專利名稱：一種喜樹多倍體的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種喜樹多倍體的誘導方法。
技術背景喜樹屬珙桐科旱蓮屬植物，是中國特有的經濟樹種，1998年8月被批 準為第一批國家重點II級保護野生植物。喜樹中含有的喜樹堿具有顯著的 抗腫瘤活性和獨特的抗癌機制。研究證實，喜樹堿通過抑制DNA拓撲異構 酶I的活性及逆轉錄病毒的復制來阻止細胞DNA、 RNA的合成，是迄今為 止發現的唯一專門通過抑制拓撲異構酶I發揮細胞毒性的天然植物活性成 分。前期臨床試驗表明，喜樹堿及其衍生物對膀胱癌、腦癌、乳癌、宮頸 癌、結腸癌、白血病、肺癌、淋巴癌和肝癌等30余種腫瘤都有不同程度的 療效，從而引起人們的廣泛關注，使喜樹成為繼紅豆杉之后又一重要的木 本抗癌藥用植物。喜樹堿是存在于喜樹的樹皮、根、果實和葉中的具有五 元環的生物堿，由于喜樹堿是喜樹的次生代謝物，因而在喜樹中的含量非 常低，用常規的從喜樹中提取喜樹堿的方法會造成喜樹植物資源的極大破 壞，當采集量超過植物的再生能力時，必然會導致喜樹物種的瀕危甚至滅 絕。隨著人們對喜樹堿類抗癌藥物需求的不斷增加，單純靠從喜樹中提取 喜樹堿的方法已遠遠不能滿足市場的需求。發明內容本發明的目的在于針對現有喜樹中喜樹堿含量低的問題，依據植物細 胞染色體加倍后，染色體上基因調控有效化學成分的含量往往較正常二倍 體高，同時多倍體植物還具有器官巨大性的特征而提供一種喜樹多倍體的誘導方法，該方法可以培育出有效成分(即喜樹堿)含量高的喜樹四倍體 組培苗，從而滿足人們對喜樹堿類抗癌藥物日益增長的需要。為達到上述目的，本發明采用的解決方案是選取喜樹的莖或葉作為 外植體，并進行消毒處理，將消毒后的外植體接種于愈傷組織培養基中進行培養，再將培養后的愈傷組織置于濃度為100mg/L 500mg/L的秋水仙堿 溶液中浸泡12 48小時，然后用無菌水進行沖洗，再轉移到不含秋水仙堿 的芽分化培養基上暗培養7天后，轉入光照培養，待不定芽生長50天后， 對其進行多倍體鑒定，選取具有四倍體特征的不定芽轉入增殖培養基中產 生四倍體叢生芽，再將生長2cm以上的叢生^^分割為單株，轉入壯苗培養 基中進行培養，然后選擇生長健壯的無根苗接種于生根培養基中，培養出 喜樹四倍體組培苗，當組培苗長至3cm以上時，打開瓶蓋，在室內煉苗3 5天，移栽到滅過菌的珍珠巖一田土的基質上；所述愈傷組織培養基為B5+NAA0 lmg/L+2， 4-DO. 5 2mg/L+KT0. 5mg/L;所述芽分化培養基為MS+6-BAO. 5 1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L;所述增殖培養基為MS+NAAO. 1 0. 5mg/L+6-BA1. Omg/L;所述壯苗培養基為MS+NAAO. 05mg/L+6-BAO. 3mg/L;所述生根培養基為1/2MS+NAA0. 1 0. 3mg/L+IBA1. Omg/L;上述所有培養基的配制PH均為5.6 6.5，瓊脂均為0. 7 0. 8%，其中 愈傷組織培養基、芽分化培養基、增殖培養基和壯苗培養基中蔗糖含量為 30g/L，生根培養基中蔗糖含量為15g/L;所有培養基的培養條件為溫度 23 27°C、每天光照12小時、光照強度1500 2000Lx。上述方案中外植體消毒所采用的消毒液為濃度是70%-75%的酒精和濃 度是O. 1%的升汞。上述方案中多倍體是這樣鑒定的取生長50天后的不定芽于濃度為 0.2%的秋水仙素溶液中預處理2.3 2.7小時后，用水沖洗，然后用按3:1重量比配制的甲醇一冰醋酸固定液固定3. 5 4. 5小時，接著用纖維素酶和 果膠酶各占2. 5%的混合酶在25。C恒溫箱內處理2. 8 3. 2小時，倒去酶液， 用蒸餾水沖洗2 3次，每次2分鐘，去除蒸餾水，制備細胞懸液，并用懸 滴法制片，干燥后用改良苯酚品紅染色后觀察，如染色體數目均為 2n=4x=88，則確定為四倍體不定芽。上述方案中珍珠巖一田土的基質中珍珠巖與田土的配比為3:7，組培苗 移栽至珍珠巖一田土的基質后，應適當遮光，并保持相對濕度在75 85%。本發明由于以細胞分裂旺盛的愈傷組織細胞為處理材料進行喜樹植物 的多倍體誘導，因此獲得同源多倍體植株的效率高；又因為喜樹多倍體植 株的有效成分含量高，因此培育出的喜樹具有的喜樹堿含量就高，從而可 滿足人們對喜樹堿類抗癌藥物的需求。該發明對于喜樹植物的改良遺傳及 保護我國喜樹資源具有重要的作用。
具體實施方式
實施例1(1) 外植體的處理采集喜樹幼嫩的莖作為外植體，用濃度為70%的酒精消毒30秒后，用無菌水沖洗3次，再用濃度為0. 1%的升汞消毒30分鐘 后，用無菌水沖洗5次，然后用無菌濾紙吸干水份；(2) 愈傷組織培養將消毒后的莖切成2cm長，接種于 B5+NAAlmg/L+2， 4-DO. 5mg/L+KT0. 5mg/L的愈傷組織培養基中進行培養；(3) 多倍體誘導將愈傷組織浸泡于已過濾滅菌的秋水仙堿溶液中40 小時，溶液濃度為400mg/L，然后用無菌水沖洗3 4次，再轉移到不含秋 水仙堿的MS+6-BA lmg/L+NAAO. 2mg/L的芽分化培養基上暗培養7天后，轉 入光照培養，光照強度為1500 2000Lx，每天光照12小時；(4) 多倍體鑒定取生長50天后的不定芽于濃度為0. 2%的秋水仙素溶 液中預處理2. 5小時后，用水沖洗，然后按3:1體積比配制的甲醇一冰醋酸固定液固定4小時，再用纖維素酶和果膠酶各占2. 5%的混合酶在25'C恒 溫箱內處理3小時，倒去酶液，用蒸餾水沖洗3次，每次2分鐘，再去除 蒸餾水，制備細胞懸液，并用懸滴法制片，待干燥后用改良苯酚品紅染色 后觀察，如染色體數目均為2『4x二88，則確定為具有四倍體特征的不定芽；(5) 多倍體苗的培養將具有四倍體特征的不定芽轉入增殖培養基 MS+NAAO. 3mg/L+6-BA 1. 0mg/L中分化出四倍體叢生芽，再將生長2cm以上 的叢生芽分割為單珠，轉入壯苗培養基MS+NAAO. 05mg/L+6-BAO. 3mg/L中培 養，然后選擇生長健壯的無根苗接種于生根培養基1/2MS+NAA0. 3mg/L+IBA 1.0mg/L中，培養出喜樹四倍體組培苗；(6) 煉苗和移栽當四倍體組培苗長至3cm以上時，打開瓶蓋，在室內 煉苗3天后移栽至滅過菌的珍珠巖一田土(3:7)的基質上，先用薄膜封蓋， 適當遮光，保持相對濕度在75 85%。組培苗生長健壯，成活率達到98%;本實施例中所有培養基的配制PH均為5. 6 6. 5，瓊脂均為0. 7 0. 8%。 其中愈傷組織培養基、芽分化培養基、增殖培養基和壯苗培養基中蔗糖含 量為30g/L，生根培養基中蔗糖含量為15g/L;所有培養基的培養條件為 溫度23 27。C，每天光照12小時，光照強度1500 2000 Lx。實施例2(1) 外植體的處理采集喜樹幼嫩的葉作為外植體，用濃度為75%的酒 精消毒5秒后，用無菌水沖洗3次，再用濃度為0. 1%的升汞消毒5分鐘后， 用無菌水沖洗5次，然后用無菌濾紙吸干水份；(2) 愈傷組織培養將消毒后的幼嫩葉切兩兩半，接種于 B5+2， 4-D1. 5mg/L+KT0. 5mg/L的愈傷組織培養基中進行培養；(3) 多倍體誘導將愈傷組織浸泡于已過濾滅菌的秋水仙堿溶液中30 小時，溶液濃度為300mg/L，然后用無菌水沖洗3 4次，再轉移到不含秋 水仙堿的MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 2mg/L的芽分化培養基上暗培養7天后，轉入光照培養，光照強度為1500 2000 Lx，每天光照12小時；(4) 多倍體鑒定取生長50天后的不定芽于濃度為0. 2%的秋水仙素溶 液中預處理2.3小時后，用水沖洗，然后用按3:1的體積比配制的甲醇一 冰醋酸固定液固定4小時，再用纖維素酶和果膠酶各占2.5%的混合酶在 25'C恒溫箱內處理3.2小時，倒去酶液，用蒸餾水沖洗3次，每次2分鐘， 再去除蒸餾水，制備細胞懸液，并用懸滴法制片，待干燥后用改良苯酚品 紅染色后觀察，如染色體的數目均為2r^4x^8，則確定為四倍體不定芽；(5) 多倍體苗的培養將具有四倍體特的不定芽轉入增殖培養基 MS+NAA0. 5mg/L+6-BA 1. 0mg/L中分化出四倍體叢生芽，再將生長2cm以上 的叢生芽分割為單株，轉入壯苗培養基MS+NAAO. 05mg/L+6-BAO. 3mg/L中培 養，然后選擇生長健壯的無根苗接種于生根培養基1/2MS+NAA0. 2mg/L+IBA 1. Omg/L中，培養出喜樹四倍體組培苗；(6) 煉苗和移栽當四倍體組培苗長至3cm以上時，打開瓶蓋，在室 內煉苗4天后移栽至滅過菌的珍珠巖一田土 (3:7)的基質上，先用薄膜封蓋， 適當遮光，保持相對濕度在75 85%。組培苗生長健壯，成活率可達96%。本實施例中所有每養基的配制Wi均為5. 6 6. 5，瓊脂均為0. 7 0. 8%， 其中愈傷組織培養基、芽分化培養基、增殖培養基和壯苗培養基中蔗糖含 量為30g/L，生根培養基中蔗糖含量為15g/L;所有培養基的培養條件為-溫度23 27。C、每天光照12小時、光照強度1500 2000 Lx。
權利要求
1.一種喜樹多倍體的誘導方法，其特征在于選取喜樹的莖或葉作為外植體，并進行消毒處理；將消毒后的外植體接種于愈傷組織培養基中進行培養；再將培養后的愈傷組織置于濃度為100mg/L～500mg/的秋水仙堿溶液中浸泡12～48h，然后用無菌水進行沖洗，再轉移到不含秋水仙堿的芽分化培養基上暗培養7天后，轉入光照培養；待不定芽生長50天后對其進行多倍體鑒定，選取具有四倍體特征的不定芽轉入增殖培養基中產生四倍體叢生芽，再將生長2cm以上的叢生芽分割為單株，轉入壯苗培養基中進行培養，然后選擇生長健壯的無根苗接種于生根培養基中，培養出喜樹四倍體組培苗，當組培苗長至3cm以上時，打開瓶蓋，在室內煉苗3～5天后，移栽到滅過菌的珍珠巖——田土的基質上。上述愈傷組織培養基為B5+NAA0～1mg/L+2，4-D0.5～2mg/L+KT0.5mg/L；上述芽分化培養基為MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.2mg/L；上述增殖培養基為MS+NAA0.1～0.5mg/L+6-BA1.0mg/L；上述壯苗培養基為MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.3mg/L；上述生根培養基為1/2MS+NAA0.1～0.3mg/L+IBA1.0mg/L；上述所有培養基的配制PH均為5.6～6.5，瓊脂均為0.7～0.8％，其中愈傷組織培養基、芽分化培養基、增殖培養基和壯苗培養基中蔗糖含量為30g/L，生根培養基中蔗糖含量為15g/L；上述所有培養基的培養條件為溫度23～27℃、每天光照12小時、光照強度1500～2000Lx。
2. 根據權利要求1所述的一種喜樹多倍體的誘導方法，其特征在于 多倍體的鑒定方法是取生長50天后的不定芽于0. 2%秋水仙素溶液中預處理 2.3 2.7小時后，用水沖洗，然后用重量比為3:1的甲醇一冰醋酸固定液固定3. 5 4. 5小時，接著用纖維素酶和果膠酶各占2. 5%的混合酶在25°C 恒溫箱內處理2.8 3.2小時，倒去酶液，用蒸餾水沖洗2 3次，每次2 分鐘，再去除蒸餾水，制備細胞懸液，并用懸滴法制片，待干燥后用改良 苯酚品紅染色后觀察，如染色體的數目均為2n=4x=88，則確定為四倍體不 定芽。
3. 根據權利要求1或2所述的一種喜樹多倍體的誘導方法，其特征在 于外植體消毒所采用消毒液為濃度是70%-75%的酒精和濃度是0. 1%的升 汞。
4. 根據權利要求1或2所述的一種喜樹多倍體的誘導方法，其特征在 于珍珠巖一田土的基質中珍珠巖與田土的配比為為3:7，組培苗移栽至珍 珠巖一田土的基質后，應適當遮光，并保持相對濕度在75 85%。
5. 根據權利要求3所述的一種喜樹多倍體的誘導方法，其特征在于 珍珠巖一田土的基質中珍珠巖與田土的配比為為3:7，組培苗移栽至珍珠巖 一田土的基質后，應適當遮光，并保持相對濕度在75 85%。
全文摘要
本發明公開了一種喜樹多倍體的誘導方法，該方法包括的步驟是①選取喜樹的莖或葉作為外植體并進行消毒處理；②愈傷組織的培養；③多倍體的誘導及對誘導后的愈傷組織進行芽分化培養；④多倍體的鑒定；⑤多倍體苗的培養；⑥煉苗及移栽。該方法通過對喜樹植物進行多倍體誘導，可以培育出喜樹堿含量高的喜樹四倍體組培苗，從而滿足人們對喜樹堿類抗癌藥物的大量需求。
文檔編號A01H4/00GK101243773SQ200810044988
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月14日 優先權日2008年3月14日
發明者劉碧崇, 孫雁霞, 張海強, 徐作英, 王躍華, 鄔曉勇 申請人:成都大學