專利名稱：重構、靶向半胱天冬酶基因的制備及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的基因工程，具體涉及構建具有自發活性的靶向、重構半胱天冬酶基因及其用途，用于殺傷腫瘤細胞。
截至2001年2月，世界各國共批準基因治療臨床方案532項，涉及病人3436人，其中60％以上是針對腫瘤的。許多治療方案在I期臨床實驗中取得了顯著療效，有少數已進入II期甚至III期臨床。但是，這些方案遠不能滿足臨床治療的需要，迄今仍然沒有成熟的基因治療產品問世。
目的基因和受體細胞的選擇是腫瘤基因治療的關鍵環節。目前用于腫瘤基因治療的基因包括細胞因子基因，腫瘤抑制基因，“自殺”基因，以及外源毒素基因等。將上述基因轉化腫瘤細胞并回輸患者，或通過基因修飾淋巴細胞等免疫功能細胞，以增強機體的抗腫瘤免疫反應，或者直接殺傷腫瘤細胞。隨著人們對細胞凋亡機理認識的深入，已有越來越多的研究者試圖通過誘導腫瘤細胞凋亡的途徑治療腫瘤。
基因治療中常用的基因轉移載體分為病毒載體和非病毒載體兩類，前者包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒以及單純皰疹病毒、痘苗病毒等，而后者則有脂質體法、磷酸鈣法、電穿孔法和顯微注射法等可供選擇。一般而言，病毒載體的危險性較大，容易造成非特異性感染，以及基因組插入突變等，而非病毒載體轉化效率較低，因此，將現有病毒載體進行重組改造，降低其毒性和免疫原性，以及提高非病毒載體的基因轉移效率已成當務之急。
另外，基因治療的特異性問題也倍受關注，如何使治療局限于腫瘤組織和細胞，而盡可能少地對正常組織帶來損害，將直接決定基因治療的效率和成敗。目前多采用兩種方法，一是對基因轉移載體進行修飾，使之特異地將治療基因帶入腫瘤細胞；二是使治療基因在腫瘤特異性基因表達調控元件的調控下，專一表達于腫瘤細胞中。但這兩種方法在實際應用中均不理想。
總之，目前尚缺乏能夠高效、特異地殺傷腫瘤細胞，而且盡可能小地對系統帶來毒副作用的基因治療方案。
細胞凋亡是機體細胞在生長發育中或病理狀態下存在的一種自發的程序化的死亡過程。半胱天冬酶(caspase)的切割活化是不同細胞凋亡途徑中共同的下游事件。Caspase在細胞中以酶原形式存在，活化后作用于多種蛋白質底物，引起細胞凋亡。Caspase-3，-6，-7是細胞凋亡最重要的執行分子，它們的活化可以高效地不可逆地誘導細胞凋亡。研究表明，將caspase-3，-6，-7的大小亞基顛倒可以得到具有天然活性的caspase分子。
人原癌基因erbB2/neu/HER2編碼一種1255個氨基酸殘基構成的受體酪氨酸蛋白激酶，屬表皮生長因子樣受體家族。ErbB2蛋白在乳腺癌、卵巢癌及胃癌等多種惡性腫瘤中，由于基因放大、轉錄激活等原因表達水平高出正常細胞上百倍，成為一種重要的腫瘤標記物。
綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)是目前已知的毒性最強的細菌外毒素之一，由假單孢菌屬細菌分泌，分子為包含613個氨基酸的單鏈多肽，由三個主要功能結構域構成Ia(1-252位氨基酸)，主要起細胞識別和結合的作用；其中的第II結構域(253-364位氨基酸)，或253-412位氨基酸，能夠使結合在細胞表面的分子內化進入細胞。
本發明采取的技術方案是1.靶向和重構半胱天冬酶基因及其載體的構建，按以下步驟進行(1)基因克隆與載體構建①培養人淋巴瘤Jurkat細胞，反轉錄PCR獲得半胱天冬酶(caspase)-3，-6，-7基因，并經測序證實；②用重組PCR將上述基因改造成活性蛋白形式，即重構半胱天冬酶的基因；③將上述重構caspase基因依次與PE轉膜結構域序列及抗HER2抗體基因連接，構建靶向半胱天冬酶基因，分別克隆入真核表達載體pCMV和重組腺病毒載體；(2)體外表達和功能檢測實驗①將重構半胱天冬酶基因在體外培養的腫瘤細胞中瞬時表達或誘導表達，研究其促凋亡活性；②把腫瘤靶向半胱天冬酶基因導入體外培養的人細胞系，篩選得到陽性克隆；鑒定細胞分泌的腫瘤靶向半胱天冬酶蛋白；③共培養實驗觀察分泌腫瘤靶向半胱天冬酶的建株細胞對HER-2陽性乳腺癌SKBR-3細胞和卵巢癌SKOV-3細胞的殺傷作用；
其用途是用抗腫瘤表面抗原erbB2/HER2的抗體、PE轉膜結構域和重構型caspase-3構建治療分子——靶向半胱天冬酶，通過以下途徑應用于HER2陽性腫瘤的治療①將重構和靶向半胱天冬酶的重組病毒表達載體，直接注射入腫瘤組織內部，產生抗腫瘤作用；②用帶有前導肽的靶向半胱天冬酶的基因的逆轉錄病毒載體轉化患者的外周血T淋巴細胞，該細胞回輸患者后可以分泌產生靶向重構半胱天冬酶，后者通過血液循環到達腫瘤部位，特異性地殺傷腫瘤細胞，并發揮長期的免疫監視作用；③用與②相似的方法建立能分泌靶向半胱天冬酶的患者腫瘤細胞，通過腫瘤組織局部注射，抑制腫瘤生長；④體外表達和純化靶向半胱天冬酶蛋白，通過靜脈或腫瘤組織局部注射，識別并殺傷腫瘤細胞。
由于被immunocasp-3基因修飾的淋巴細胞本身功能正常，回輸這種細胞將可以持續分泌效應蛋白，加之caspase是細胞凋亡的直接執行者，因此對腫瘤細胞的殺傷作用效率更高；Immunocasp-3效應分子通過抗體特異性地識別腫瘤細胞，同時，2種immunocasp-3均在N端融合長的抗體和PE序列，而且它們之間沒有可能發生切割斷裂的位點，因而推測融合蛋白在通過血液轉移過程中和進入腫瘤細胞前，由于不能正確折疊而不具有caspase-3的活性。另外，immunocasp-3主要由人源化抗體和人自身蛋白構成，不會誘發體內強烈的排異反應，而且細胞發生凋亡時不引起炎癥反應，所以治療的毒副作用較小。本研究可望為HER2陽性腫瘤的靶向基因治療提供一種新思路。
對淋巴細胞進行基因修飾，使之分泌產生能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞的效應分子，這一兼具細胞免疫和體液免疫特點的基因治療策略同其它策略相比，具有明顯的優勢首先，它具有長期持續性，目前采用的基因治療策略，無論是體外修飾并回輸腫瘤細胞，還是病毒載體體內直接感染，都存在治療物在體內半壽期短、治療持續時間有限的缺點。由于基因修飾不影響淋巴細胞的功能，因此回輸這種細胞，將可以持續分泌產生效應分子，從而可以長期發揮免疫監視和殺傷作用。其次，這種治療策略的作用較徹底，將腫瘤特異性殺傷淋巴細胞回輸患者后，細胞能通過血液和淋巴循環到達腫瘤周圍并進入到腫瘤組織內；另外，由于歸巢的作用，這種特異性殺傷細胞能不斷循環到淋巴結中定居，這對于手術無法清除的、經血行轉移到遠處的少量腫瘤細胞，也能有效地識別和殺傷。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例按本發明的技術方案制備靶向重構半胱天冬酶的基因，已用于如下實驗(1)體外實驗靶向重構半胱天冬酶的基因轉染人淋巴瘤Jurkat細胞，并篩選得到陽性克隆，擴大培養發現被轉化的Jurkat細胞生長正常，并檢測到分泌到細胞外的靶向重構半胱天冬酶分子；將這種Jurkat細胞分別與HER2陽性的人卵巢癌SKOV-3細胞和乳腺癌SKBR3細胞，以及不表達HER2的人宮頸癌HeLa細胞共培養，結果表明，共培養24h后HER2陽性細胞即有大量死亡，72h時對SKBR-3和SKOV-3的殺傷率分別達到83.1％和86.4％，而與上述Jurkat細胞共培養的HeLa細胞生長并未受到明顯影響。電鏡、DNA ladder等證實被殺傷細胞發生了凋亡。
(2)動物實驗通過皮下注射建立HER2陽性乳腺癌SKBR-3的裸鼠模型。選取8只荷瘤裸鼠進行實驗，瘤體內注射重構caspase-3的表達載體，與注射空載體的對照組相比，腫瘤生長受到顯著抑制，裸鼠存活期延長，注射后20天剝瘤稱重，平均抑瘤率達到88.1％。
通過靶向半胱天冬酶基因轉化SKBR-3腫瘤細胞，并注射入裸鼠腫瘤部位，或直接注射該酶的重組腺病毒表達載體，初步證實了靶向重組半胱天冬酶的體內抑瘤作用。
應用其它裸鼠腫瘤模型的體內抑瘤實驗實驗正在進行中。
(3)臨床試驗①進行重構半胱天冬酶和靶向半胱天冬酶的重組病毒載體(腺病毒、逆轉錄病毒)的中試生產，同時對產品進行質量控制和安全檢驗，包括重組病毒產品的濃度、純度和生物活性，感染細胞后目的基因的表達，以及其它一系列包括細菌、其它外源病毒和具有復制能力的病毒等在內的產品檢測指標。
②上述產品單獨或結合其它治療方法進行抗腫瘤I期臨床試驗，考察產品的安全性和患者對治療的反應；③選擇更多患者進行II期臨床試驗，進一步研究治療產品的有效性；④應用生物反應器進行大規模無血清懸浮細胞培養和病毒繁殖，產品通過層析純化，并進行灌裝和包裝，使整個生產過程均符合GMP標準。(4)治療方法通過上述研究和開發過程，獲得3種基因治療產品重組腺病毒-重構半胱天冬酶基因注射液(Ad-Rca)，重組腺病毒-靶向半胱天冬酶基因注射液(Ad-Tca)，和表達靶向半胱天冬酶的重組逆轉錄病毒顆粒(Re-Tca)，通過以下途徑之一用于腫瘤治療
①分別用Ad-Rca和Ad-Tca兩種注射液對患者進行腫瘤組織局部注射，實施治療。
②抽取HER2陽性腫瘤(部分乳腺癌、卵巢癌、胃癌和其它一些實體瘤)患者的外周血T淋巴細胞或腫瘤細胞，Re-Tca轉化這些細胞，分離被轉化細胞，將被轉化的淋巴細胞和腫瘤細胞分別通過靜脈注射和瘤內注射回輸至患者體內，實施治療。
臨床試驗和產品開發(1)進行重構半胱天冬酶和靶向半胱天冬酶的重組病毒載體(腺病毒、逆轉錄病毒)的中試生產，同時對產品進行質量控制和安全檢驗，包括重組病毒產品的濃度、純度和生物活性，感染細胞后目的基因的表達，以及其它一系列包括細菌、其它外源病毒和具有復制能力的病毒等在內的產品檢測指標。
(2)上述產品單獨或結合其它治療方法進行抗腫瘤I期臨床試驗，考察產品的安全性和患者對治療的反應。具體試驗方案有如下幾種①將重構和靶向半胱天冬酶的重組病毒表達載體，直接注射入腫瘤組織內部，產生抗腫瘤作用；②用帶有前導肽的靶向半胱天冬酶的基因的逆轉錄病毒載體轉化患者的外周血T淋巴細胞，該細胞回輸患者后可以分泌產生靶向重構半胱天冬酶，后者通過血液循環到達腫瘤部位，特異性地殺傷腫瘤細胞，并發揮長期的免疫監視作用；③用與②相似的方法建立能分泌靶向半胱天冬酶的患者腫瘤細胞，通過腫瘤組織局部注射，抑制腫瘤生長；④體外表達和純化靶向半胱天冬酶蛋白，通過靜脈或腫瘤組織局部注射，識別并殺傷腫瘤細胞。
(3)選擇更多患者進行II期臨床試驗，進一步研究治療產品的有效性；(4)應用生物反應器進行大規模無血清懸浮細胞培養和病毒繁殖，產品通過層析純化，并進行灌裝和包裝，使整個生產過程均符合GMP標準；(5)進行III期臨床試驗，并申請試生產文號和新藥證書。
權利要求
1.靶向和重構半胱天冬酶基因及其載體的構建，按以下步驟進行(1)基因克隆與載體構建①培養人淋巴瘤Jurkat細胞，反轉錄PCR獲得半胱天冬酶(caspase)-3，-6，-7基因，并經測序證實；②用重組PCR將上述基因改造成活性蛋白形式，即重構半胱天冬酶的基因；③將上述重構caspase基因依次與PE轉膜結構域序列及抗HER2抗體基因連接，構建靶向半胱天冬酶基因，分別克隆入真核表達載體pCMV和重組腺病毒載體；(2)體外表達和功能檢測實驗①將重構半胱天冬酶基因在體外培養的腫瘤細胞中瞬時表達或誘導表達，研究其促凋亡活性；②把腫瘤靶向半胱天冬酶基因導入體外培養的人細胞系，篩選得到陽性克隆；鑒定細胞分泌的腫瘤靶向半胱天冬酶蛋白；③共培養實驗觀察分泌腫瘤靶向半胱天冬酶的建株細胞對HER-2陽性乳腺癌SKBR-3細胞和卵巢癌SKOV-3細胞的殺傷作用；其用途是用抗腫瘤表面抗原erbB2/HER2的抗體、PE轉膜結構域和重構型caspase-3構建治療分子——靶向半胱天冬酶，通過以下途徑應用于HER2陽性腫瘤的治療①將重構和靶向半胱天冬酶的重組病毒表達載體，直接注射入腫瘤組織內部，產生抗腫瘤作用；②用帶有前導肽的靶向半胱天冬酶的基因的逆轉錄病毒載體轉化患者的外周血T淋巴細胞，該細胞回輸患者后可以分泌產生靶向重構半胱天冬酶，后者通過血液循環到達腫瘤部位，特異性地殺傷腫瘤細胞，并發揮長期的免疫監視作用；③用與②相似的方法建立能分泌靶向半胱天冬酶的患者腫瘤細胞，通過腫瘤組織局部注射，抑制腫瘤生長；④體外表達和純化靶向半胱天冬酶蛋白，通過靜脈或腫瘤組織局部注射，識別并殺傷腫瘤細胞。
全文摘要
本發明公開了構建具有自發活性的重構半胱天冬酶基因及其用途,用于殺傷腫瘤細胞,通過腫瘤內注射該基因的表達載體,促進腫瘤細胞凋亡。將抗腫瘤表面抗原erbB2/HER2的抗體、綠膿桿菌外毒素(PE)轉膜結構域和重構caspase融合構建靶向重構半胱天冬酶,通過(1)轉化患者外周血T淋巴細胞或腫瘤細胞,回輸患者后分泌產生該酶,(2)腫瘤組織局部注射該酶的重組腺病毒表達載體,(3)純化并注射靶向半胱天冬酶蛋白,識別和殺傷HER2陽性腫瘤細胞。
文檔編號C12N15/79GK1348005SQ0113179
公開日2002年5月8日 申請日期2001年11月14日 優先權日2001年11月14日
發明者楊安鋼, 王成濟, 賈林濤, 許彥鳴, 于翠娟, 張立紅, 彭朝暉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學