一種雜交蘭花多倍體的誘導方法
【專利摘要】本發明具體涉及雜交蘭花多倍體誘導方法，屬于多倍體育種【技術領域】，以大花蕙蘭‘愛神’（ Cymbidium LuckyGloria'Aguri'）與虎雪蘭[ Cymbidiumhybridium ×( Cymbidiumtracyanum varhuanghua× Cymbidiummastersii ）]的雜交種萌發形成的無菌圓球莖作試材，利用秋水仙素對F1代圓球莖進行多倍體誘導，再將誘導后的圓球莖分化成芽和叢芽增殖培養，把鑒定為多倍體的植株經生根培養后，獲得多倍體植株組培苗。本發明采用圓球莖結合秋水仙素浸泡法獲得的雜交蘭花多倍體植株，具有倍性特征顯著，采用圓球莖作為誘導材料縮短了多倍體雜交蘭植株培育的周期，且方法簡單易于掌握。
【專利說明】一種雜交蘭花多倍體的誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及雜交蘭花多倍體誘導方法，屬于多倍體育種【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蘭花是一種姿態優美，芳香馥郁的珍貴花卉，屬中國傳統十大名花之一。大花蕙蘭作為重要的商品盆花和切花之一，目前倍受人們青睞，大花蕙蘭常見品種‘愛神’{Cymbidium Lucky Gloria ’ Aguri’)為多年生草本植物,每株有花葶1_5支,花葶斜生,稍彎曲，從葉叢基本向外抽出，長35-80cm ;著花5-10朵，花大，艷麗紅色，花期11月至翌年3 月，花期較長；<虎雪蘭，[Cymbidium hybridiumY, {Cymbidium tracyanumvarhuanghua'XCymbidium Hiastersii1i是沉香虎頭蘭黃色素花與大雪蘭雜交培育出的,遺傳性狀穩定，花期10-12月，長達40-60 d。目前由于品種和栽培技術較落后，國產(包括臺灣進口)蘭的質量與日本、韓國有明顯差距，這種狀況已遠遠不能滿足我國人民群眾對蘭花各性狀要求。特別是切花蘭市場，大部分切花蘭主要依靠進口，與我國豐富的蘭花資源背道而弛，這就迫切需要充分利用我國優異蘭花資源，培育出具有我國自主知識產權的新品種，促進蘭花產業健康發展，并為我國蘭花走向世界奠定堅實基礎。
[0003]多倍體植株莖桿粗壯，生長堅實，耐倒伏，葉片增厚增寬，綠色加深，光合作用增強，增加新的紋飾特征、花朵比較大且緊湊，花期長而遲。這些特征大大提高了花卉的產量與質量，增加了花卉的觀賞價值和商品價值，所以多倍體育種在花卉上有廣泛的應用。在自然條件下，由于外界環境的變化和遺傳結構的不穩定性，植物本身會發生自發突變，然而這類突變發生的頻率極低，并因植物種類和基因的不同而存在差異。自然界中植株變異率極低，遠遠不能夠滿足蘭花育種工作的需要，化學誘變育種是目前一種迅速發展的作物育種技術，具有使用方便，特異性較強和誘變后代較易穩定遺傳等特點。
[0004]化學誘變育種是利用化學誘變劑誘變產生多倍體的方法。此方式是目前應用最廣泛，操作簡單易行，突變頻率高，專一性強，適用范圍廣的方法。秋水仙素是目前主要采用的誘變劑。誘導材料通常選取種子、頂芽、側芽以及組織培養中的愈傷組織、圓球莖、不定芽等分裂旺盛的器官或組織，用秋水仙素處理誘導效果與作用時間和使用的濃度及溫度、處理的植物種類和器官等因素有關，一般常用的處理濃度在0.01%-0.2%，處理溫度一般在17-20。。。
[0005]化學誘變多倍體較常用的誘導方法有滴液法、浸泡法、混培法、注射法等。在實際工作中運用最簡便有效的方式之一是:浸泡法，先將培養材料在化學試劑中浸泡處理之后，在轉入預先制作好的培養基中進行培養的方法。二就是混培法，將培養材料與含化學試劑的培養基培養一段時間之后，誘導加倍后再轉入分化培養基中培養的方式。但對于秋水仙素的濃度，針對不同材料有不同的實用范圍。因秋水仙堿類的化學藥品相對來說會對細胞產生毒害作用，影響細胞的正常生長，時間過長、濃度過高會抑制材料生長，甚至引起毒害，處理濃度太低、時間過短起不到作用。誘導方法也因培養材料而異。鄭君強等用秋水仙堿誘導四季桔的研究結果表明浸泡法效果較好；而段英姿等用秋水仙堿誘導菘藍多倍體時發現秋水仙堿加入培養基中更有助于多倍體的形成。
[0006]多倍體誘導會導致植物嵌合體、二倍體和多倍體植株共同存在的現象。而嵌合體現象的存在可能會導致多倍體誘導育種失去原有的意義，然而突變細胞和非突變細胞的生長競爭力則是能否形成嵌合體的重要原因。組織培養與秋水仙素誘導相結合培育植物多倍體的技術是在傳統的化學誘導基礎上發展而來的，并伴隨植物組織培養技術的發展而日趨成熟。其優點一是減少嵌合體的發生。培育植株多倍體的傳統誘導法是以植物生長點、側芽或種子等為誘導對象，由多細胞構成的芽發育成植株，因細胞分裂不同步，容易形成嵌合體，難于獲得同質的多倍體，誘導率也較低。隨著生物技術的發展，通過對材料進行組織培養后再作誘導處理，能誘導加倍的多倍體單細胞分化出不定芽，并發育成單株，形成同質多倍體，提高誘導率，有效排除嵌合體的干擾，并且縮短多倍體培育時間。二是試驗條件易控制。此種技術是在室內進行，室內試驗條件易控制，且易于重復試驗結果，提高工作效率。
[0007]一般認為影響蘭花多倍體誘導成功率的因素包括植物本身的生理特性、誘導材料的選擇、誘導方法的選擇、實際操作過程中引起的誤差等。研究表明植株上任一生物學部分均可作為處理材料，只要秋水仙素濃度和處理時間適宜，結合相應的培養基均可獲得變異的多倍體。目前以叢芽為誘導材料，已在齒瓣石斛、石斛、野生黃蟬蘭和碧玉蘭等獲得了多倍體植株。以蘭花圓球莖和根狀莖為材料進行多倍體誘導在國外內已有些研究報道。Hsien等用秋水仙素處理五唇蘭/w/7cA6?r_ri?a)的圓球莖(直徑為1^1.2mm),獲得了再生植株中46%四倍體。Kim等用秋水仙素處理寒蘭根狀莖，獲得了誘導率分別為4.5%、5.2%、6.7% (2n=66^80)的多倍體材料。國內在春蘭、鐵皮石斛和二倍體大花蕙蘭品種“紅寶石”等少數幾個品種上開展研究，培育出了四倍體植株。但由于圓球莖和根狀莖是蘭屬植物種子萌發的中間繁殖體，經過分化培養才能形成芽體，采用圓球莖或根狀莖作為誘導材料，可以使多倍體誘導和芽的分化同時發生，大大縮短了獲得多倍體植株的育種時間。
【發明內容】
[0008]本發明目的在于提供一種雜交蘭花多倍體的植株的制備方法，利用該方法獲得具有四倍體特征的雜交蘭植株。
[0009]本發明采用的技術方案是:
一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，所述方法包括:
(O將蘭花雜交種萌發形成的無菌圓球莖浸泡在0.1%_6%濃度的秋水仙素溶液中，分別處理24h-72h后用無菌水沖洗4-5次，濾干水分，轉入培養基中。培養條件:pH為
5.8-6.0、溫度(25±2) °C、光照 12 h/d，光照強度 1800_25001x ；
(2)根據多倍體植株與二倍體植株呈現出的較明顯的特征為莖粗壯，枝少、葉少、葉片寬而厚、葉色深等特點，對變異植株進行初步篩選，將初步篩選出來的變異植株轉入培養基上進行芽誘導和增殖培養，培養條件同上；
(3)選取二倍體植株和經三次繼代后穩定擴繁的變異植株，通過形態學、氣孔和染色體鑒定為多倍體的植株轉接于培養基中，鑒定方法、培養條件同上。
[0010]步驟(I)所述蘭花雜交種萌發形成的無菌圓球莖制備的消毒方法為:取大花蕙蘭‘愛神’與虎雪蘭發育成熟但尚未裂開的自交蒴果，用75%的酒精擦干凈，在超凈超凈工作臺上用75%的酒精消毒3?6min，無菌水清洗2次，然后放入0.2%的升汞中消毒10?15min,無菌水沖洗4次，剖開果皮，取出種子。
[0011]步驟(I)所述雜交種萌發形成的無菌圓球莖制備的培養方法:剖開消毒后自交蒴果果皮，取出種子，然后將種子撒播到種子無菌萌發的培養基中。種子無菌萌發的培養基包含 1/2MS基本培養基、0.5-2.5 mg/L6-BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L蔗糖和 6.0-7.0g.Γ1 瓊月旨。培養條件:溫度25?30°C，采用暗培養。種子萌發形成的中間繁殖體即為雜交蘭無菌圓球莖。
[0012]步驟(I)所述的經秋水仙素浸泡過的無菌圓球莖轉入最佳配方的培養基中，培養基的最佳配方篩選方法如下:將獲得的雜交蘭無菌圓球莖接種到含有不同濃度細胞分裂素的培養基上進行增殖培養，從6-BA、NAA、KT、添加物四個因素研究對雜交蘭無菌圓球莖增殖的影響。6-BA 濃度為 0.5-2.0mg/L、NAA 濃度為 0.1-1.5mg/L、KT 濃度為 0.1-1.5mg/L，添加物種類分別為香蕉+花寶4號、香蕉和花寶4號。每個處理5瓶(每瓶10個圓球莖)，60d后觀察苗體生長情況，統計增殖情況。實驗結果表明1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.lmg/LKT+0.3%花寶4號+活性炭0.5g/L誘導增殖效果最佳，平均增殖率達342%。并且在增殖過程中，圓球莖已經開始分化為芽。1/2MS指溶液中所含的大量和微量元素為MS的一半，其他不變。
[0013]步驟(2)所述的多倍體的鑒定方法如下:取植株幼嫩根尖Icm根尖放入玻璃瓶中，加入0.004M 8-輕基喹啉于18°C下預處理9h ;將預處理材料洗漆后轉入Carony’ s液(乙醇:乙酸=3:1)中，置冰箱內固定3h。取出固定好的材料，洗滌3-4次后放入Imol/L的HCl酸解20-30min。用蒸餾水清洗3_5次解離過的材料(如果清洗不干凈染色效果較差，會影響壓片效果)，置于載玻片上，切取根冠末端1_，用改良后的卡寶品紅溶液染色4_6min，用刀片把染色的根尖搗爛，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭輕敲蓋玻片，使細胞均勻分散。并用濾紙把蓋玻片周圍多余的染色劑吸干。將做好的切片放于電子顯微鏡下觀察染色體分散情況，然后選擇染色體形態、分散較好的片子，進行拍照。鏡檢觀察2n=4x=80，而二倍體雜交蘭2n=2x=40，故可確定獲得的植株為四倍體植株。
[0014]按照本發明方法得到的雜交蘭四倍體幼苗，與二倍體雜交蘭相比，株高、葉寬、葉厚和莖粗明顯比二倍體雜交蘭粗大；20倍鏡下，單個氣孔二倍體長徑均值為27.5 μ m、短徑為21.4 μ m、長徑X短徑為588.2 μ m2，四倍體長徑均值為32.4 μ m、短徑為25.2 μ m、長徑X短徑為817.6 μ m2。
[0015]作為優選，步驟(I)所述的秋水仙素濃度最佳為3%，處理時間為72小時。對于特定品種的大花蕙蘭與虎雪蘭雜交品種，在該條件下誘變率高達40%。
[0016]本發明獲得的雜交蘭多倍體組培苗經3-4次繼代轉接培養后，植株性狀穩定性好，與誘導當代相似。
[0017]本發明的有益效果主要體現在:本發明利用雜交蘭種子萌發的無菌圓球莖作為材料獲得的雜交蘭多倍體植株，具有顯著的多倍體特征；采用圓球莖作為誘導材料縮短了多倍體雜交蘭植株培育的周期，可獲得穩定高效發生的多倍體，且制備方法簡單，為今后蘭花復合育種進一步研究提供理論依據和應用基礎，本發明獲得的雜交蘭多倍體具有較高的應用價值。
[0018]通過本試驗結果看出，利用浸泡法對大花蕙蘭和虎雪蘭雜交種進行多倍體誘導效果比混培法效果好，浸泡法誘導率高于混培法。試驗所得大部分變異植株均由浸泡法所得，原因可能是因為浸泡法對組織的作用較為直接。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為染色體計數結果，a為二倍體雜交蘭，b為四倍體雜交蘭(即本發明制備的多倍體植株)，XlOO倍鏡下體細胞中期染色體；
圖2為生根苗植株，左邊為二倍體雜交蘭植株，右邊為本發明所制備的四倍體雜交蘭植株；
圖3為得到的雜交蘭多倍體幼苗的氣孔大小結果，a為二倍體雜交蘭植株，b為本發明所制備的四倍體雜交蘭植株；X20倍鏡下單個視野中的氣孔大小。
【具體實施方式】
[0020]以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0021]實施例1:
1)取大花蕙蘭‘愛神’iCymbidium Lucky Gloria ’ Aguri’)與虎雪蘭hybridiumY, {Cymbidium tracyanumvarhuanghua X Cymbi di um mas ter si i ) ] ^ W但尚未裂開的自交蒴果，用75%的酒精擦干凈，在超凈超凈工作臺上用75%的酒精消毒3?6min,無菌水清洗2次,然后放入0.2%的升萊中消毒10?15min,無菌水沖洗4次,剖開果皮，取出種子；
2)將種子撒播到1/2MS 基本培養基、0.5-2.5 mg/L6_BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L 蔗糖和6.0-7.0g.Γ1瓊脂的培養基中，放入溫度25?30°C培養室中進行暗培養；
3)將雜交種萌發形成的無菌圓球莖浸泡在3%濃度的秋水仙素溶液中，處理72h，用無菌水沖洗 4-5 次，濾干水分，轉入 1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.lmg/LKT+0.3% 花寶 4號+活性炭0.5g/L培養基中。培養條件:pH為5.8-6.0、溫度(25±2) °C、光照12 h/d,光照強度1800-25001x。
[0022]4)根據多倍體植株與二倍體植株呈現出的葉形、葉色、株型、株色、生長勢上的差別，對變異植株進行初步篩選。將初步篩選出來的變異植株轉入1/2MS +1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA +0.lmg/L ΚΤ+0.3%花寶4號+活性炭0.5g/L培養基上進行芽誘導和增殖培養，培養條件同上。
[0023]5)選取二倍體植株和經三次繼代后穩定擴繁的變異植株，通過形態學、氣孔和染色體鑒定多倍體植株，多倍體鑒定的具體步驟為:
早上8:30-9:00時，取組培苗植株新長出3-5天的幼嫩根尖，將取出的大小為Icm根尖放入玻璃瓶中，加入0.004M 8-羥基喹啉于18°C下預處理9h。將預處理材料洗滌后轉入Carony’s液(乙醇:乙酸=3:1)中，置冰箱內固定3h。取出固定好的材料，洗滌3_4次后放入lmol/L的HCl酸解20_30min。用蒸餾水清洗3_5次解離過的材料，置于載玻片上，切取根冠末端1mm，用改良后的卡寶品紅溶液染色4-6min，用刀片把染色的根尖搗爛，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭輕敲蓋玻片，使細胞均勻分散。并用濾紙把蓋玻片周圍多余的染色劑吸干。將做好的切片放于電子顯微鏡下觀察染色體分散情況，然后選擇染色體形態、分散較好的片子，進行拍照。鏡檢觀察2n=4x=80，二倍體雜交蘭2n=2x=40，故可確定獲得的植株為四倍體植株。
[0024]將四倍體植株轉接到1/2MS+1.0mg/L6-BA+l.5mg/LNAA+l.0mg/LIBA+ 活性炭0.5g/L生根培養基中，培養條件同上。
[0025]實施例2:
具體步驟如實施例1所述，不同的是步驟3中的秋水仙素處理時采用將秋水仙素溶液直接加的培養基中，濃度為3%，處理時間為14d，變異率為26.7%。
[0026]以上實施例僅為本發明的部分實施方式，本發明不限于上述的實施例，步驟3中秋水仙素的濃度及處理時間可根據實際情況進行調整，本領域技術人員能從該
【發明內容】
中直接導出的所有變形，均因落入本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，所述方法包括: (O將蘭花雜交種萌發形成的無菌圓球莖浸泡在0.1%_6%濃度的秋水仙素溶液中，分別處理24h-72h后用無菌水沖洗4-5次，濾干水分，轉入培養基中；培養條件:pH為5.8-6.0、溫度(25±2) °C、光照 12 h/d，光照強度 1800_25001x ； (2)根據多倍體植株與二倍體植株呈現出的較明顯的特征為莖粗壯，枝少、葉少、葉片寬而厚、葉色深等特點，對變異植株進行初步篩選，將初步篩選出來的變異植株轉入培養基上進行芽誘導和增殖培養，培養條件同上； (3)選取二倍體植株和經三次繼代后穩定擴繁的變異植株，通過形態學、氣孔和染色體鑒定為多倍體的植株轉接于培養基中，鑒定方法、培養條件同上。
2.如權利要求1所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述蘭花雜交種萌發形成的無菌圓球莖制備的消毒方法為:取大花蕙蘭‘愛神’與虎雪蘭發育成熟但尚未裂開的自交蒴果，用75%的酒精擦干凈，在超凈超凈工作臺上用75%的酒精消毒3?6min,無菌水清洗2次,然后放入0.2%的升萊中消毒10?15min,無菌水沖洗4次，剖開果皮，取出種子。
3.如權利要求1或2所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述雜交種萌發形成的無菌圓球莖制備的培養方法:剖開消毒后自交蒴果果皮，取出種子，然后將種子撒播到種子無菌萌發的培養基中；種子無菌萌發的培養基包含1/2MS基本培養基、0.5-2.5 mg/L6-BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L 蔗糖和 6.0-7.0g.Γ1 瓊脂；培養條件:溫度25?30°C，采用暗培養；種子萌發形成的中間繁殖體即為雜交蘭無菌圓球莖。
4.如權利要求1或3所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述的經秋水仙素浸泡過的無菌圓球莖轉入最佳配方的培養基中，培養基的最佳配方篩選方法如下:將獲得的雜交蘭無菌圓球莖接種到含有不同濃度細胞分裂素的培養基上進行增殖培養，從6-BA、NAA、KT、添加物四個因素研究對雜交蘭無菌圓球莖增殖的影響；6_BA濃度為0.5-2.0mg/L、NAA濃度為0.1-1.5mg/L、KT濃度為0.1-1.5mg/L，添加物種類分別為香蕉+花寶4號、香蕉和花寶4號；每個處理5瓶，每瓶10個圓球莖，60d后觀察苗體生長情況，統計增殖情況。
5.如權利要求1所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述的秋水仙素濃度最佳為3%，處理時間為72小時。
【文檔編號】A01H4/00GK104273029SQ201410450488
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月5日 優先權日:2014年9月5日
【發明者】王玉英, 李枝林, 李光宏, 孟英, 李志敏, 王亞沉 申請人:云南農業大學