本發明涉及一種丹參組織培養中愈傷組織誘導工藝。
背景技術：
丹參(salviamiltiorrhizabunge)又名赤參，紫丹參，紅根等，是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物。丹參作為一傳統中藥在我國沿用已久，始載于《神農本草經》，被列為上品。《本草經疏》、《本草綱目》中都有記載。具有活血散淤、消腫止血、消炎止痛、調經止痛、擴張冠狀動脈、改善心肌缺血狀況、降低血壓、安神靜心、降血糖和抗菌等功效；對月經不調，經閉痛經，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛等病癥有一定的療效。此外，丹參還具有抗血小板凝聚、降低血液黏度及調節內外凝血系統的功能，是一種安全又可靠的治療心臟血管疾病的天然中藥。丹參主要含兩類成分：一為脂溶性的二萜類化合物，二為水溶性的多聚酚酸類成分。
丹參的繁殖方式一般為種子繁殖和分根繁殖，種子萌發率比較低，分根繁殖出芽率及長勢比較低。通過現代實驗技術組織培養技術，又叫離體培養，指從丹參植物體分離出符合需要的組織。器官或細胞，原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養以獲得再生的完整植株的技術，在培養過程中從各器官上產生愈傷組織的培養，愈傷組織再經過再分化形成再生植物。
隨著丹參研究的更加深入，需要進行合適的愈傷組織誘導，更好的實現組織培養技術繁殖丹參，而現有的丹參組織培養其長勢、大小、顏色以及質地等都未達到最佳，并且影響后續培養的效果。
技術實現要素：
針對上述存在的問題，本發明旨在提供丹參組織培養中愈傷組織誘導工藝，本發明通過優化丹參組織培養過程中愈傷組織的誘導工藝，提高丹參外植體愈傷組織誘導速率、長勢、質地等。naa和2，4-d濃度降低，有利于愈傷組織誘導率增加，培養條件優化，愈傷組織增值生長旺盛，整體愈傷組織誘導技術工藝優化，使得誘導出的愈傷組織質地緊密，顏色黃綠色，用來轉接繼代培養比較適合。
為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：
丹參組織培養中愈傷組織誘導工藝，包括以下步驟：
1)外植體取樣：取丹參嫩幼葉片，進行篩分，通過清洗設備對丹參嫩幼葉片進行清理，后用純水沖洗干凈；
2)外植體消毒：沖洗干凈的外植體放置于75％酒精中浸泡10-20s，勻速震蕩，接著轉入無菌水中沖洗3次，再用0.1％升汞浸泡消毒4-6min，過程中繼續震蕩，然后轉入無菌水中沖洗3-5遍；
3)外植體處理：將消毒后的丹參葉片外植體放置于無菌接種盤上，用無菌解剖針固定，經無菌解剖刀片切成小碎片，避開葉柄和主葉脈；
4)外植體接種：采用無菌鑷子將上述小碎片鑷起，放置于ms固體培養基上，其培養基成分為ms+1.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+0.8mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8，高壓滅菌；
5)外植體培養：接種后的外植體放置于培養箱中進行愈傷組織誘導，15天后開始統計愈傷組織誘導率、質地、顏色和生長情況。
作為優選，所述步驟(1)中的清洗設備包括清洗槽、進水管、出水管以及旋轉清洗軸，所述旋轉清洗軸設置在所述清洗槽內，在所述旋轉清洗軸的外周上等間距設置若干清洗軟毛刷。
作為優選，在清洗之前對清洗軟毛刷進行消毒處理。
作為優選，所述步驟(3)中的經無菌解剖刀片切成0.5cm×0.5cm大小的小碎片。
作為優選，所述步驟(5)中的培養條件為：培養溫度(27±0.5℃)，光照時間12-14h，光強3000-4000lx，t5植物培養燈管。
本發明的有益效果是：與現有技術相比，本發明的改進在于提出丹參愈傷組織誘導工藝，以及對該誘導工藝中培養基成分以及培養條件的改進，使得通過優化丹參組織培養過程中愈傷組織的誘導工藝，提高丹參外植體愈傷組織誘導速率、長勢、質地等。naa和2，4-d濃度降低，有利于愈傷組織誘導率增加，培養條件優化，愈傷組織增值生長旺盛，整體愈傷組織誘導技術工藝優化，使得誘導出的愈傷組織質地緊密，顏色黃綠色，用來轉接繼代培養比較適合。
具體實施方式
為了使本領域的普通技術人員能更好的理解本發明的技術方案，下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步的描述。
實施例：，丹參組織培養中愈傷組織誘導工藝，包括以下步驟：
1)外植體取樣：取丹參嫩幼葉片，進行篩分，通過清洗設備對丹參嫩幼葉片進行清理，后用純水沖洗干凈；
清洗設備包括清洗槽、進水管、出水管以及旋轉清洗軸，所述旋轉清洗軸設置在所述清洗槽內，在所述旋轉清洗軸的外周上等間距設置若干清洗軟毛刷，在清洗之前對清洗軟毛刷進行消毒處理，同時也可對旋轉清洗軸進行消毒處理，旋轉清洗軸由電機控制旋轉，在清洗槽的水平面上設置格柵，格柵的口徑大小小于丹參嫩幼葉片，旋轉清洗軸設置在格柵下面，格柵的一端鉸接在清洗槽上，另一端可以任意上下移動，使得丹參嫩幼葉片更加方便的浸入到清洗槽內，這樣在清洗的過程中就能將丹參嫩幼葉片全部浸沒在水中進行清洗，而且在清洗的過程中配合軟毛刷的作用使得清洗更加的徹底，為后續的無菌、無毒培養提供基礎；
2)外植體消毒：沖洗干凈的外植體放置于75％酒精中浸泡10-20s，過程中不斷勻速震蕩，增加酒精與外植體的接觸面積；接著轉入無菌水中沖洗3次，再用0.1％升汞浸泡消毒4-6min，過程中繼續勻速震蕩，然后轉入無菌水中沖洗3-5遍；
現有技術是75％酒精浸泡0.5-1min，之后沒有轉入無菌水中，0.1％升汞浸泡消毒10-13min，消毒過程優化酒精與升汞消毒時間，降低了外植體污染和褐化的概率；
3)外植體處理：將消毒后的丹參葉片外植體放置于無菌接種盤上，用無菌解剖針固定，經無菌解剖刀片切成0.5cm×0.5cm大小的小碎片，避開葉柄和主葉脈，避開葉柄和主葉脈可以提高愈傷組織誘導的概率；
4)外植體接種：采用無菌鑷子將上述小碎片鑷起，放置于ms固體培養基上，其培養基成分為ms+1.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+0.8mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8，高壓滅菌；培養基成分與現有的愈傷組織誘導技術有區別，是提高丹參外植體愈傷組織誘導速率、長勢、質地的主要因素；
5)外植體培養：接種后的外植體放置于培養箱中進行愈傷組織誘導，15天后開始統計愈傷組織誘導率、質地、顏色和生長情況；培養條件：培養溫度(27±0.5℃)，光照時間12h-14，光強3000-4000lx，t5植物培養燈管，培養條件優化，愈傷組織增值生長旺盛，使得誘導出的愈傷組織質地緊密，顏色黃綠色，用來轉接繼代培養比較適合。
與現代組織培養中愈傷組織誘導培養相比，本發明的優勢在于，
本發明通過優化丹參組織培養過程中愈傷組織的誘導工藝，提高丹參外植體愈傷組織誘導速率、長勢、質地等。naa和2,4-d濃度降低，有利于愈傷組織誘導率增加，培養條件優化，愈傷組織增值生長旺盛，整體愈傷組織誘導技術工藝優化，使得誘導出的愈傷組織質地緊密，顏色黃綠色，用來轉接繼代培養比較適合。
在具體實驗過程中，本發明以丹參葉片為外植體，通過不同激素不同的濃度梯度得到愈傷形成的最佳激素濃度配比。
實驗過程中，單獨使用naa誘導愈傷形成，結果發現低濃度的naa(低于0.8mg/l)15天后觀察發現愈傷形成速度慢，僅葉片邊緣形成少量愈傷，而高濃度的naa(高于0.8mg/l)雖然能夠形成完整愈傷，但是愈傷生長狀況較差，且長出許多黑色不定根，不利于后期的誘導分化；
表1：不同濃度naa對丹參葉片形成愈傷的影響
上述實驗證明低濃度的2,4-d(低于0.8mg/l)愈傷生長后期會長出許多透明狀須根，而高濃度的2,4-d(高于0.8mg/l)15天后觀察形成的愈傷褐化現象比較嚴重。
表2：不同濃度2,4-d對丹參葉片形成愈傷的影響
此外，為了更好達到實驗效果，本發明將6-ba、naa、2,4-d組合使用形成不同濃度配比，14天后觀察愈傷形成情況，結果表明6-ba濃度為1.0mg/l，naa濃度為0.8mg/l，2,4-d濃度為0.8mg/l混合使用時，形成愈傷效果最好。
表3：不同濃度激素組合對丹參葉片形成愈傷的影響
外植體培養結果：
表4：外植體愈傷組織誘導工藝優化前后培養結果
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。