水牛卵母細胞玻璃化冷凍預處理方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍保存領域，尤其涉及一種水牛卵母細胞 玻璃化冷凍預處理方法。
【背景技術】
[0002] 水牛是我國南方寶貴的家畜品種資源，被聯合國糧農組織認為是最具開發潛力和 開發價值的家畜之一。水牛奶的蛋白質、脂肪、微量元素等含量均高于黑白花牛奶，故其高 端奶制品更具競爭力。然而，我國水牛的繁殖率低成為制約水牛奶業發展的一大障礙，急需 應用先進的生物繁殖技術進行改良，但這些技術的研宄和開發應用需要大量的卵母細胞。 將水牛卵母細胞進行冷凍保存，可以從根本上解決水牛卵子來源得不到保障的技術難題， 并有助于建立良種水牛卵子庫以保護遺傳資源以及為物種遺傳改良提供機會，獲取更大的 社會效應和經濟效益。
[0003] 1985年Rail首次使用玻璃化冷凍法成功保存了小鼠的胚胎，此后玻璃化冷凍作 為一種新發展的技術不斷得到改善，部分物種的卵母細胞陸續獲得有效保存。雖經多年研 宄，玻璃化冷凍技術在保存卵母細胞方面仍然存在不少障礙。卵母細胞對低溫的敏感性，導 致其玻璃化冷凍后結構以及理化性質的改變，尤其是細胞骨架的損傷。卵母細胞的生長、成 熟和受精需要細胞骨架的參與，玻璃化冷凍易造成微管的解聚和微絲的錯亂分布，從而引 起紡錘體和染色體結構的異常和細胞骨架蛋白的變化，這對卵母細胞凍融后的存活率、發 育率有著嚴重影響。因此，如何降低冷凍對卵母細胞的損傷就成了卵母細胞和胚胎冷凍的 研宄熱點。
[0004] 有文獻表明，細胞松弛素B(簡稱CB)作為細胞骨架穩定劑，使細胞更富有彈性。冷 凍前使用細胞松弛素B預處理能在一定程度上減少微絲和微管的損傷，提高卵母細胞玻璃 化過程中細胞骨架的穩定性。曾有報道證實7. 5yg/mLCB在豬卵母細胞冷凍有明顯的效 果，但有關CB在水牛卵母細胞玻璃化冷凍過程中作用效果的報道很少，僅有的幾篇報道其 結果也常常是矛盾的，得到的結果也未得到進一步驗證，而且其使用濃度都是按照在豬卵 母細胞冷凍的梯度進行試驗。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種水牛卵母細胞玻璃化冷凍預處理方法，以降 低卵母細胞凍融后細胞骨架的損傷，進而提高凍融后卵母細胞的存活率和發育率。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：水牛卵母細胞玻璃化冷凍預處 理方法，在水牛卵母細胞進行玻璃化冷凍前用濃度為4-12yg/mL的細胞松弛素B在培養箱 處理。
[0007] 上述水牛卵母細胞玻璃化冷凍預處理方法，在水牛卵母細胞進行玻璃化冷凍前， 在成熟液中添加濃度為8yg/mL的細胞松弛素B，然后置于培養箱處理30min。
[0008] 針對目前玻璃化冷凍對水牛卵母細胞造成損傷從而導致卵母細胞存活率和發育 率降低的問題，發明人在水牛卵母細胞進行玻璃化冷凍前應用一定濃度的細胞松弛素B進 行預處理。體外試驗證明，細胞松弛素B對水牛成熟卵母細胞的玻璃化冷凍具有顯著性的 保護作用，降低了卵母細胞凍融后細胞骨架的損傷，提高了凍融后卵母細胞的存活率和發 育率。【附圖說明】
[0009] 圖1是不同濃度細胞松弛素B預處理后水牛卵母細胞發育效果細胞圖。
[0010] 圖2是不同濃度細胞松弛素B預處理對水牛成熟卵母細胞凍融后孤雌激活效果影 響的柱狀統計圖，圖中：A:代表差異極顯著，a、b:相同小寫字母代表差異不顯著，不同的代 表差異顯著。
[0011]圖3是應用本發明后水牛成熟卵母細胞的微管和染色體正常、異常和缺失的免 疫熒光染色圖，圖中：水牛卵母細胞在熒光顯微鏡下所見紡錘體結構、染色體形態中，微 管呈綠色，染色體和極體呈紅色；其中：A1-A3:正常的紡錘體結構，染色體排列于赤道板； B1-B3 :紡錘體缺失和皺縮，染色體正常；C1-C3 :紡錘體和染色體分散；D1-D3 :紡錘體散亂、 稀少，染色體異常；E1-E3 :紡錘體消失，染色體異常。
[0012] 圖4是應用本發明后水牛成熟卵母細胞的微絲正常、異常和缺失的免疫熒光染色 圖，圖中：水牛卵母細胞在熒光顯微鏡下所見微絲形態中，微絲呈綠色，染色體和極體呈紅 色；其中：A1-A3:正常的微絲分布；B1-B3:微絲極體處分散；C1-C3 :微絲異常分布細胞周 邊；D1-D3 :微絲減少；E1-E3 :微絲缺失。
[0013] 圖5是應用本發明后水牛成熟卵母細胞的微管蛋白和肌動蛋白在不同處理組的 表達柱狀統計圖，圖中：A、B、C:不同大寫字母代表差異極顯著，相同大寫字母代表差異不 顯著，a:代表差異不顯著。
[0014] 圖6是應用本發明后對水牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍后細胞骨架蛋白影響的電 泳圖，圖中:新鮮對照組；2 :新鮮CB處理組；3 :CB處理冷凍組；4 :直接冷凍組
[0015] 圖7是應用本發明的不同處理組的囊胚及囊胚熒光染色圖，圖中！control為對照 組，CB+Cryotop為CB處理冷凍組組，Cryotop為直接冷凍組組。
【具體實施方式】
[0016] -、試驗材料
[0017] 試驗所用試劑除TCM-199購自Gibco公司外，其他試劑如無特殊說明均購自Sigma 化學公司。
[0018] 主要實驗試劑的配方如下：
[0019] 成熟液：!111-199+26.2臟〇1/1似110)3+5臟〇1/111印68+10%￡05,0.06 §青霉素， 〇.18鏈霉素。用〇.22以111濾膜過濾滅菌，41：保存，使用前添加3%8??、1〇1^/1^?511、 lOyg/mLLH、lyg/mLE2、100ymol/L半胱氨酸、lyg/mLMLT，在CO2培養箱中平衡至少 Ih0
[0020] 2yg/mL細胞松弛素B儲存液：加2. 5mLDMSO溶解5mgCB，充分溶解混勻，過濾， 分裝到Eppendof管，每管10y1，-20度冷凍保存。使用時根據不同的比例用成熟液稀釋， 即可使用。
[0021] 冷凍基礎液：TCM-199+5. 96g/LH印es+1. 25g/LNaHC03+0. 056g/L丙酮酸鈉；
[0022] 平衡液：冷凍基礎液+10 %二甲基亞楓（DMSO)+10 %乙二醇（EG)+20 %FCS+0. 1% PS；
[0023] 冷凍液：冷凍基礎液 +20%DMS0+20%EG+0. 5mol/LSucrose+20%FCS+0.I%PS;
[0024] 解凍液：冷凍基礎液 +0? 5mol/LSucrose+20%FCS+0. 1%PS。
[0025] 所配制試液均用0. 02ym的微孔濾膜進行過濾。
[0026] 二、試驗方法
[0027] 玻璃化冷凍方法參照文獻（LiangYY，etal.Invitrodevelopment ofvitrifiedbuffalooocytesfollowingparthenogeneticactivationand intracytoplasmicsperminjection]?Theriogenology, 2011，75 (9) : 1652-1660)，具體操 作步驟如下：
[0028] (I)卵母細胞的體外成熟：從南寧屠宰場獲得卵巢后，用添加有抗生素的生理鹽 水洗滌2-3次，以除去粘附的血跡，再用剪刀剪去周邊多余的組織，用12號針頭的IOml注 射器抽取卵巢表面直徑為2?6_卵泡中的卵母細胞，用成熟液洗滌3次，在39°C，5%CO2 和最大飽和濕度的培養箱中進行體外成熟培養22?24h。
[0029] (2)細胞松弛素B的預處理：將步驟⑴成熟培養后的卵母細胞，在成熟液中加入 〇. 1 %透明質酸酶輕輕吹打去除周圍的卵丘層，挑選排出第一極體、胞質均勻、飽滿的成熟 卵母細胞。在卵母細胞進行玻璃化冷凍前用不同濃度（〇,4,8,12yg/mL)的細胞松弛素B 在培養箱處理30min。
[0030] (3)冷凍步驟：將步驟（2)處理完畢的卵母細胞進行冷凍。冷凍時將室溫調至 22-24°C。首先，將成熟卵母細胞先移入含有20%FBS的冷凍基礎液（TCM199-Ifepes緩沖 液）中5min，隨后移入冷凍平衡液〇111199-11印68+20%?85+10%二甲基亞砜+10%乙二 醇）中lmin，觀察卵母細胞大體滲透充分后，移入冷凍液（TCM199-Ifepes+20%FBS+20%二 甲基亞砜+20%乙二醇+0.5M蔗糖）中，30s內轉移到冷凍管內，迅速投入液氮。每次操作 卵母細胞數為5個，所帶液體體積〈1yL。卵母細胞的解凍：冷凍后的卵母細胞在液氮保存 1-2天，隨即解凍。將解凍液提前2小時于培養箱預熱。解凍過程均在37的加熱板上進行。 將冷凍管從液氮中取出，將含有卵母細胞端的冷凍管迅速浸入解凍液中，因受熱的作用，卵 母細胞很快排到解凍液中。在解凍液平衡5min，將其移入含有20%FBS的冷凍基礎液中 5min，用含有20%FBS的冷凍基礎液洗滌4-5遍，最后移入含有20%FBS的冷凍基礎液中， 在39°C，5%CO2和最大飽和濕度的培養箱中恢復Ih后進行后續實驗。
[0031] (4)孤雌激活：將凍融恢復后的卵母細胞在離子霉素工作液液滴快速洗2遍，全 部置于含有5ymol/L離子霉素的培養液激活處理5min，經培養液洗滌3次后再移入含 2mmol/l6-DMAP的培養液培養4h，最后經培養液洗滌3次后移入顆粒細胞單層微滴，于 39°C，5%CO2和最大飽和濕度的培養箱中共培養。每隔2天半量更換培養液，培養48h后 檢查分裂率，7-8d記錄囊胚發育率。此步驟用來篩選最優細胞松弛素B的處理濃度。
[0032] (5)免疫熒光染色：從步驟（4)獲得最優細胞松弛素B處理濃度后，進行步驟（3) 方法冷凍，凍融復蘇后的卵母細胞于4%多聚甲醛室溫下固定30min(或4度過夜），隨后將 固定的卵母細胞用洗滌液清洗3-4遍（移液腔輕輕吹打），每遍3-4min。細胞洗滌后放入 透膜液，37°C透膜過夜（10?16h)。透膜完成的卵母細胞在洗滌液中用移液槍輕輕吹打洗 凈，一般為3-4遍，每遍3-4min。之后轉入封閉液于3