本發明涉及植物育種
技術領域：
，具體地，涉及一種甜葉菊四倍體的培育方法。
背景技術：
：甜葉菊為菊科宿根多年生草本植物，原產地在南美亞熱帶地區。甜葉菊的根、莖、葉中含有甜菊糖甙。甜菊糖甙具有高甜度（為蔗糖的200~300倍），低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特點，并有提高血糖、降低血壓，促進新陳代謝的作用，對肥胖癥、糖尿病、心臟病、齲齒等有一定的輔助作用，因而日益引起人們的關注和重視，成為繼蔗糖、合成糖料后的“第三糖源”。多倍體育種是植物新品種培育的重要手段，多倍體育種起源于20世紀初，現在已廣泛應用于植物新品種的培育中。多倍體由于基因組倍性的增加，往往表現出形態上的巨大性和抗性增強等特點，藥用活性成分含量增加，同時增強了多倍體植株的生態適應性和對逆境的抗逆性。目前，人工誘導多倍體的方法分為物理方法、生物技術方法和化學方法。物理方法是指采用物理方法如溫度的激變、機械創傷、離心力、紫外線、滲透壓改變等誘導產生多倍體植株，但這類方法存在嵌合率高，危險性較大，誘導率低等缺點，逐漸被淘汰。生物技術法是指通過細胞融合、遠緣雜交等方法獲得多倍體，該方法還處于探索階段，技術還不夠成熟，但應用前景非常廣闊。化學誘導法分為原位誘導法和離體誘導法。其中，原位誘導法即把植物種子、生長的幼苗、莖尖在非離體條件下通過誘導劑處理，誘導染色體加倍的方法；離體誘導法是通過組織培養，在離體水平上誘導細胞內染色體加倍，從而獲得多倍體植株的方法，該方法誘導率高、重復性強、實驗條件易于控制、獲得的多倍體嵌合率低等特點，具有較好的應用前景。隨著社會發展，人們對健康的關注越來越高，甜葉菊的需求量也會越來越大，不僅應用于醫藥領域，也是人們鐘愛的飲品。由于甜葉菊的藥用和保健作用被廣泛認識，甜葉菊的市場需求量大增，而甜葉菊的目前狀況生產率較低，按照常規種植方法滿足不了市場需求。結合多倍體誘導技術應用于甜葉菊的研究，現有技術鮮有報道，因此尋求一種操作簡單、效果好的甜葉菊多倍體培養方法具有一定的經濟意義和社會應用價值。技術實現要素：為解決現有技術中甜葉菊生產率低、常規生長滿足不了市場需求的技術問題，本發明提供一種甜葉菊四倍體的培育方法，所述方法培育出的甜葉菊四倍體植株由于染色體的加倍，其藥效成分顯著增加，植株生長健壯，具有較廣闊的應用前景。本發明解決技術問題采用如下技術方案：本發明涉及一種甜葉菊四倍體的培育方法，所述培育方法包括以下步驟：（1）選材：選取生長健壯長勢良好的甜葉菊植株的種子；（2）種子處理：將甜葉菊種子，經清洗、消毒后將種子在無菌培養基皿內剪開，取出種胚進行無菌培養，使種胚萌發為綠色種胚原球莖；（3）誘導培養：將原球莖接種于添加有二甲基亞砜和秋水仙素的出芽誘導培養基上進行誘導一次培養3~5天，再轉移到僅含秋水仙素的培養基上進行誘導二次培養4~6h，再轉移到不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基上進行培養15~20天，即得到所述甜葉菊四倍體植株。優選地，所述步驟（2）中清洗、消毒的步驟包括：將種子置于洗潔精浸泡15~20分鐘，清洗干凈后置于體積分數為75%的酒精中，于超聲波條件下消毒10~20秒，最后用無菌水清洗3~5次。優選地，所述步驟（2）中無菌培養的步驟包括：將種胚分散在少量無菌水中，用吸管吸取含種胚的無菌水，將其接種到B5+NAA0.2mg/L的培養基上，于25~30℃條件下，遮光培養7~10天，轉為光照培養25~30天。優選地，所述步驟（3）中二甲基亞砜在培養基中含量為3%~5%。優選地，所述步驟（3）中秋水仙素的質量分數為0.02%~0.2%。優選地，所述步驟（3）中第一次誘導培養的培養基配方MS+6-BA0.2~0.6mg/L+TDZ0.3~0.8mg/L，培養溫度25~28℃，光照強度2500~3000Lux；第二次誘導培養基配方均為MS+6-BA0.2~0.6mg/L+TDZ0.3~0.8mg/L，培養溫度15~18℃，遮光培養。優選地，所述步驟（3）中不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基配方為MS+6-BA0.2~0.4mg/L+TDZ0.3~0.6mg/L，培養溫度25~28℃，光照強度2500~3000Lux。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：采用本發明所述的甜葉菊四倍體的培育方法，培育出的甜葉菊四倍體植株由于染色體的加倍，使得甜葉菊具有較高的藥用成分，能大大提高甜葉菊糖苷的產率，且培育出的多倍體植株，生長健壯。此外，所述培育方法比較簡單、穩定，環境友好，適合工業化生產，具有較廣闊的應用前景。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1：本實施例涉及一種甜葉菊四倍體的培育方法，所述培育方法包括以下步驟：（1）選材：選取生長健壯長勢良好的甜葉菊植株的種子；（2）種子處理：將甜葉菊種子置于洗潔精浸泡15分鐘，清洗干凈后置于體積分數為75%的酒精中，于超聲波條件下消毒15秒，最后用無菌水清洗3次；經清洗、消毒后將種子在無菌培養基皿內剪開，將種胚分散在少量無菌水中，用吸管吸取含種胚的無菌水，將其接種到B5+NAA0.2mg/L的培養基上，于25~30℃條件下，遮光培養10天，轉為光照培養28天進行無菌培養，使種胚萌發為綠色種胚原球莖；（3）誘導培養：將原球莖接種于添加培養基中含量為3%二甲基亞砜和質量分數為0.1%秋水仙素的誘導培養基上進行誘導一次培養3天，再轉移到僅含秋水仙素的培養基上進行誘導二次培養5h，再轉移到不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基上進行培養20天，即得到所述甜葉菊四倍體植株。其中，第一次誘導培養的培養基配方MS+6-BA0.4mg/L+TDZ0.6mg/L，培養溫度28℃，光照強度2500~3000Lux；第二次誘導培養基配方均為MS+6-BA0.4mg/L+TDZ0.6mg/L，培養溫度16℃，遮光培養；不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基配方為MS+6-BA0.3mg/L+TDZ0.5mg/L，培養溫度25~28℃，光照強度2500~3000Lux。取培養得到的甜葉菊植株細胞組織染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數，選取染色體數目2n=4x=44的幼苗，是培育成功的四倍體。實施例2：本發明涉及一種甜葉菊四倍體的培育方法，所述培育方法包括以下步驟：（1）選材：選取生長健壯長勢良好的甜葉菊植株的種子；（2）種子處理：將甜葉菊種子置于洗潔精浸泡15分鐘，清洗干凈后置于體積分數為75%的酒精中，于超聲波條件下消毒20秒，最后用無菌水清洗5次；經清洗、消毒后將種子在無菌培養基皿內剪開，將種胚分散在少量無菌水中，用吸管吸取含種胚的無菌水，將其接種到B5+NAA0.2mg/L的培養基上，于25℃條件下，遮光培養7天，轉為光照培養30天進行無菌培養，使種胚萌發為綠色種胚原球莖；（3）誘導培養：將原球莖接種于添加培養基中含量為3%二甲基亞砜和質量分數為0.02%秋水仙素的誘導培養基上進行誘導一次培養5天，再轉移到僅含秋水仙素的培養基上進行誘導二次培養6h，再轉移到不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基上進行培養15天，即得到所述甜葉菊四倍體植株。其中，第一次誘導培養的培養基配方MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.3mg/L，培養溫度25℃，光照強度2500~3000Lux；第二次誘導培養基配方均為MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.3mg/L，培養溫度15℃，遮光培養；不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基配方為MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.3mg/L，培養溫度25℃，光照強度2500~3000Lux。取培養得到的甜葉菊植株細胞組織染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數，選取染色體數目2n=4x=44的幼苗，是培育成功的四倍體。實施例3：本發明涉及一種甜葉菊四倍體的培育方法，所述培育方法包括以下步驟：（1）選材：選取生長健壯長勢良好的甜葉菊植株的種子；（2）種子處理：將甜葉菊種子置于洗潔精浸泡20分鐘，清洗干凈后置于體積分數為75%的酒精中，于超聲波條件下消毒10秒，最后用無菌水清洗5次；經清洗、消毒后將種子在無菌培養基皿內剪開，將種胚分散在少量無菌水中，用吸管吸取含種胚的無菌水，將其接種到B5+NAA0.2mg/L的培養基上，于30℃條件下，遮光培養10天，轉為光照培養25天進行無菌培養，使種胚萌發為綠色種胚原球莖；（3）誘導培養：將原球莖接種于添加培養基中含量為5%二甲基亞砜和質量分數為0.2%秋水仙素的誘導培養基上進行誘導一次培養3天，再轉移到僅含秋水仙素的培養基上進行誘導二次培養4h，再轉移到不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基上進行培養20天，即得到所述甜葉菊四倍體植株。其中，第一次誘導培養的培養基配方MS+6-BA0.6mg/L+TDZ0.8mg/L，培養溫度28℃，光照強度2500~3000Lux；第二次誘導培養基配方均為MS+6-BA0.6mg/L+TDZ0.8mg/L，培養溫度18℃，遮光培養；不含二甲基亞砜和秋水仙素的培養基配方為MS+6-BA0.4mg/L+TDZ0.6mg/L，培養溫度28℃，光照強度2500~3000Lux。取培養得到的甜葉菊植株細胞組織染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數，選取染色體數目2n=4x=44的幼苗，是培育成功的四倍體。將上述培育制得的四倍體甜葉菊植株，按照常規方法制成甜葉菊粗粉，并取50g粗粉進行甜葉菊糖苷提取，最后獲得甜葉菊糖苷的收率見下表。多糖含量/%實施例120.35實施例219.93實施例320.08對比例111.72其中，對比例1為從常規甜葉菊植株上選取甜葉菊葉，經粉碎后得到的甜葉菊粗粉。通過上述對比，可以很清楚的判定本發明所述的方法所培育出的甜葉菊中糖苷含量明顯高于常規甜葉菊植株中糖苷的含量，本發明具有較好的應用前景。采用本發明所述的甜葉菊四倍體的培育方法，培育出的甜葉菊四倍體植株由于染色體的加倍，使得甜葉菊具有較高的藥用成分，能大大提高甜葉菊糖苷的產率，且培育出的多倍體植株，生長健壯。此外，所述培育方法比較簡單、穩定，環境友好，適合工業化生產，具有較廣闊的應用前景。以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。當前第1頁1 2 3