專利名稱：以Taq酶對DNA和RNA病原進行同步PCR檢測的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因檢測技術，具體地說，涉及以Taq酶(耐熱DNA聚合酶)對DNA和RNA病原進行同步PCR(聚合酶鏈式反應)快速擴增檢測的方法。
現行的DNA病原的PCR檢測方法多為將樣品前處理后，經過堿、表面活性劑、蛋白酶等降解蛋白質外殼、細胞壁、細胞膜等后，用酚、氯仿-異戊醇抽提分離廢蛋白，上清加醇類和無機鹽沉淀核酸以提取核酸DNA或RNA，然后經過PCR擴增后經過電泳或雜交檢測擴增產物，這一過程大約耗時8～36小時。
1、下面以乙肝病毒(HBV)的血清PCR基因檢測為例取待檢血清100μl加入等體積的蛋白酶K(2mg/ml蛋白酶K溶于0.04molTris、0.01mol EDTA和1％SDS預孵育40℃30分鐘)在40～56℃消化1～3小時，用等體積飽和酚提取1～3次，再用等體積氯仿-異戊醇(24∶1)提取1～3次；高速離心(8000～16000rpm)，取水相加入1/10體積的3mol/L pH5.2的乙酸鈉緩沖液和2～3體積的無水乙醇充分混合，于-20℃放置2小時以上；然后高速離心(8000～16000rpm)回收DNA，沉淀用75％冰冷乙醇離心清洗1～2次，真空干燥，溶于TE緩沖液。取5～10μl進行PCR擴增反應，電泳后觀察結果。
2、至于RNA病原的檢測，模版的制備條件更為苛刻，它需要一套新的不同于DNA病原的試劑系統和操作程序，以丙肝病毒(HCV)的血清RT-PCR檢測為例取待檢血清100ul依次加入2倍體積的GSL消化液(4mol/L異硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉PH7.0、0.5％N-Lauroylsarcosine)、2倍體積用Tris-HCl pH8.0飽和的酚、等體積的水飽和的氯仿-異戊醇，每加一種試劑均應混和充分，反應體系中還要加入RNA酶抑制劑；高速離心取水相，加入1/10體積的3mol/L pH5.2的乙酸鈉緩沖液，再加等體積異丙醇于-20℃放置2小時以上；然后高速離心回收RNA，沉淀用75％冰冷乙醇離心洗滌1～2次，真空干燥，溶于TE緩沖液。取5～10μl用于逆轉錄PCR擴增，添加RNA酶抑制劑后，在逆轉錄酶(AMVRT)的作用下，42～56℃.溫浴30～60分鐘，逆轉錄合成cDNA鏈，再進行PCR擴增，即RT-PCR.，然后電泳觀察結果。
由上述兩個例子可見，傳統方法反應體系和操作程序極為復雜，難于控制，容易出錯，而且要耗費大量時間，浪費大量試劑，極不經濟。
然而，現實的情況是，有些病人的臨床癥狀雖然相似，但引起疾病的病因或病原不同，有的是DNA病原引起，有些是RNA病原引起，有些既有DNA病原也有RNA病原，還有的需要同步檢測多種DNA和RNA病原基因。如果根據現有資料使用引物探針，一種一種地分別進行PCR擴增檢測未免盲目，無異于守株待兔，浪費了大量時間和試劑，病人也因得不到及時的診斷結果耽誤了治療。
本發明的目的是這樣實現的其采用的是蛋白質裂解試劑，該蛋白質裂解試劑組成為1％～10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)、2～20％NP-40、1～10％吐溫-20等表面活性劑與Tris或磷酸緩沖液的兩兩組合，再加入RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC)；取裂解試劑與病理標本共同煮沸5～30分鐘，離心取上清即可同步提取病毒核酸DNA和RNA，以此上清為模板，無需加入逆轉錄酶，利用Taq DNA聚合酶本身的聚合酶活性和逆轉錄活性(其作用類似逆轉錄酶，活性溫度一般為65℃～68℃，在Mn2+存在時，其逆轉錄活性更高的特性)，以提取的病毒核酸為模板直接進行PCR擴增，得到所需的各種目的核酸片斷，經過電泳或雜交認定后達到基因檢測目的。它可以為DNA病原和RNA病原基因進多重PCR(一次反應，加入多對引物，擴增多種基因)擴增后，同步檢測提供一種迅速簡便的方法。檢驗流程為模板制備、PCR擴增、檢測。
本發明具有以下優點和積極效果。
簡化了提取核酸模板和逆轉錄的過程，節省了試劑成本，大大縮短了檢測時間，減少了污染機會，為DNA病毒和RNA病毒的多重PCR技術檢測提供一種新方法。該方法適用于多種疾病病原基因的同步檢測，更能滿足臨床實際的需要。
具體實施例方式
1、實施例一 HBV、HCV病毒核酸同步檢測根據已發布HBV、HCV基因組序列高度保守區設計特異性引物，交給北京賽百盛公司合成。dNTP、TaqDNA聚合酶、10×buffer(擴增緩沖液)均購于華美生物工程有限公司。配置我們自制的蛋白質裂解緩沖液。
HBV上、下游引物分別是P1 5’-ACATACTCTGTGGAAGGCTGGC-3’P2 5’-TATCCCATGAAGTTAAGGGAGTAG-3’擴增片斷長度約430bp。HCV上、下游引物分別是P3 5’-TGCACGGTCTACGAGACCT-3’P4 5’-GCCATGGCGTTAGTATGAGT-3’，擴增片斷長度約260bp。
實驗流程①血樣采集 本實驗血清樣品HBV和HCV共感染的陽性血清由華中科技大學附屬協和醫院提供。
②模板制備 取待檢血清70μl于PCR反應薄壁管中，加入自制的蛋白質裂解緩沖液(2％NP40+0.1×TE)30μl，在100℃煮沸5～15min，然后在臺式心機上15000r/min離心3～10min。收集上清20μl于另一個PCR反應薄壁管中，即為感染病毒核酸模版提取液。
③PCR擴增在收集上清管(20μl)內加入10×buffer 10μl、dNTP(10mM)2μl、 引物P1 P2各1.5μl，P3 P4各2μl、TaqDNA聚合酶1單位，補水至100μl，混勻。在94℃預變性5分鐘后，于94℃45秒、48℃45秒、72℃45秒的條件下擴增35個循環，最后于72℃延伸10分鐘。
④檢測 取10μl PCR產物在電壓50伏，2％的瓊脂糖凝膠電泳40～60分鐘，在紫外燈下觀察，其擴增效果明顯，大小適合，條帶清晰。有明顯的兩條帶出現，與標準的HBV和HCV陽性血清擴增條帶對比，其條帶相符。
2、實施例二 黃病毒的快速檢測黃病毒是一類單股正鏈RNA病毒。黃病毒引起的疾病在臨床上的表現，包括由登革病毒(Den)引起的無特殊部位的全身性感染登革熱(DF)、登革出血熱和休克綜合征(DHF/DSS)；由黃熱病毒(YF)引起的全身性感染(但主要表現為出血和肝炎)，和由乙型腦炎病毒(JBE)，圣路易腦炎病毒(SLE)，西尼羅病毒(WN)和蜱傳腦炎病毒(TBE)等引起的腦炎和腦脊髓炎等，我國目前已證實的黃病毒有乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒、登革熱病毒等。
根據已發布的四類黃病毒基因組序列高度保守區設計特異性引物，交給北京賽百盛公司合成。dNTP、TaqDNA聚合酶、10×buffer均購于華美生物工程有限公司。配置自制的蛋白質裂解緩沖液。
實驗流程①血樣采集 本實驗血清樣品由武漢協和醫院提供，采集疑為黃病毒引起的病人血清。
②模板制備 取待檢血清70μl于PCR反應薄壁管中，加入自制的蛋白質裂解緩沖液30μl，在99.9℃煮沸10～15min，然后在臺式心機上15000r/min離心10min。收集上清20μl于另一個PCR反應薄壁管，即感染病毒核酸提取液。
③PCR擴增 在收集上清管(20μl)內加入10×buffer 10μl、dNTP(10mM)2μl、引物各2μl、TaqDNA聚合酶1U，補水至100μl，混勻。在94℃預變性5分鐘后，于94℃45秒、48℃45秒、72℃45秒的條件下擴增35個循環，最后于72℃延伸10分鐘。
④檢測 取10μlPCR產物在50伏特2％的瓊脂糖凝膠電泳40～60分鐘，在紫外燈下觀察，其擴增效果明顯，條帶清晰。與標準的黃病毒陽性血清擴增條帶對比，其條帶與標準DEN擴增帶相符合，進一步轉膜雜交、證實病人感染了對應的DEN病毒。
權利要求
1.一種以Taq酶對DNA和RNA病原進行同步PCR檢測的方法，其特征在于①蛋白質裂解試劑組成為1％～10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)、2～20％NP-40、1～10％吐溫-20表面活性劑與Tris或磷酸緩沖液的兩兩組合，再加入RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC)；②采用蛋白質裂解試劑和煮沸法同步提取病毒核酸DNA和RNA；③利用Taq DNA聚合酶本身的聚合酶活性和逆轉錄活性，以上述過程制備的病毒核酸為模板直接進行PCR擴增，得到所需的核酸片斷；④得到核酸片斷后，經過電泳或雜交進行基因檢測；⑤檢驗流程為模板制備、PCR擴增、檢測。
全文摘要
本發明涉及一種基因檢測技術,具體地說,涉及一種Taq酶對DNA和RNA病原進行同步PCR快速擴增檢測的方法。主要是采用蛋白質裂解試劑和煮沸法同步提取病毒核酸DNA和RNA,利用Taq DNA聚合酶本身的聚合酶活性和逆轉錄活性,以上述過程制備的病毒核酸為模板直接進行PCR擴增,得到所需的各種目的核酸片斷;經過電泳或雜交進行基因檢測。本發明簡化了提取核酸模板和逆轉錄的過程,節省了試劑成本,大大縮短了檢測時間,減少了污染機會,為DNA病毒和RNA病毒的多重PCR技術檢測提供一種新方法,不僅適用于多種疾病病原基因的同步檢測,更能滿足臨床實際的需要。
文檔編號C12Q1/25GK1346893SQ01133528
公開日2002年5月1日 申請日期2001年9月30日 優先權日2001年9月30日
發明者王業富, 龐代文, 沈鈞濤 申請人:武漢大學