農藥很難直接接觸二點委夜蛾蟲體而使得防治效果不佳。
[0006]為了解決農業防治和化學防治在實際應用中的局限性，科學家們經過研究發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。CrylA.105殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki, B.t.k.)產生的伴抱結晶蛋白。
[0007]CrylA.105蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。[0008]已證明轉CrylA.105基因的植株可以抵抗玉米螟、棉鈴蟲、小地老虎等鱗翅目(Lepidoptera)害蟲的侵害,然而,至今尚無關于通過產生表達CrylA.105蛋白的轉基因植株來控制二點委夜蛾對植物危害的報道。

【發明內容】

[0009]本發明的目的是提供一種控制害蟲的方法，首次提供了通過產生表達CrylA.105蛋白的轉基因植株來控制二點委夜蛾對植物危害的方法，且有效克服現有技術農業防治和化學防治等技術缺陷。
[0010]為實現上述目的，本發明提供了一種控制二點委夜蛾害蟲的方法，包括將二點委夜蛾害蟲與CrylA.105蛋白接觸。
[0011]進一步地,所述CrylA.105蛋白存在于產生所述CrylA.105蛋白的植物細胞中,所述二點委夜蛾害蟲通過攝食所述植物細胞與所述CrylA.105蛋白接觸。
[0012]更進一步地，所述CrylA.105蛋白存在于產生所述CrylA.105蛋白的轉基因植物中，所述二點委夜蛾害蟲通過攝食所述轉基因植物的組織與所述CrylA.105蛋白接觸，接觸后所述二點委夜蛾害蟲生長受到抑制并最終導致死亡，以實現對二點委夜蛾危害植物的控制。[0013]所述轉基因植物可以處于任意生育期。
[0014]所述轉基因植物的組織可以為根、葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0015]所述對二點委夜蛾危害植物的控制不因種植地點的改變而改變。
[0016]所述對二點委夜蛾危害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
[0017]所述植物可以為玉米。
[0018]所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylA.105蛋白的多核苷酸的植物。
[0019]優選地，所述CrylA.105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述CrylA.105蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0020]在上述技術方案的基礎上，所述植物還可以產生至少一種不同于所述CrylA.105蛋白的第二種核苷酸。
[0021]進一步地,所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過氧化物酶。
[0022]優選地,所述第二種核苷酸可以編碼Cry2Ab蛋白或Vip3A蛋白。
[0023]更進一步地，所述第二種核苷酸包括SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
[0024]可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0025]為實現上述目的，本發明還提供了一種CrylA.105蛋白質控制二點委夜蛾害蟲的用途。
[0026]在本發明中，CrylA.105蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達CrylA.105蛋白質，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0027] RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此在本發明中可以使用RNAi技術特異性剔除或關閉目標昆蟲害蟲中特定基因的表達。
[0028]二點委夜蛾(Athetis Iepigone)與小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg)同屬鱗翅目夜蛾科，盡管其侵害部位和形態上相近，但是二點委夜蛾與小地老虎在生物學上是清晰的、截然不同的兩個物種，至少存在以下主要區別:
[0029]1、食性不同。二點委夜蛾除嚴重威脅夏玉米外，還對花生和大豆也造成危害；而小地老虎為雜食性害蟲，是對農、林木幼苗危害很大的地下害蟲，除了危害玉米、高粱、粟等作物外，在東北主要危害落葉松、紅松、水曲柳、核桃楸等苗木，在南方危害馬尾松、杉木、桑、茶等苗木，在西北危害油松、沙棗、果樹等苗木。
[0030]2、分布區域不同。目前二點委夜蛾主要在黃淮海夏玉米區的河北、山東、河南、山西、江蘇、安徽共6省47個地(市)297個縣(市、區)暴發危害；而小地老虎在我國以雨量豐富、氣候濕潤的長江流域和東南沿海發生量大，東北地區多發生在東部和南部濕潤地區。
[0031]3、為害習性不同。二點委夜蛾在河北省部分夏玉米，尤其以小麥套播的玉米田發生重，主要以幼蟲躲在玉米幼苗周圍的碎麥秸下或在2-5厘米的表土層危害玉米苗，一般一株有蟲1-2頭，多的達10-20頭；在玉米幼苗3-5葉期的地塊，幼蟲主要咬食玉米莖基部，形成3-4毫米圓形或橢圓形孔洞，切斷營養輸送，造成地上部玉米心葉萎蔫枯死；在玉米苗較大(8-10葉期)的地塊幼蟲主要咬斷玉米根部，包括氣生根和主根，造成玉米倒伏，嚴重者枯死。危害株率一般在1%_5%，嚴重地塊達15%-20%。而小地老虎1-2齡幼蟲晝夜均可群集于幼苗頂心嫩葉處取食危害；3齡后分散，幼蟲行動敏捷、有假死習性、對光線極為敏感、受到驚擾即卷縮成團，白天潛伏于表土的干濕層之間，夜晚出土從地面將幼苗植株咬斷拖入土穴、或咬食未出土的種子，幼苗主莖硬化后改食嫩葉和葉片及生長點，食物不足或尋找越冬場所時，有遷移現象。
[0032]4、形態特征不同。
[0033]I)卵的形態不同:二點委夜蛾的卵成饅頭狀，上有縱脊，初產黃綠色，后土黃色；而小地老虎的卵亦成饅頭形，具縱橫隆線，初產乳白色，漸變黃色，孵化前卵一頂端具黑點。
[0034]2)幼蟲的形態不同:二點委夜蛾的老熟幼蟲體長20mm左右，體色灰黃色，頭部褐色，幼蟲14-18mm長，黃灰色或黑褐色，比較明顯的特征是個體節有一個倒三角的深褐色斑紋，腹部背面有兩條褐色背側線，到胸節消失；而小地老虎幼蟲圓筒形，老熟幼蟲體長37-50_，頭部褐色，具黑褐色不規則網紋，體灰褐至暗褐色，體表粗糙、布大小不一而彼此分離的顆粒，背線、亞背線及氣門線均黑褐色，前胸背板暗褐色，黃褐色臀板上具兩條明顯的深褐色縱帶，胸足與腹足黃褐色。
[0035]3)蛹的形態不同:二點委夜蛾的蛹長IOmm左右，化蛹初期淡黃褐色，逐漸變為褐色，老熟幼蟲入土做一絲質土苗包被內化蛹；而小地老虎的蛹長18-24mm,赤褐有光，口器與翅芽末端相齊，均伸達第4腹節后緣，腹部第4-7節背面前緣中央深褐色，且有粗大的刻點，兩側的細小刻點延伸至氣門附近，第5-7節腹面前緣也有細小刻點，腹末端具短臀棘I對。[0036]4)成蟲的形態不同:二點委夜蛾成蟲體長10_12mm，翅展20mm，雌蟲會略大于雄蟲，頭、胸、腹灰褐色，前翅灰褐色，有暗褐色細點，內線、外線暗褐色，環紋為一黑點，腎紋小，有黑點組成的邊緣，外側中凹，有一白點，外線波浪型，翅外緣有一列黑點，后翅白色微褐，端區暗褐色，腹部灰褐色，雄蛾外生殖器的抱器瓣端半部寬，背緣凹，中部有一鉤狀突起，陽莖內有刺狀陽莖針；而小地老虎成蟲體長17-23_、翅展40-54_，頭、胸部背面暗褐色，足褐色，前足脛、跗節外緣灰褐色，中后足各節末端有灰褐色環紋，前翅褐色，前緣區黑褐色，外緣以內多暗褐色，基線淺褐色，黑色波浪形內橫線雙線，黑色環紋內有一圓灰斑，腎狀紋黑色具黑邊、其外中部有一楔形黑紋伸至外橫線，中橫線暗褐色波浪形，雙線波浪形外橫線褐色，不規則鋸齒形亞外緣線灰色、其內緣在中脈間有三個尖齒，亞外緣線與外橫線間在各脈上有小黑點，外緣線黑色，外橫線與亞外緣線間淡褐色，亞外緣線以外黑褐色，后翅灰白色，縱脈及緣線褐色，腹部背面灰色。
[0037]5、生長習性和發生規律不同。二點委夜蛾幼蟲一共6齡，幼蟲期約18天，幼蟲的抗逆性較強；二點委夜蛾成蟲有兩個明顯的蛾峰:7月初前出現第I個蛾峰，7月中下旬到8月上中旬出現第2個蛾峰；成蟲具有較強的生殖能力:平均單雌產卵量可達300-500粒，產卵可持續3-7天，而卵的孵化率接近100% ;棉田倒茬玉米田比重茬玉米田發生嚴重，麥糠麥秸覆蓋面積大比沒有麥秸麥糠覆蓋的嚴重，播種時間晚比播種時間早的嚴重，田間濕度大比濕度小的嚴重，二點委夜蛾喜陰濕環境，往往躲藏在麥秸或土中，給噴施農藥造成了極大的不便。而小地老虎一年發生3-4代，老熟幼蟲或蛹在土內越冬；早春3月上旬成蟲開始出現，一般在3月中下旬和4月上中旬會出現兩個發蛾盛期；成蟲白天不活動，傍晚至前半夜活動最盛，喜歡吃酸、甜、酒味的發酵物和各種花蜜，并有趨光性，幼蟲共分6齡，1、2齡幼蟲先躲伏在雜革或植株的心葉里，晝夜取食，這時食量很小，為害也不十分顯著；3齡后白天躲到表土下，夜間出來為害；5、6齡幼蟲食量大增，每條幼蟲一夜能咬斷菜苗4-5株，多的達10株以上；幼蟲3齡后對藥劑的抵抗力顯著增加；3月底到4月中旬是第I代幼蟲危害的嚴重時期；發生世代從10月到第2年4月都見發生和危害；西北地區二到三代，長城以北一般年二到三代，長城以南黃河以北年三代，黃河以南至長江沿岸年四代，長江以南年四到五代，南亞熱帶地區年六至七代；無論年發生代數多少，在生產上造成嚴重危害的均為第一代幼蟲；南方越冬代成蟲二月份出現，全國大部分地區羽化盛期在3月下旬至4月上、中旬，寧夏、內蒙古為4月下旬；小地老虎成蟲多在下午3時至晚上10時羽化，白天潛伏于雜物及縫隙等處，黃昏后開始飛翔、覓食，3-4天后交配、產卵；卵散產于低矮葉密的雜草和幼苗上、少數產于枯葉、土縫中，近地面處落卵最多，每雌產卵800-1000粒、多達2000粒；卵期約5天左右，幼蟲6齡、個別7-8齡，幼蟲期在各地相差很大，但第一代約為30-40天；幼蟲老熟后在深約5cm土室中化蛹，蛹期約9-19天；高溫對小地老虎的發育與繁殖不利，因而夏季發生數量較少，適宜生存溫度為15°C _25°C;冬季溫度過低，小地老虎幼蟲的死亡率增高；凡地勢低濕，雨量充沛的地方，發生較多；頭年秋雨多、土壤濕度大、雜草叢生有利于成蟲產卵和幼蟲取食活動，是第二年大發生的預兆；但降水過多，濕度過大，不利于幼蟲發育，初齡幼蟲淹水后很易死亡；成蟲產卵盛期土壤含水量在15-20%的地區危害較重；沙壤土，易透水、排水迅速，適于小地老虎繁殖，而重黏土和沙土則發生較輕。
[0038]綜合上述，可確定二點委夜蛾與小地老虎是兩種害蟲，且親緣關系較遠，無法交配產生后代。[0039]本發明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內的任何遺傳物質，且包括細胞核和質體和線粒體基因組。
[0040]本發明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質或多肽。本領域技術人員很容易認識到，可以將本發明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調控序列控制下。[0041]本領域技術人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復制產生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本發明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結合的鏈。為了在體內表達蛋白質，典型將DNA的一條鏈轉錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質或肽。本發明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0042]本發明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發明CrylA.105基因雜交。任何常規的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發明CrylA.105基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結構，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，貝1J稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在至少常規的“低度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在常規的“高度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結構。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩定的雙鏈結構。
[0043]本發明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.0XSSC洗滌，這些條件對本領域技術人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0父55(:、501:到高度嚴格條件的約0.2\55(:、501:。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發生改變。優選地，本發明所述嚴格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID N0:2發生特異性雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0044]因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發明SEQ ID N0:2雜交的序列包括在本發明中。這些序列與本發明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0045]本發明中所述的基因和蛋白質不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質相比在內和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質)、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗二點委夜蛾害蟲的生物活性的蛋白。
[0046]本發明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質為昆蟲毒素。
[0047]使用標準技術可以修飾基因和容易的構建基因變異體。例如，本領域熟知制造點突變的技術。又例如美國專利號5605793描述了在隨機斷裂后使用DNA重裝配產生其它分子多樣性的方法。可以使用商業化核酸內切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標準程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變從這些基因的末端系統地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內切酶獲取編碼活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接獲得這些毒素的活性片段。
[0048]本發明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價蛋白和/或編碼這些等價蛋白的基因。有多種方法獲取本發明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發明公開和要求保護的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價蛋白。可使用本領域標準程序容易的制備本發明中公開的蛋白或等價蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。
[0049]由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領域技術人員的技術水平內。這些不同的DNA序列包括在本發明的范圍內。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。
[0050]本發明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規技術，優選這種氨基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0051]保守取代的實例是在下列氨基酸組內發生的取代:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領域內是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hi 11在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0052]對于本領域的技術人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區域之外發生，而且仍產生活性多肽。對于由本發明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244: 1081-1085)。后一技術是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結構的分析來測定，這種三維結構可由核磁共振分析、結晶學或光親和標記等技術測定(參見，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ;Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899-904 ；fflodaver 等，1992，FEBSLetters309:59_64)。
[0053]在本發明中，CrylA.105蛋白包括但不限于CrylA.105蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且對二點委夜蛾具有殺蟲活性的殺蟲片段或功能區域。 [0054]因此，與序列I所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發明中。這些序列與本發明序列類似性/相同性典型的大于60%，優選的大于75%，更優選的大于80%，甚至更優選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發明的優選的多核苷酸和蛋白質。例如與本發明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0055]本發明中所述調控序列包括但不限于啟動子、轉運肽、終止子，增強子，前導序列，內含子以及其它可操作地連接到所述CrylA.105蛋白的調節序列。
[0056]所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導植物內組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內如在綠色組織中指導編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創傷誘導啟動子。創傷誘導啟動子或指導創傷誘導的表達模式的啟動子是指當植物經受機械或由昆蟲啃食引起的創傷時，啟動子調控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創傷誘導啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0057]所述轉運肽(又稱分泌信號序列或導向序列)是指導轉基因產物到特定的細胞器或細胞區室，對受體蛋白質來說，所述轉運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內質網，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0058]所述前導序列包含但不限于，小RNA病毒前導序列，如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區)；馬鈴薯Y病毒組前導序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導序列；人類免疫球蛋白質重鏈結合蛋白質(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導序列。
[0059]所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風化環病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。[0060]對于單子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，玉米hsp70內含子、玉米泛素內含子、Adh內含子1、蔗糖合酶內含子或水稻Actl內含子。對于雙子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，CAT-1內含子、pKANNIBAL內含子、PIV2內含子和“超級泛素”內含子。
[0061]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于a -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0062]本發明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯結，所述聯結使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉錄受到該啟動子控制和調控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉錄物融合并且想要實現編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結，并且連接方式使得得到的翻譯產物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關系是符合讀碼框的。可以“有效連 接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區域、內含子、蛋白編碼區域、3’非翻譯區域、聚腺苷化位點和/或轉錄終止子)、提供DNA轉移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內協助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。
[0063]本發明中所述的“殺蟲”是指對農作物害蟲是有毒的。更具體地，目標昆蟲是二點委夜蛾害蟲。
[0064]本發明中CrylA.105蛋白對二點委夜蛾害蟲具有毒性。本發明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼CrylA.105蛋白的核苷酸序列，二點委夜蛾害蟲通過攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后二點委夜蛾害蟲生長受到抑制并最終導致死亡。抑制是指致死或亞致死。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方法下培養以用于產物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學或生物殺蟲劑的需要(所述化學或生物殺蟲劑為針對CrylA.105蛋白所靶向的二點委夜蛾害蟲的殺蟲劑)。
[0065]植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達水平可通過本領域內所描述的多種方法進行檢測，例如通過應用特異引物對組織內產生的編碼殺蟲蛋白質的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產生的殺蟲蛋白質的量。
[0066]可以應用不同的試驗測定植物中ICP的殺蟲效果。本發明中目標昆蟲主要為二點委夜蛾。
[0067]本發明中，所述CrylA.105蛋白可以具有序列表中SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。除了包含CrylA.105蛋白的編碼區外，也可包含其他元件，例如編碼第二種殺蟲核苷酸、編碼選擇性標記的蛋白質或賦予除草劑抗性的蛋白質的編碼區。
[0068]此外，包含編碼本發明CrylA.105蛋白的核苷酸序列的表達盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質一起表達，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉基因植物 。
[0069]本發明中，將外源DNA導入植物，如將編碼所述CrylA.105蛋白的基因或表達盒或重組載體導入植物細胞，常規的轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發射轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。
[0070]本發明提供了一種控制害蟲的方法，具有以下優點:
[0071]1、內因防治。現有技術主要是通過外部作用即外因來控制二點委夜蛾害蟲的危害，如農業防治和化學防治；而本發明是通過植物體內產生能夠殺死二點委夜蛾的CrylA.105蛋白來控制二點委夜蛾害蟲的，即通過內因來防治。
[0072]2、無污染、無殘留。現有技術使用的化學防治方法雖然對控制二點委夜蛾害蟲的危害起到了一定作用，但同時也對人、畜和農田生態系統帶來了污染、破壞和殘留；使用本發明控制二點委夜蛾害蟲的方法，可以消除上述不良后果。
[0073]3、全生育期防治。現有技術使用的控制二點委夜蛾害蟲的方法都是階段性的，而本發明是對植物進行全生育期的保護，轉基因植物(CrylA.105蛋白)從發芽、生長，一直到開花、結果，都可以避免遭受二點委夜蛾的侵害。
[0074]4、全植株防治。現有技術使用的控制二點委夜蛾害蟲的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發明是對整個植株進行保護，如轉基因植物(CrylA.105蛋白)的根、葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲等都是可以抵抗二點委夜蛾侵害的。
[0075]5、效果穩定。現有技術使用的噴施農藥的方法需要直接噴施到作物表面，容易造成噴施不均勻或漏噴等情況；本發明是使所述CrylA.105蛋白在植物體內進行表達，表達量基本上穩定一致，且本發明轉基因植物(CrylA.105蛋白)的防治效果在不同地點、不同時間、不同遺傳背景也都是穩定一致的。
[0076]6、簡單、方便、經濟。由于二點委夜蛾特殊的隱蔽發生與危害特征，導致對其危害的監測和防治較為困難，大大地增加了種植成本；本發明只需種植能夠表達CrylA.105蛋白的轉基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節省了大量人力、物力和財力。
[0077]7、效果徹底。現有技術使用的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用；而本發明轉基因植物(CrylA.105蛋白)可以造成初孵二點委夜蛾幼蟲的大量死亡，且對小部分存活幼蟲發育進度造成極大的抑制，都是明顯的發育不良，且已停止發育，很難再對玉米造成危害，而轉基因植物大體上只受到輕微損傷。
[0078]下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0079]圖1為本發明控制害蟲的方法的含有CrylA.105核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構建流程圖；
[0080]圖2為本發明控制害蟲的方法的含有CrylA.105核苷酸序列的重組表達載體DBN100032構建流程圖；
[0081]圖3為本發明控制害蟲的方法的轉基因玉米植株接種二點委夜蛾的葉片損傷圖。【具體實施方式】
[0082]下面通過具體實施例進一步說明本發明控制害蟲的方法的技術方案。
[0083]第一實施例、CrylA.105基因的獲得和合成
[0084]1、獲得CrylA.105核苷酸序列
[0085]CrylA.105殺蟲蛋白質的氨基酸序列(1177個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示；編碼相應于所述CrylA.105殺蟲蛋白質的氨基酸序列(1177個氨基酸)的CrylA.105核苷酸序列(3534個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0086]2、獲得Cry2Ab和Vip3A核苷酸序列
[0087]編碼Cry2Ab殺蟲蛋白質的氨基酸序列(634個氨基酸)的Cry2Ab核苷酸序列(1905個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:3所示；編碼Vip3A殺蟲蛋白質的氨基酸序列(789個氨基酸)的Vip3A核苷酸序列(2370個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0088]3、合成上述核苷酸序列
[0089]所述CrylA.105核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)、所述Cry2Ab核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)和所述Vip3A核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:4所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述CrylA.105核苷酸序列(SEQ IDNO: 2)的5，端還連接有NcoI酶切位點，所述CrylA.105核苷酸序列(SEQ ID NO: 2)的3，端還連接有HindIII酶切位點；合成的所述Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的5’端還連接有NcoI酶切位點，所述Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的3’端還連接有SpeI酶切位點；合成的所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的5’端還連接有ScaI酶切位點，所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的3’端還連接有SpeI酶切位點。
[0090]第二實施例、重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌
[0091]1、構建含有CrylA.105基因的重組克隆載體
[0092]將合成的CrylA.105核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；!7為I7RNA聚合酶啟動子；CrylA.105為CrylA.105核苷酸序列(SEQ ID NO: 2) ；MCS為多克隆位點)。
[0093]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50u I大腸桿菌Tl感受態細胞、10 u I質粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(IOOrpm轉速下搖床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-0 -D-半乳糖苷)和X_gal(5_溴_4_氯_3_ H引哚-P -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g /L，瓊脂15g/L，用NaOH調pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調pH至7.5)中于溫度37 °C條件下培養過夜。堿法提取其質粒:將菌液在12000rpm轉速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 u I冰預冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸浮；加入150iU新配制的溶液II (0.2M NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 U I冰冷的溶液III (4M醋酸鉀，2M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30ii I 含 RNase (20y g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存備用。
[0094]提取的質粒經EcoRI和XhoI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBNOl-T中插入的所述CrylA.105核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，即CrylA.105核苷酸序列正確插入。
[0095]按照上述構建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述Cry2Ab核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，Cry2Ab為Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中所述Cry2Ab核苷酸序列正確插入。
[0096]按照上述構建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述Vip3A核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，Vip3A為Vip3A核苷酸序列(SEQID N0:4)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述Vip3A核苷酸序列正確插入。
[0097]2、構建含有CrylA.105基因的重組表達載體
[0098]用限制性內切酶NcoI和HindIII分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達載體DBNBC-Ol (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構可以提供))，將切下的CrylA.105核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-Ol的NcoI和HindIII位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100032，其構建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 5);CrylA.105 =CrylA.105核苷酸序列(SEQ ID NO: 2) ；Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQID NO:6) ；PM1:磷酸甘露糖異構酶基因(SEQ ID NO:7) ；LB:左邊界)。
[0099]將重組表達載體DBN100032用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞，其熱激條件為:50iil大腸桿菌Tl感受態細胞、IOiU質粒DNA (重組表達載體DBN100032)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(IOOrpm轉速下搖床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養過夜。堿法提取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶NcoI和HindIII酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結果表明重組表達載體DBN100032在NcoI和HindIII位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列，即CrylA.105核苷酸序列。
[0100]按照上述構建重組表達載體DBN100032的方法，將NcoI和HindII1、NcoI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN02-T切下的所述CrylA.105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100076。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100076中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，即CrylA.105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列，所述CrylA.105核苷酸序列和所述Cry2Ab核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0101]按照上述構建重組表達載體DBN100032的方法，將NcoI和HindII1、ScaI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN03-T切下的所述CrylA.105核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100029。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100029中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列，即CrylA.105核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列，所述CrylA.105核苷酸序列和所述Vip3A核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0102]3、重組表達載體轉化農桿菌
[0103]對己經構建正確的重組表達載體DBN100032、DBN100076和DBN100029用液氮法轉化到農桿菌 LBA4404 (Invitrgen，Chicago，USA，CAT: 18313-015)中，其轉化條件為:IOOy L農桿菌LBA4404、3 ii L質粒DNA (重組表達載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉化后的農桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉速為200rpm條件下培養2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養并提取其質粒，用限制性內切酶AhdI和XhoI對重組表達載體DBN100032、DBN100076和DBN100029酶切后進行酶切驗證，結果表明重組表達載體 DBN1000 32、DBN100076 和 DBN100029 結構完全正確。
[0104]第三實施例、轉入CrylA.105基因的玉米植株的獲得及驗證
[0105]1、獲得轉入CrylA.105基因的玉米植株
[0106]按照常規采用的農桿菌侵染法，將無菌培養的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實施例中3所述的農桿菌共培養，以將第二實施例中2構建的重組表達載體DBN100032、DBN100076和DBN100029中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、CrylA.105核苷酸序列、Cry2Ab核苷酸序列、Vip3A核苷酸序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉入到玉米染色體組中，獲得了轉入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入CrylA.105-Vip3A核苷酸序列的玉米植株；同時以野生型玉米植株作為對照。
[0107]對于農桿菌介導的玉米轉化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農桿菌能夠將CrylA.105核苷酸序列、Cry2Ab核苷酸序列和/或Vip3A核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1:侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優選地浸入農桿菌懸浮液(OD66tl=0.4-0.6，侵染培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖 68.5g/L、葡萄糖 36g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L,pH5.3))中以啟動接種。幼胚與農桿菌共培養一段時期(3天)(步驟2:共培養步驟)。優選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖 10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂 8g/L,PH5.8)上培養。在此共培養階段后，可以有一個選擇性的“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2, 4-D) lmg/L、瓊脂8g/L, pH5.8)中至少存在一種己知抑制農桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉化體的選擇劑(步驟3:恢復步驟)。優選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養基上培養，以消除農桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養基上培養并選擇生長著的轉化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養，導致轉化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，優選地，在含選擇劑的培養基上生長的愈傷組織在固體培養基(MS分化培養基和MS生根培養基)上培養以再生植物。
[0108]篩選得到的抗性愈傷組織轉移到所述MS分化培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養分化。分化出來的小苗轉移到所述MS生根培養基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養至約IOcm高，移至溫室培養至結實。在溫室中，每天于28°C下培養16小時，再于20°C下培養8小時。 [0109]2、用TaqMan驗證轉入CrylA.105基因的玉米植株
[0110]分別取轉入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入CrylA.105-Vip3A核苷酸序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA,通過Taqman探針突光定量PCR方法檢測CrylA.105基因、Cry2Ab基因和Vip3A基因的拷貝數。同時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。
[0111]檢測CrylA.105基因拷貝數的具體方法如下:
[0112]步驟11、分別取轉入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylA.105-Vip3A核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復；
[0113]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產品說明書；
[0114]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0115]步驟14、調整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/uI；
[0116]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數，以經過鑒定已知拷貝數的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0117]以下引物和探針用來檢測CrylA.105核苷酸序列:
[0118]引物I (CFl):GCGCATCCAGITCAACGAC 如序列表中 SEQ ID NO:8 所示；
[0119]引物2 (CRl):GITCTGGACGGCGAAGAGTG 如序列表中 SEQ ID NO:9 所示；
[0120]探針I (CPl):TGAACAGCGCCCTGACCACCG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0121]以下引物和探針用來檢測Cry2Ab核苷酸序列:
[0122]引物3 (CF2):CTGATACCCTTGCTCGCGTC 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0123]引物4 (CR2):CACTTGGCGGTTGAACTCCTC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；[0124]探針2 (CP2):CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0125]以下引物和探針用來檢測Vip3A核苷酸序列:
[0126]引物5 (VFl):ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0127]引物6 (VRl):GCTGCCAGTGGATGTCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0128]探針3 (VPl):CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0129]PCR反應體系為:
[0130]
【權利要求】
1.一種控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，包括將二點委夜蛾害蟲與CrylA.105蛋白接觸。
2.根據權利要求1所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA.105蛋白存在于產生所述CrylA.105蛋白的植物細胞中，所述二點委夜蛾害蟲通過攝食所述植物細胞與所述CrylA.105蛋白接觸。
3.根據權利要求2所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA.105蛋白存在于產生所述CrylA.105蛋白的轉基因植物中，所述二點委夜蛾害蟲通過攝食所述轉基因植物的組織與所述CrylA.105蛋白接觸，接觸后所述二點委夜蛾害蟲生長受到抑制并最終導致死亡，以實現對二點委夜蛾危害植物的控制。
4.根據權利要求3所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述轉基因植物可以處于任意生育期。
5.根據權利要求3所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述轉基因植物的組織可以為根、葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
6.根據權利要求3所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述對二點委夜蛾危害植物的控制不因種植地點的改變而改變。
7.根據權利要求3所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述對二點委夜蛾危害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
8.根據權利要求2至7任一項所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述植物可以為玉米。
9.根據權利要求2至8任一項所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylA.105蛋白的多核苷酸的植物。
10.根據權利要求2至9任一項所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA.105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
11.根據權利要求10所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylA.105蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
12.根據權利要求2至11任一項所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述植物還可以產生至少一種不同于所述CrylA.105蛋白的第二種核苷酸。
13.根據權利要求12所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、a _淀粉酶或過氧化物酶。
14.根據權利要求13所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼Cry2Ab蛋白或Vip3A蛋白。
15.根據權利要求14所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
16.根據權利要求12所述的控制二點委夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
17.—種CrylA.105蛋白質 控制二點委夜蛾害蟲的用途。
【文檔編號】A01P7/04GK103636653SQ201310594217
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】楊旭, 韓超, 李勝兵, 張欣馨, 張愛紅 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心