清酒乳酸菌Lactobacillus sakei及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種清酒乳酸菌Lactobacillus?sakei，所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏登記入冊的編號為CGMCCNo.9016，保藏日期為2014年4月3日。本發明利用清酒乳酸菌Lactobacillus?sakei改善青貯飼料品質，成本低，安全可靠，易于利用。本發明可在青藏高原地區使用，克服了高原地區牧草表面低溫發酵乳酸菌數量較少的問題。本發明清酒乳酸菌Lactobacillus?sakei在低溫條件下發酵青貯的性能優于商品化菌株。
【專利說明】清酒乳酸菌Lactobaci I I us sake i及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物應用和飼料調制加工領域，特別是涉及一種適宜于青藏高原低溫條件下制作青忙飼料的耐低溫清酒乳酸菌Lactobacillus sakei及其應用。
【背景技術】
[0002]青藏高原被喻為“世界屋脊”和“地球第三極”，大約占我國國土總面積的26 %，是我國主要的畜牧業基地之一。與我國其它畜牧業地區相比，青藏高原地勢高亢，輻射強烈，并且冷季漫長，暖季短暫，熱量不足；干旱寒冷的氣候導致草地結構不合理，牧草生長期短，產草量較低，青綠飼料的供應存在著明顯的季節和地域不平衡性。為滿足冬春季節青藏高原家畜生長的需求，農牧民多采用將牧草打捆，晾曬和風干的傳統貯藏方式，但傳統貯藏方式易使牧草粗蛋白含量減少，適口性和消化率下降。青貯作為一種簡單易行，成本較低的牧草貯藏方式，能更多地保存牧草的營養價值，將為解決高寒草地畜牧業冬春季節飼草料嚴重不足作出巨大貢獻。
[0003]青貯通過乳酸發酵快速降低青貯料pH值，并且維持厭氧的青貯環境，從而長期保存牧草的青綠 特性。青貯品質的好壞受到貯藏溫度、乳酸菌種類和數量以及青貯原料特性的影響，而溫度對青貯品質的影響主要通過乳酸菌活性的強弱產生作用。青貯溫度過低或過高，都不利于乳酸發酵，溫度過低乳酸菌活性通常不強，而過高溫度青貯則會降低青貯料的飼用價值，增加干物質損失。在青藏高原地區，牧草收獲季節氣溫已降至10~20°C，且日溫差大，溫度較低且低溫條件下牧草青貯體系中乳酸菌數量較少成為限制青藏高原牧草青貯品質的重要因素。
【發明內容】
[0004]有鑒于此,本發明的目的在于提出一種清酒乳酸菌Lactobacillus sakei及其應用，以克服高原地區牧草表面低溫發酵乳酸菌數量較少的問題，提高在低溫條件下發酵青貯的性能。
[0005]基于上述目的，本發明提供的一種清酒乳酸菌Lactobacillus sakei,所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏登記入冊的編號為CGMCCN0.9016，保藏日期為2014年4月3日。
[0006]可選地，所述菌株的生長溫度為4~45°C。
[0007]較佳地，所述菌株的生長溫度為10~15°C。
[0008]優選地，所述菌株于MRS培養基培養12小時后pH值降至4~4.2。
[0009]本發明還提供一種所述的清酒乳酸菌Lactobacillus sakei在制備青忙飼料中的應用，所述青貯飼料為垂穗披堿草青貯飼料，每I克垂穗披堿草青貯飼料接種清酒乳酸菌Lactobacillus sakei 有效活菌數為 5X 15 ~1.5X 16 個。
[0010]可選地,每I克垂穗披堿草青忙飼料接種清酒乳酸菌LactobaciIIus sakei有效活菌數為8X 15~1.2X 16個。
[0011]優選地，所述青貯飼料的貯藏溫度為15~25°C，貯藏45~55天后pH值降至
4.42 ~4.52。
[0012]較佳地，所述垂穗披堿草青貯飼料切斷至2~3cm。
[0013]從上面所述可以看出，與現有技術相比，本發明具有如下有益優勢:
[0014](I)本發明利用清酒乳酸菌Lactobacillus sakei改善青忙飼料品質，成本低，安全可靠，易于利用。
[0015](2)本發明可在青藏高原地區使用，克服了高原地區牧草表面低溫發酵乳酸菌數量較少的問題。
[0016](3)本發明清酒乳酸菌Lactobacillus sakei在低溫條件下發酵青忙的性能優于商品化菌株。
【具體實施方式】
[0017]為使本發明 的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發明進一步詳細說明。
[0018]實施例1乳酸菌的分離鑒定
[0019]在超凈工作臺中將青藏高原垂穗披堿草青貯樣品開封取樣，在無菌環境下稱取1g放入裝有90mL無菌生理鹽水的250mL三角瓶中，搖床180r/min室溫振蕩60min，并用無菌水按照KT1至10_5進行稀釋，選取適當的濃度，利用平板劃線法在37°C厭氧環境中進行乳酸菌的培養。培養48h后根據乳酸菌菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等，挑取有透明圈的單菌落，進行革蘭氏染色、過氧化氫酶和油鏡鏡檢實驗，凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株疑似其為乳酸菌并以劃線的方式在MRS培養基上繼續分離純化培養2次，純化后的菌株在光學顯微鏡下進行形態學檢測，并接種到MRS液體培養基37°C厭氧培養12h后加入10%的二甲基亞砜，在-80°C下保存備用。其中，MRS培養基為:蛋白胨10g，酵母提取物5g,葡萄糖20g,無水乙酸鈉5g,檸檬酸氨2g,牛肉膏10g, K2HP042g,吐溫801mL,MgSO4.7Η200.58g, MnSO4.H2017g，溶解于 IL 水，調 pH 至 6.2-6.4，121°C 高壓滅菌 15min,制作固體培養基時，除上述各組分外，再加入15g瓊脂。
[0020]取從青貯飼料中分離得到的108株乳酸菌，純化后的乳酸菌在MRS培養基中培養8h后，10000rpm/min,離心3_5min,收集菌體。按照試劑盒使用方法提取每個菌體的DNA,然后分別進行PCR擴增，在細菌的通用引物27F和1492R(Monis et al，2005)的擴增下，進行16SrRNA 的擴增。擴增條件:95°C,5min ；95°C,30s ；55°C,30s ；72°C, lmin30s ；72°C,5min ；30次循環。PCR產物送上海美吉生測序公司進行序列分析。將測得的每個乳酸菌菌株16SrRNA 基因序列用 BLAST (http://wwwncb1.nlm.nih.gov/blast/)在 GenBank 中搜索，與待測菌株同源性最高的已知分類地位的菌種初步確定待測菌株的種屬。然后從GenBank數據庫中下載已知的乳酸菌菌株的16SrRNA序列，以Clustal X(THOMPSON et al, 1994)進行序列比對后，用 MEGA4.0 白勺 UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic means)法構建系統發育樹(SUDHIR et al, 2001)，并進行1000次Bootstraps檢驗。利用16S rRNA基因序列同源性分析的方法進行菌種的鑒定。
[0021 ] 實施例2耐低溫乳酸菌的篩選及生理生化特性比較[0022]采集孕穗期黑麥草，將其與水按照1:2.5的比例混勻后用榨汁機獲得綠汁發酵液，于4層紗布過濾，1000rpm/min離心5min后,取上懸液并滅菌。待其冷卻后按3%的接種量分別將鑒定后的乳酸菌菌株接種到綠汁發酵液中，置于15°C和25°C培養箱中培養，培養3天后測定發酵液的pH值，篩選出低溫條件下降低發酵pH值較好的菌株清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei,LS)。所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏登記入冊的編號為CGMCCN0.9016，保藏日期為2014年4月3日。
[0023]將本發明的菌株清酒乳桿菌(LS)與購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)的清酒乳桿菌(CLS)參考菌株(編號CICC21858)相對比，進行革蘭氏染色和細胞形態觀察，并對其在不同溫度(4°C、10°C、45°C、5(TC )和 pH 值(3.0、3.5、4.0、8.0、8.5、9.0)下生長性能進行測定，以及糖利用范圍進行觀察。
[0024]結果表明，本發明篩選的清酒乳桿菌(LS)革蘭氏染色陽性、桿菌，生長速度快(MRS培養基培養12小時pH值降至4.2)，生長范圍寬(在4_45°C下均可生長)，在10°C下生長較好，與參考菌株相比，有更廣泛的糖源利用能力，可發酵大多數糖類，見表1。
[0025]表1菌株的理化特性比較
[0026]
【權利要求】
1.一種清酒乳酸菌Lactobacillus sakei,其特征在于,所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏登記入冊的編號為CGMCCN0.9016，保藏日期為2014年4月3日。
2.根據權利要求1所述的清酒乳酸菌Lactobacillussakei,其特征在于,所述菌株的生長溫度為4~45°C。
3.根據權利要求2所述的清酒乳酸菌Lactobacillussakei,其特征在于,所述菌株的生長溫度為10~15°C。
4.根據權利要求1所述的清酒乳酸菌Lactobacillussakei,其特征在于,所述菌株于MRS培養基培養12小時后pH值降至4~4.2。
5.—種根據權利要求1~4中任意一項所述的清酒乳酸菌Lactobacillus sakei在制備青貯飼料中的應用，其特征在于，所述青貯飼料為垂穗披堿草青貯飼料，每I克垂穗披堿草青忙飼料接種清酒乳酸菌Lactobacillus sakei有效活菌數為5X 15~1.5X 16個。
6.根據權利要求5所述的清酒乳酸菌Lactobacillussakei在制備青忙飼料中的應用，其特征在于，每I克垂穗披堿草青忙飼料接種清酒乳酸菌Lactobacillus sakei有效活菌數為8X 15~1.2X 16個。
7.根據權利要求5所述的清酒乳酸菌Lactobacillussakei在制備青忙飼料中的應用，其特征在 于，所述青貯飼料的貯藏溫度為15~25°C，貯藏45~55天后pH值降至4.42 ~4.52。
8.根據權利要求5所述的清酒乳酸菌Lactobacillussakei在制備青忙飼料中的應用，其特征在于，所述垂穗披堿草青忙飼料切斷至2~3cm。
【文檔編號】A23K1/00GK104031868SQ201410272717
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】郭旭生, 丁武蓉, 秦麗萍, 柯文燦, 保安安 申請人:蘭州大學