專利名稱：用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍保存方法
技術領域：
本發明涉及一種玻璃化冷凍保存方法，具體地說是一種用于家畜克隆的小 量體細胞的玻璃化冷凍保存方法。
背景技術：
自1997年體細胞克隆綿羊"多莉"誕生后，多種體細胞克隆動物紛紛問 世。眾所周知，體細胞克隆研究中，重構胚是一核質雜交體，細胞核來源于供 體細胞，細胞質來源于去核卵母細胞。只有攜帶正常遺傳物質的供體細胞，融 入去核的卵母細胞中后，供核才能在胞質因子的作用下啟動重構胚的卵裂并進 而指導其進行正常的發育。如果供體細胞的遺傳物質異常，融合后則會導致重 構胚卵裂異常，進而使其發育受到阻滯。因此，提供形態良好、核型正常的供 體細胞是核移植實驗獲得成功的先決條件。
由于體細胞只能在一定的代數范圍內進行傳代培養，傳代次數過多可造成 細胞性狀發生改變，將細胞儲于冷凍管中在超低溫(-8(TC或-196°C)環境中 保存可解決這一問題。目前使用的冷凍方法主要有程序冷凍法、分步冷凍法和 玻璃化冷凍法。程序冷凍法使用冷凍儀，在設置的程序下進行批量冷凍，解凍 后各管成活率差異較小，但購買儀器花費較大。分步冷凍法是將冷凍管置于4 。C 10分鐘、-20 °C 30分鐘、-80 °C 16 18小時(或隔夜)，然后放入液 氮中長期儲存。由于此方法不需要冷凍儀，僅需普通冰箱、超低溫冰箱和液氮 罐就可滿足實驗需要，因此廣泛用于各個實驗室。玻璃化冷凍法最早開始用于 早期胚胎和卵母細胞的冷凍保存，是指將裝有胚胎/卵母細胞的載體工具直接 投入液氮中，解凍后成活率高，而且對后期發育能力的損害較輕。但玻璃化冷 凍法存在的問題是高濃度玻璃化冷凍液不可避免地會對卵母細胞造成化學毒
性損傷和滲透壓損傷。因此，科學工作者不斷改進冷凍方法，通過加快冷凍一 解凍速度，縮短卵母細胞與玻璃化溶液的接觸時間，以降低其化學毒性和滲透 壓損傷，將冷凍造成的卵母細胞超微結構的損傷降到最低程度。這些方法包括
電子顯微鏡銅網法(Martino等，1996) 、0PS法(小直徑的開放拉長細管)(Vajta 等，1998)、 SSV法(-150。C的固體表面)(Dinnyes等，2000)和CLV法(小 尼龍環上的CPA薄膜)(Lane等，1999)，其原理都是通過將卵母細胞懸浮 于體積很小的液滴中從而極大的提高降溫速率。但電子顯微鏡銅網法中使用的 電子顯微鏡貴重，購買儀器花費較大；OPS法中由于OPS管都是用0. 25毫升塑 料管手工拉制，所以管徑大小不是很一致，造成冷凍效果的可重復性較差；SSV 法中冷凍的小顆粒很容易丟失；CLV法存在的問題是操作難度較大。
核移植中供體細胞主要有三種來源第一種是直接消化新鮮培養的細胞
(陳大元等，1999);第二種是解凍冷凍保存的細胞，重新接種培養，待細胞 80-100%貼壁匯合后消化使用(Lan等，2006);第三種是直接使用解凍后細胞
(梁素麗等，2007)。這三種來源的細胞都有動物出生，說明三種來源的細胞 在去核的卵胞質中都具有去分化重獲全能性的能力。但使用新鮮培養的細胞工 作量大，而且細胞性狀容易發生改變。因此，研究人員一般傾向使用第二種和 第三種來源的細胞。核移植實驗中，每次操作卵母細胞大都在100個以下。因 此，僅需要準備100個左右攜帶正常遺傳物質的供體細胞就可以滿足試驗需要。 而目前細胞冷凍中每只冷凍管裝有大約1 X 106-5X 106個細胞，若直接使用解 凍后細胞造成細胞的大量浪費；若解凍后重新接種培養又會加大工作量。
發明內容
本發明的技術任務是提供一種用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍 保存方法。
本發明的操作步驟如下 (一)、液體配制
基礎液在100ml細胞培養液(DMEM液)中添加20ml—30ml胎牛血清(V/V) 禾口 0. 5ml—1. 5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎液中添加2ml—4ml乙二醇(V/V)和2ml-一4ml 二甲基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎液中添加30 ml—35 ml乙二醇(V/V)、 30 ml—35ml份二甲基亞砜(V/V)和0. 2-0. 3摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎液中添加0. 25-0. 35摩爾蔗糖；
(二) 、玻璃化冷凍
用6孔培養板培養細胞，待細胞匯合程度為80%-90%時先消化1孔細胞， 用1. 5毫升離心管收集細胞懸液，800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；接著加 入lml玻璃化冷凍液I ，再800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；然后加入0. 5ml 玻璃化冷凍液II，混勻；之后，用移液器吸取2微升細胞懸液轉移到一平皿的 空白處； 一支顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標記線處，立即將顯微玻璃管 投入液氮中儲存；如此反復進行冷凍操作，細胞進入玻璃化冷凍液II的時間控 制在1分鐘內，超過1分鐘，剩余細胞不再作冷凍處理；再消化l孔細胞，重 復前面步驟，直至將所有孔內細胞冷凍保存。
(三) 、解凍
首先在一平皿中放置2ml解凍液，接著從液氮中取出1支顯微玻璃管， 將顯微玻璃管標記線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利用手指的溫 度驅使細胞進入到解凍液中，停留3-5分鐘；之后，用口吸管將細胞轉移到裝 有2 ml基礎液的另一平皿中，停留3-5分鐘；最后將細胞轉移到進行核移植實 驗的平皿中即可。
所述的顯微玻璃管其外徑為1毫米，內徑為0. 75毫米，長為10厘米。 本發明的用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍保存方法與現有技術
相比，具有成本花費低，方法簡單，不需昂貴儀器，而且冷凍保存效果好、解
凍后成活率高的特點。
具體實施方式
實施例1:
牛耳成纖維細胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1) 、配置液體
基礎液在100ml細胞培養液(DMEM液)中添加20ml胎牛血清(V/V) 禾口 0. 5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎液中添加2ml乙二醇(V/V)和2ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎液中添加30 ml乙二醇(V/V)、 30 ml 份二甲基亞砜(V/V)和0.2摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎液中添加0. 25摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養板培養細胞，待細胞匯合程度為85%時先消化1孔 細胞，用1.5毫升離心管收集細胞懸液，1000g離心5分鐘，去上清。接著加 入1毫升玻璃化冷凍液I ，再1000g離心5分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升 玻璃化冷凍液II,混勻。之后，用移液器吸取2微升細胞懸液轉移到一平皿的 空白處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標記線處，立即將顯微玻璃管投入 液氮中儲存；如此反復進行冷凍操作，細胞進入玻璃化冷凍液II的時間控制在
l分鐘內，超過1分鐘，剩余細胞不再作冷凍處理；再消化l孔細胞，重復前 面步驟，直至將所有孔內細胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支 顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅使細胞進入到解凍液中，停留5分鐘。之后，用口吸管將細胞 轉移到裝有2毫升基礎液的另一平皿中，停留5分鐘。最后將細胞轉移到進行 核移植實驗的平皿中即可。
試驗中冷凍牛耳成纖維細胞1 0 0管，解凍后成活率在85%-92%，染色體核 型正常率為95%。 實施例2:
冷凍牛輸卵管上皮細胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1) 、配置液體
基礎液在100ml細胞培養液(DMEM液)中添加30ml胎牛血清(V/V)和 1.5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎液中添加4ml乙二醇(V/V)和4ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎液中添加35 ml乙二醇(V/V)、 35ml份 二甲基亞砜(V/V)和0.3摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎液中添加0. 35摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養板培養細胞，待細胞匯合程度為80%時先消化1孔 細胞，用1. 5毫升離心管收集細胞懸液，800g離心5分鐘，去上清。接著加入 1毫升玻璃化冷凍液I ，再800g離心5分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升玻璃 化冷凍液II，混勻。之后，用移液器吸取2微升細胞懸液轉移到一平皿的空白 處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標記線處，立即將顯微玻璃管投入液氮 中儲存；如此反復進行冷凍操作，細胞進入玻璃化冷凍液II的時間控制在1分 鐘內，超過1分鐘，剩余細胞不再作冷凍處理；再消化l孔細胞，重復前面步 驟，直至將所有孔內細胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支 顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅使細胞進入到解凍液中，停留3分鐘。之后，用口吸管將細胞 轉移到裝有2毫升基礎液的另一平皿中，停留3分鐘。最后將細胞轉移到進行 核移植實驗的平皿中即可。
試驗中冷凍牛輸卵管上皮細胞l 0 0管，解凍后成活率在81%-87%，染色體 核型正常率在90%。 實施例3:
冷凍山羊輸卵管上皮細胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1) 、配置液體
基礎液在100ml細胞培養液(DMEM液)中添加25ml胎牛血清(V/V)和 lml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎液中添加3ml乙二醇(V/V)和3ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎液中添加30 ml乙二醇(V/V)、 30ml份 二甲基亞砜(V/V)和0.25摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎液中添加0. 3摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養板培養細胞，待細胞匯合程度為80%時先消化1孔 細胞，用1.5毫升離心管收集細胞懸液，900g離心7分鐘，去上清。接著加入 1毫升玻璃化冷凍液I ，再900g離心7分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升玻璃 化冷凍液II,混勻。之后，用移液器吸取2微升細胞懸液轉移到一平皿的空白 處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標記線處，立即將顯微玻璃管投入液氮 中儲存；如此反復進行冷凍操作，細胞進入玻璃化冷凍液II的時間控制在1分 鐘內，超過1分鐘，剩余細胞不再作冷凍處理；再消化l孔細胞，重復前面步 驟，直至將所有孔內細胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支 顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅使細胞進入到解凍液中，停留4分鐘。之后，用口吸管將細胞 轉移到裝有2毫升基礎液的另一平皿中，停留4分鐘。最后將細胞轉移到進行
核移植實驗的平皿中即可。
試驗中冷凍山羊輸卵管上皮細胞120管，解凍后成活率在83%-89%，染色 體核型正常率在87%。
實施例4:
冷凍豬耳成纖維細胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1)、配置液體
基礎液在100ml細胞培養液(DMEM液)中添加20ml胎牛血清(V/V)和 1. 5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎液中添加2ml乙二醇(V/V)和4ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎液中添加30 ml乙二醇(V/V)、 35ml份 二甲基亞砜(V/V)和0.3摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎液中添加0. 23摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養板培養細胞，待細胞匯合程度為90%時先消化1孔 細胞，用1.5毫升離心管收集細胞懸液，1000g離心5分鐘，去上清。接著加 入1毫升玻璃化冷凍液I ，再1000g離心5分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升 玻璃化冷凍液II，混勻。之后，用移液器吸取2微升細胞懸液轉移到一平皿的 空白處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標記線處，立即將顯微玻璃管投入 液氮中儲存；如此反復進行冷凍操作，細胞進入玻璃化冷凍液II的時間控制在 l分鐘內，超過1分鐘，剩余細胞不再作冷凍處理；再消化l孔細胞，重復前 面步驟，直至將所有孔內細胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支
顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅使細胞進入到解凍液中，停留3分鐘。之后，用口吸管將細胞 轉移到裝有2毫升基礎液的另一平皿中，停留5分鐘。最后將細胞轉移到進行 核移植實驗的平皿中即可。
試驗中冷凍豬耳成纖維細胞90管，解凍后成活率在68%-75%，染色體核型 正常率在85%。
權利要求
1、用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍保存方法，其特征在于該方法的具體步驟如下(一)、液體配制基礎液在100ml細胞培養液(DMEM液)中添加20ml-30ml胎牛血清(V/V)和0.5ml-1.5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic)；玻璃化冷凍液I在100ml基礎液中添加2ml-4ml乙二醇(V/V)和2ml-4ml二甲基亞砜(V/V)；玻璃化冷凍液II在100ml基礎液中添加30ml-35ml乙二醇(V/V)、30ml-35ml份二甲基亞砜(V/V)和0.2-0.3摩爾海藻糖；解凍液在100ml基礎液中添加0.25-0.35摩爾蔗糖；(二)、玻璃化冷凍用6孔培養板培養細胞，待細胞匯合程度為80％-90％時先消化1孔細胞，用1.5毫升離心管收集細胞懸液，800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；接著加入1ml玻璃化冷凍液I，再800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；然后加入0.5ml玻璃化冷凍液II，混勻；之后，用移液器吸取2微升細胞懸液轉移到一平皿的空白處；一支顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標記線處，立即將顯微玻璃管投入液氮中儲存；如此反復進行冷凍操作，細胞進入玻璃化冷凍液II的時間控制在1分鐘內，超過1分鐘，剩余細胞不再作冷凍處理；再消化1孔細胞，重復前面步驟，直至將所有孔內細胞冷凍保存；(三)、解凍首先在一平皿中放置2ml解凍液，接著從液氮中取出1支顯微玻璃管，將顯微玻璃管標記線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利用手指的溫度驅使細胞進入到解凍液中，停留3-5分鐘；之后，用口吸管將細胞轉移到裝有2ml基礎液的另一平皿中，停留3-5分鐘；最后將細胞轉移到進行核移植實驗的平皿中即可。
2、根據權利要求1所述的用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍保存 方法，其特征在于所述的顯微玻璃管其外徑為1毫米，內徑為0.75毫米，長 為IO厘米。
全文摘要
本發明公開了一種用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍保存方法，屬于玻璃化冷凍保存領域。該方法的操作步驟如下(一)液體配制；(二)玻璃化冷凍；(三)解凍。本發明的用于家畜克隆的小量體細胞的玻璃化冷凍保存方法與現有技術相比，具有成本花費低，方法簡單，不需昂貴儀器，而且冷凍保存效果好、解凍后成活率高的特點。
文檔編號C12N5/06GK101338299SQ20081013880
公開日2009年1月7日 申請日期2008年7月29日 優先權日2008年7月29日
發明者萬發春, 劉曉牧, 吳乃科, 宋恩亮, 偉 游, 譚秀文 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所