通過聯合治療的半胱天冬酶-3酶原激活的制作方法

通過聯合治療的半胱天冬酶-3酶原激活的制作方法
【專利摘要】本發明提供用于誘導細胞死亡例如癌細胞死亡的組合物和方法。公開了化合物的結合物以及相關的使用方法，包括化合物用于治療癌癥以及選擇性誘導細胞凋亡的用途。與其他化合物以及化合物的結合物相比，所公開的藥物結合物具有較低的神經毒性作用。
【專利說明】通過聯合治療的半胱天冬酶-3酶原激活
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求依照35U.S.C. § 119(e)于2012年3月6日提交的第61/607, 098號 美國臨時專利申請的優先權，該臨時專利申請通過引證方式納入本申請。

【背景技術】
[0003]細胞凋亡或程序性細胞死亡在所有多細胞生物的發育和維持穩態過程中起著重 要作用。癌癥的常見標志是抵抗自然的細胞凋亡信號。根據癌癥類型，這種抵抗通常是由于 細胞凋亡級聯反應中關鍵蛋白的上調或下調，或者是由于編碼這些蛋白的基因中的突變。 這些變化在內源性細胞凋亡途徑和外源性細胞凋亡途徑中均有發生，其中內源性凋亡途徑 通過線粒體和半胱天冬酶-9匯集，外源性凋亡途徑涉及死亡受體與半胱天冬酶_8的作用。 例如，已經在癌癥中觀察到了蛋白質--如p53、Bim、Bax、Apaf-1、FLIP和許多其他蛋白 質--的適當水平的改變。這些改變可導致有缺陷的細胞凋亡級聯反應，其中是上游的促 細胞凋亡信號沒有被充分地傳遞以激活執行者半胱天冬酶--半胱天冬酶_3和半胱天冬 酶-7。
[0004] 由于大多數細胞凋亡途徑最終都涉及半胱天冬酶-3酶原的激活，上游的基因異 常可有效地"打斷"細胞凋亡線路，因此，這些細胞非典型地增殖。鑒于細胞凋亡在癌癥中 的重要作用，致力于開發靶向細胞凋亡級聯反應中的特異蛋白質的治療劑。例如，與級聯成 員諸如P53和Bel家族中的蛋白質結合的肽或小分子結合劑，或者與細胞凋亡抑制劑（IAP) 蛋白質家族結合的肽或小分子結合劑，具有促細胞凋亡活性，促進Apaf-1寡聚的化合物也 同樣具有促細胞凋亡活性。然而，因為這些化合物靶向細胞凋亡級聯反應中的早期（或中 間到高）位置，因此，具有影響這些成員的下游蛋白質的突變的癌癥仍然可抵抗這些化合 物的可能的有益效果。
[0005] 對治療目的有利的是識別直接激活細胞凋亡級聯反應中遠端下游（far downstream)的促細胞凋亡蛋白質的小分子。這種方法可涉及級聯反應中相當較低的位置， 因此，使得甚至能夠殺死那些具有影響上游細胞凋亡機器的突變的細胞。此外，如果促細胞 凋亡蛋白質在癌細胞中被上調或者以增加的水平存在于癌細胞中，則這樣的治療策略會具 有較高的成功可能性。因此，靶向細胞凋亡的下游效應物蛋白--半胱天冬酶_3酶原-- 的小分子的識別，將顯著有助于目前的癌癥治療。
[0006]半胱天冬酶-3酶原到半胱天冬酶-3的轉化或激活導致產生活性"執行者"半胱天 冬酶形式，所述活性"執行者"半胱天冬酶形式隨后催化眾多蛋白底物的水解。活化的半胱 天冬酶-3是異源二聚體的同源二聚體，并且是通過半胱天冬酶_3酶原的蛋白酶解產生的。 在體內，這種蛋白酶解激活通常通過半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的作用而發生。為確 保酶原不被過早地激活，半胱天冬酶-3酶原具有12個氨基酸"保險栓（safety catch) "， 其阻止進入蛋白酶解的ETD位點（氨基酸序列，ile-glu-thr-asp)。這種保險栓使得半胱 天冬酶-3酶原能夠抵抗自身催化激活和由半胱天冬酶_9導致的蛋白酶解。突變研究表明 三個連續的天冬氨酸殘基似乎是該保險栓的關鍵成分。保險栓的位置對pH敏感，因此，一 旦發生細胞酸化（如在細胞凋亡過程中發生），保險栓被認為允許進入蛋白酶解的位點，活 性半胱天冬酶-3可通過半胱天冬酶-9的作用或經由自身激活機制而產生。
[0007] 在某些癌癥中，半胱天冬酶-3酶原的水平相對于正常組織是提高的。對來自20 位結腸癌患者的原代分離物（primary isolates)的研究顯示，平均而言，相對于鄰近的非 癌性組織，半胱天冬酶-3酶原在這些分離物中被上調了六倍。此外，在某些神經母細胞瘤、 淋巴瘤和肝癌中，半胱天冬酶-3酶原被上調。而且，在被國立癌癥研究所（NCI)開發治療 項目（Developmental Therapeutics Program)用于癌癥篩選的60個細胞系組（cell-line panel)中進行了半胱天冬酶-3酶原水平的系統性評估，這揭示了某些肺癌、黑素瘤、腎癌 和乳腺癌顯示顯著升高的半胱天冬酶-3酶原表達水平。
[0008] 由于活性半胱天冬酶-3在實現細胞凋亡中的作用，在某些癌性細胞類型中相對 高水平的半胱天冬酶-3酶原以及令人感興趣的保險栓-介導的半胱天冬酶_3酶原自身激 活的抑制，直接修飾半胱天冬酶-3酶原的小分子可在靶向癌癥治療中具有很大應用。
[0009] 聯合治療已經成為治療癌癥患者的標準。聯合治療藥物雞尾酒療法的目的是在化 學治療劑之間實現協同或加和效果，借此有助于縮短治療時間，降低毒性并增加患者存活 率。作用于單一生化途徑的藥物對協同或增強作用而言是特別強有力的候選者，因為，它們 可以模擬"合成致死"基因組合（"synthetic lethal" genetic combinations)。例如， 聚（ADP-核糖）聚合酶-l(PARP-l)(-種促進DNA損傷修復的酶）的抑制劑，有效地與DNA 損傷劑協同作用，如在細胞培養物、動物模型和人體臨床試驗中所證明的。然而，仍需要更 加有效的療法用于治療多種形式的癌癥，抗癌藥物的新的協同組合將有助于該訴求。因此， 需要識別新的細胞毒性劑，它們在殺死癌細胞方面是有效的，同時還保護正常宿主組織免 受細胞毒性劑的不期望的毒性。


【發明內容】

[0010] 本發明主要提供化合物、組合物以及治療處理的方法。在多種實施方案中，本發明 適用于多種癌癥疾病和癌細胞類型，如乳腺癌、淋巴瘤、腎癌、黑素瘤、白血病、神經細胞瘤、 肺癌、腦癌和本領域已知的其他癌癥。本文尤其公開了包括能夠誘導細胞死亡的小分子的 組合物和方法。在一些實施方案中，所述組合物和方法涉及可直接或間接與程序性細胞死 亡途徑成員如半胱天冬酶-3酶原相互作用的化合物。在某些實施方案中，與直接或間接與 程序性細胞死亡途徑成員如半胱天冬酶-3酶原相互作用的其他化合物相比，所述組合物 和方法具有降低的神經毒性。
[0011] 聯合抗癌治療可由靶向不同生化途徑的藥物組成，或者由那些在相同途徑中攻擊 不同靶標的化合物組成，模擬"合成致死"的基因組合。半胱天冬酶-3酶原激活劑PAC-1 和第二活性劑的結合物對于誘導癌細胞的細胞凋亡性死亡已經顯示出相當大的協同作用， 經常達到完全超過加和效果的程度。PAC-1和第二活性劑的結合物可用于有效降低腫瘤模 型中的腫瘤負荷，其中單獨的化合物具有極小的效果或沒有效果。本文中描述的數據顯示 了 PAC-1/第二活性劑結合物用于治療癌癥的效力，更廣義而言，顯示出結合物可協同作用 并提供顯著加強的治療益處。
[0012] 因此，本發明提供一種組合物，其包含：
[0013] (a)化合物 PAC-1:

【權利要求】
1. 一種組合物，包括 (a) 化合物PAC-I:
(b) 第二活性劑，其中所述第二活性劑是依托泊苷、硼替佐米、十字孢堿、多柔比星、他 莫昔芬、順鉬、卡鉬或紫杉醇，以及 (c) 藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
2. 權利要求1的組合物，其中所述載體包括水和任選地緩沖劑、環糊精或其結合物。
3. 權利要求2的組合物，其中所述環糊精是2-羥丙基-P-環糊精。
4. 權利要求1的組合物，其中PAC-I的濃度為約2iiM至約50iiM。
5. 權利要求1的組合物，其中所述第二活性劑的濃度為約25nM至約ImM。
6. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是依托泊苷，并且依托泊苷的濃度為 約 2iiM至約 50iiM0
7. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是硼替佐米，并且硼替佐米的濃度為 約 50nM至約 20iiM。
8. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是十字孢堿，并且十字孢堿的濃度為 約 25nM至約 200nM。
9. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是多柔比星，并且多柔比星的濃度為 約50nM至約5uM。
10. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是他莫昔芬，并且他莫昔芬的濃度 為約5iiM至約50iiM。
11. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是順鉬，并且順鉬的濃度為約5yM 至約150iiM，所述第二活性劑是卡鉬，并且卡鉬的濃度為約5iiM至約150iiM。
12. 權利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是紫杉醇，并且紫杉醇的濃度為約 0. 5nM至約 5nM。
13. -種抑制癌細胞生長或增殖的方法，包括使癌細胞與有效量的權利要求1的組合 物接觸，從而抑制癌細胞生長或增殖。
14. 權利要求13的方法，其中所述癌細胞是淋巴瘤細胞、骨肉瘤細胞、乳腺癌細胞或卵 巢癌細胞。
15. -種在癌細胞中誘導細胞凋亡的方法，包括使癌細胞與有效量的化合物PAC-I和 有效量的第二活性劑接觸，
其中所述第二活性劑是依托泊苷、硼替佐米、十字孢堿、多柔比星、他莫昔芬、順鉬、卡 鉬或紫杉醇；從而在癌細胞中誘導細胞凋亡。
16. 權利要求15的方法，其中所述接觸為在體外。
17. 權利要求15的方法，其中所述接觸為在體內。
18. 權利要求15-17中任一項的方法，其中所述癌細胞與PAC-I和第二活性劑同時接 觸。
19. 權利要求15-17中任一項的方法，其中在所述癌細胞與所述第二活性劑接觸之前 使所述癌細胞與PAC-I接觸。
20. 權利要求15-17中任一項的方法，其中在所述癌細胞與所述第二活性劑接觸之后 使所述癌細胞與PAC-I接觸。
21. -種在有需要的患者中治療癌癥的方法，包括同時或相繼給予患者治療有效量的 化合物PAC-I和有效量的第二活性劑，
其中所述第二活性劑是依托泊苷、硼替佐米、十字孢堿、多柔比星、他莫昔芬、順鉬、卡 鉬或紫杉醇；從而治療癌癥。
22. 權利要求21的方法，其中所述化合物PAC-I和所述第二活性劑同時給藥。
23. 權利要求21的方法，其中所述化合物PAC-I和所述第二活性劑相繼給藥。
24. 權利要求23的方法，其中所述化合物PAC-I在所述第二活性劑之前給藥。
25. 權利要求23的方法，其中所述化合物PAC-I在所述第二活性劑之后給藥。
26. 權利要求21-25中任一項的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤、骨肉瘤或乳腺癌。
27. 權利要求1-10中任一項的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。
28. 權利要求27的用途，其中所述癌癥是淋巴瘤、骨肉瘤、乳腺癌或卵巢癌。
【文檔編號】A61K33/24GK104507479SQ201380023803
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年3月6日 優先權日:2012年3月6日
【發明者】保羅·J·赫甘羅斯爾, 瑞秋·C·博特姆, 蒂莫西·M·范, 馬克·J·吉爾伯特, 邁克爾·K·漢德里, 霍華德·S·羅斯, 索多爾·M·塔拉索 申請人:伊利諾伊大學評議會, 抑制腫瘤公司