無細胞蛋白質合成方法

專利名稱：無細胞蛋白質合成方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的合成方法，該方法利用了無細胞系統。
作為后基因組計劃的一個中心課題是分析多種多樣蛋白質基因的聚合體結構與功能的關系。研究中所獲得的成果包括結構生物學和生物化學等基礎生物學等的研究，闡述了在作為其應用的醫學領域中遺傳基因解碼結果同病因的關系，而且期待著以至在醫藥研制的廣闊領域中提供一種極其重要的理論。
作為在生物體外高效率地在細胞外進行蛋白質合成反應的方法，迄今為止，正在積極地研究從生物體中提取，例如作為細胞內含有蛋白質解碼裝置的核糖體成分；并在該核糖體提取液中加入構成解碼造型、基質的氨基酸、能量源、各種離子、緩沖液，而且通過再加入其它有效基因，在試管內合成蛋白質的所謂無細胞蛋白質合成法等。(特開平6-98790，特開平6-225783，特開平7-194，特開平9-291，特開平7-147992)。
在供無細胞蛋白質合成用的反應系，即無細胞蛋白質合成系中使用的蛋白質合成用的細胞提取液或生物體組織提取液的配制中，正在使用大腸桿菌、小麥胚芽或家兔網狀紅血球等。由于無細胞蛋白質合成系在肽合成速度和解碼反應的準確性兩個方面保持了與細胞相媲美的性能，且具有不需要復雜的化學反應工序和繁雜的細胞培養工序，因此研制了迄今為止正在實際使用的系統。然而，一般認為從生物體細胞提取的細胞提取液，其蛋白質的合成性極其不穩定，因此蛋白質合成效率低，另外還因為保存中的細胞提取液的質量也在顯著下降，因此由無細胞蛋白質合成系獲得的合成量因放射性同位素標識可檢測程度的量很少，而不能用作實際生產蛋白質的手段。
首先，作為解決現有無細胞蛋白質合成系缺點的方法，本發明人等提供了一種無細胞蛋白質合成的方法(WO00/68412號公報)(WO01/27260號公報)，該方法利用了(1)無細胞蛋白質合成用細胞提取物制劑以及無細胞蛋白質合成法；以及(2)具有通用性及高效率功能的造型分子。
而且還報告了為提高蛋白質的合成效率、連續合成無細胞蛋白質的合成裝置。作為現有的連續式無細胞蛋白質合成裝置，可以舉出如使用限外過濾膜法、透析膜法以及將解碼造型固定在透析膜法與樹脂上的柱狀色譜法等[spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123～142]。其中，由于限外過濾膜法和透析膜法操作簡便，因此被廣泛使用。然而，在采用這些過濾膜的連續法中也存在著尚待解決的難題①所使用的膜材料強度低；②由于網眼阻塞而導致膜功能下降；③由于操作繁雜，因而需要熟練的技術等。
而且，通過利用限外過濾膜法和透析膜法等，手動進行的連續式無細胞蛋白質合成方法雖可在由少數遺傳基因合成蛋白質中可利用，但能高效率地從多數遺傳基因生產蛋白質是很困難的。因此研制可高效率地從多數遺傳基因生產蛋白質的高效率全自動多檢測體蛋白質合成系統，即發明解決現有連續式無細胞蛋白質合成方法缺點的新技術乃是當務之急。
另外本發明的范圍還包括無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于在上述無細胞蛋白質的合成方法中，在反應相和供給相間形成的直接接觸界面為垂直面形狀；而且本發明的一方面涉及一種無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于在將含有小麥胚芽提取液的無細胞蛋白質合成反應溶液預培養(預熱)后，加入基質和能量源供給溶液，稀釋含有小麥胚芽提取液的無細胞蛋白質合成反應溶液；另外本發明的一方面涉及一種無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于在修補式無細胞蛋白質合成方法中，在合成反應停止后的反應溶液中使用凝膠過濾柱或半透明膜，重新供給蛋白質合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP和磷酸纖維酸等原料和能量源，同時通過從反應溶液排出反應中生成的副產物，以提高合成反應效率。
圖2表示使用小麥胚芽提取液的連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法合成的綠色螢光蛋白質(GFP)圖2A是通過14C-亮氨酸攝入量測量合成蛋白質的結果；縱軸蛋白質合成量；橫軸培養時間；表示采用現有修補式(○-○)以及口徑為7mm(□--□的大)、5mm(□-□的中)、或3mm(□-□的小)反應容器的連續擴散修補式(層疊方式)的蛋白質合成。■-■表示的是表示采用稀釋修補式的蛋白質合成。表示縱軸蛋白質合成量的放射能讀數是用單位等量的胚芽提取液量來表示。圖2B是合成生成物放射自體放射照相術的照片。
圖3表示通過使用小麥胚芽提取液的連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法合成的二氫葉酸還原酶(DHFR)。
圖3A表示通過14C-亮氨酸吸入量測量合成蛋白質的結果。表示使用現有修補式(○-○)與口徑為7mm反應容器的連續擴散修補式(層疊方式)合成的蛋白質(■-■)。表示縱軸蛋白質合成量的放射能讀數是由單位等量的胚芽提取液量來表示。圖3B是考馬氏亮藍著色的合成物SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳圖。
圖4表示通過采用大腸桿菌提取液的連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法合成的GFP。
圖4A是表示通過14C-亮氨酸吸入量測量合成蛋白質的結果。表示使用現有修補式(○-○)和口徑為7mm反應容器連續擴散修補式(層疊方式)合成蛋白質(■-■)。(□-□)表示通過稀釋修補式無細胞蛋白質合成方法合成蛋白質，表示縱軸蛋白質合成量的放射能讀數由單位等量大腸桿菌提取液表示。圖4B是合成生成物放射自體放射照相術的照片。
圖5表示通過使用小麥胚芽提取液的不連續凝膠過濾修補式無細胞蛋白質合成方法合成的GFP(□-□)。箭頭表示進行反應液凝膠過濾處理的時間；(■-■)表示未進行凝膠過濾處理時的結果。
圖6表示具有通用性的質粒pEU1的結構。
具體實施例方式
本發明一方面涉及一種連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法，其特征在于在一般的無細胞蛋白質合成方法中，使含有生物提取物的合成反應溶液(反應相)與基質以及能量源供給溶液(供給相)，不經半透明膜或限外過濾膜等過濾隔離，而直接接觸，通過兩相接觸界面的自由擴散，將供給相的基質和能量源分子連續供給反應相，同時通過使反應相中生成的副產物向供給相排出來延長反應的延續時間，并以此來提高合成效率。
在上述連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法中，兩相的界面可作為水平面形成，也可作為垂直面形成。要將該界面形成水平面，例如在反應容器首先加反應相形成下層，然后為不使兩相界面發生紊亂，可在該反應相上輕輕地層疊供給相(參照

圖1)。反應容器在按其形態及尺寸，同時也可不賦予兩相間的溶質的充分擴散速度，例如可使用試管和多孔穴微型濃度滴定盤等，但不僅限于這些用具。另外在將合成反應溶液(反應相)與供給溶液(供給相)疊層后，通過對含有這些溶液的反應容器施加離心操作也可使兩相界面形成垂直面的形狀。
兩相的接觸界面面積大的時候由擴散產生的物質交換率高，蛋白質的合成率升高。因此，供給相對反應相最佳的容量比因兩相界面面積而改變。供給相對反應相的容量比雖沒有特別限制，例如界面為圓形，其直徑為7mm時，則從1∶4開始，而1∶8為理想，1∶5則更理想。
形成上述反應相的合成反應液由含有形成無細胞蛋白質合成反應所需要的生物體提取物以及蛋白質合成的造型所需要的mRNA，以及現在已經使用的修補式無細胞蛋白質合成系中使用的組分構成。生物體提取物可使用在現有無細胞蛋白質合成法中使用的眾所周知的生物體提取物，例如小麥胚芽提取物、大腸桿菌提取物或家兔網狀紅血球提取物等，這些提取物的配制可按照眾所周知的方法進行。小麥胚芽提取物使用現刊[Madin K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]、(WO00/68412號公報)中記載的方法配制是理想的。合成反應溶液，作為生物體提取物，在具體使用例如小麥胚芽提取物時，將該提取物含量占48％總容量(濃度200A260nmunits/ml)，按照最終濃度組分[1,000units/ml核糖核酸酶抗生劑(RNAsin)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml纖維酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鳥苷三磷酸(GTP)、16mM纖維酸磷酸、0.380mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40、600μg/ml mRNA]構成。合成反應溶液的組分不限于上述組分，也可采用更高效率地進行無細胞蛋白質合成反應的組分。例如代替上述mRNA，在含有質粒(目的遺傳基因做代碼)、RNA聚合酶、以及核苷酸類等復制反應溶液中合成mRNA后，繼續將凝膠過濾法和透析膜法等使用該復制反應溶液的組分轉變成由適于解碼反應的組分構成的溶液，也可將所得到的溶液作為合成反應溶液(參照下述對照例1)。
而且，上述合成反應溶液的組分可根據所用生物體提取物的種類適當地加以改變。使用大腸桿菌作為生物體提取物時，可使用根據現刊[Pratt，J.M.，Transcription and Translation(1984)，179-209，Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds，IRL Press，Oxford]配制的大腸桿菌提取物，并可按照該方法組分配制蛋白質合成反應溶液。例如使大腸桿菌提取物含量占50％總含量，然后配制由下述最終濃度的組分[57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸氨、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、0.3U/ml丙酮酸酶(PYRUVATNAZE)、0.17mg/ml大腸桿菌tRNA混合液、34mg/ml L-5-甲酰基-5，6，7，8-四氫葉酸、6.7μg/ml質粒(目的遺傳基因)；33μg/ml T7 RNA聚合酶、1.2mM ATP各0.85mM GTP、以及UTP和CTP、56mM磷烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)]構成的復制反應溶液。首先在合成mRNA后，繼續在凝膠過濾法和透析膜法等中將該復制反應溶液的組分轉換成由適用于解碼反應組分構成的溶液，也可將所得到的溶液用作合成反應溶液(參照下述對照例1)。而且在使用大腸桿菌提取液的合成無細胞蛋白質系時，如上所述，在復制反應液中首先合成mRNA后，通過在該復制反應溶液上將供給溶液層疊，也可以在靜置條件下以適于解碼反應的溫度進行蛋白質合成反應。合成反應溶液的組分不僅限定于上述組分，也可以使用更高效率進行無細胞蛋白質合成反應的組分。例如，代替上述復制反應溶液中的質粒(目的遺傳基因)、T7RNA聚合酶、UTP以及CTP，也可以適當添加用眾所周知的方法(Gurevich，V.V.，(1996)Methods in Enzymology，275，383-397)配制的目的遺傳基因進行編碼的mRNA，來配制出適于解碼反應的組分的合成反應溶液。
另一方面，可在上述合成反應溶液中通過添加纖維醇、木糖醇以及或血糖醇(Ficoll)等糖乙醇，提高該合成反應液的粘度和密度，進而控制反應相與供給相的兩相間的混合速度，以促進蛋白質合成反應更加穩定。
而且形成上述供給相的供給溶液含有基質和能量源，例如氨基酸、ATP、GTP、纖維磷酸以及合成蛋白質反應所需要的其它離子以及緩沖液等。具體來說，例如在反應相中使用含有小麥胚芽提取液的上述蛋白質合成反應液時，可以使用由30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM纖維磷酸、0.380mM精脒以及20種L型氨基酸(各0.3mM)的組分構成的供給溶液。而且在反應相中使用含有大腸桿菌提取液的上述蛋白質合成反應溶液時，可以使用由組分，例如57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸胺、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、34mg/ml L-5甲酰基-5，6，7，8四氫葉酸、1.2mMATP、0.85mM GTP以及UTP和CTP、56mM磷烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)構成的供給溶液。
在靜置條件下進行蛋白質合成反應，反應溫度是在各種無細胞蛋白質合成方法中通常使用的最佳溫度。作為生物體提取物，在使用小麥胚芽提取物時，是從20℃開始，到30℃，理想的溫度是26℃；使用大腸桿菌提取物時，從30℃開始，到37℃，理想的溫度是30℃。
而且本發明一方面涉及稀釋修補式無細胞蛋白質的合成方法，該方法在利用小麥胚芽提取物的無細胞蛋白質合成方法中，將反應溶液預培養(預熱)后，通過添加稀釋溶液稀釋合成反應溶液，進而延長合成反應的延續時間，由此提高蛋白質合成效率。
在稀釋修補式無細胞蛋白質合成方法中，使用現有的修補式無細胞蛋白質合成反應液，例如使用由上述組分構成的合成反應溶液，首先經15分鐘至30分鐘預培養，進行蛋白質合成。然后添加基質和能量源，基質和能量源如含有氨基酸、ATP、GTP、纖維酸磷酸以及蛋白質合成反應中需要的其它離子類和緩沖液等上述連續擴散修補式蛋白質合成方法中的供給溶液及其相同組分的溶液，在反應液中含有的小麥胚芽提取液從7％稀釋到12％的程度的狀態下進行合成反應。蛋白質合成反應的最佳溫度，在使用小麥胚芽提取物時從20℃開始，到30℃，最理想的溫度是26℃。由于眾所周知發酵素和解碼蛋白質基因一般在低濃度下穩定性降低，因此預先在合成反應液中通過添加眾所周知的穩定劑，例如纖維醇、木糖醇和血糖醇等，也可以獲得更高效率的合成反應。
上述稀釋修補式蛋白質合成方法在使用小麥胚芽提取物的無細胞蛋白質的合成系中是非常有效的，但是在采用大腸桿菌提取物的系中卻未發現這種效果。據認為其原因在于小麥胚芽提取液的特性。
而且一般認為，在該方法中，預培養是極其重要的工序，如果將該項操作省略，則降低蛋白質合成反應效率，因此在這種預培養時應形成穩定的初始解碼復合體，然而有關這種特異現象的分子結構的實體仍然是今后的課題。
另外，本發明一方面涉及無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于在修補式無細胞蛋白質合成方法中，對合成反應停止后的反應液使用凝膠過濾柱或半透明膜，重新供給蛋白質合成所需要的基質和能量源，例如氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等原料，同時通過從反應溶液中將反應生成的副產物排出，來提高合成反應的效率。該方式是向蛋白質合成反應與基質以及能量源的反應液提供以及排出副產物的操作是由不連續的工序構成的修補方法，因此在基本機制上與Spirin等人的連續式無細胞蛋白質合成方法不同。
在該不連續修補式無細胞蛋白質合成方法中，使用反應容器，例如試管等，按照現有的方法開始修補式無細胞蛋白質合成反應。在合成反應停止后，通過將反應液的溫度降低到0～4℃，使蛋白質合成反應完全停止。將反應停止后的反應液，加到預先在基質以及能量源，例如在氨基酸、ATP、GTP以及含有纖維酸磷酸等溶液中，達到平衡的低分子化合物分離用的凝膠過濾粒子，例如使用交聯葡聚糖G-25等層析法上。達到平衡所使用的溶液可使用與上述連續擴散修補式蛋白質合成方法中的供給液組分相同的溶液。
由上述凝膠過濾操作，可使副產物排出到交聯葡聚糖粒子中，而且可將被轉換為新的氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等的無細胞蛋白質合成溶液回收成排泄部分。如果將所回收的溶液重新保溫，則開始解碼反應，蛋白質合成反應進行數小時。合成反應再次停止時，再反復上述凝膠過濾操作。由于這種方法的循環可使在通常的修補式方法中在短時間內停止的合成反應延續很長時間，其結果可使蛋白質合成回收量上升。
而且在上述不連續的修補式無細胞蛋白質合成方法中，以將基質以及能量源等再供給以及已排出副產物為目的，即使使用透析法代替上述凝膠過濾法，也可獲得與其相同或超過以上結果的效果。
如上所述，在涉及本發明的①使含有細胞提取液的合成反應溶液構成的反應相與含有氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等的基質以及能量源供給液構成的供給相直接接觸，通過兩相接觸界面由自由擴散，將供給相的基質以及能量源連續供給到反應相中，同時將反應相中產生的副產物排出到供給相中的連續擴散修補法；②在使用小麥胚芽的無細胞蛋白質合成系中，通過降低合成反應溶液中含有的細胞提取液濃度的稀釋修補法；而且在③蛋白質合成反應停止后，利用凝膠過濾法或透析法，重新將蛋白質合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等基質，以及能量源提供給合成反應溶液，同時將反應中生成的副產物不連續排出的不連續修補法。該不連續修補法與現有的連續式無細胞蛋白質合成方法不同，作為無細胞蛋白質的合成方法是極其有效的。這些方法也可以分別單獨加以實施，也可以進行配套利用。例如以提高蛋白質合成效率為目的，可實施連續擴散修補法和不連續修補法，也可以將稀釋修補法與不連續修補法配套加以實施。另外，提高最初添加的細胞提取物或組織提取物的濃度，也可將上述三種方法配套加以實施。
另外，通過本發明，可延長無細胞蛋白質合成反應的延續時間，因此與現有的修補法相比，則可進一步提高蛋白質的合成效率；并建立了具有與利用Spirin建立的半導體膜的連續式無細胞蛋白質合成方法[Spirin，A.，etal.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]同等以上性能的無細胞蛋白質合成方法。
現舉出以下實施例，更詳細地說明本發明。本發明不限于下述的實施例所限定的范圍。
小麥胚芽提取物是根據現刊[Madin K.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]、(WO00/68412號公報)中記載的方法所獲得的。
而且為了合成構成小麥胚芽無細胞蛋白質合成反應中的解碼造型的mRNA，利用了遠藤建立的、具有通用性的質粒pEU1(圖6)(WO01/27260號公報)。作為編碼的目的蛋白質的遺傳基因，使用水母的綠色螢光蛋白質(GFP)的遺傳基因(gfp遺傳基因)，按照通常方法插入到上述的質粒中。將所得到的質粒經HindIII切斷，加工成直鏈型；并將其制成復制造型，采用通常方法合成mRNA。所合成的mRNA在5′終端不具有CAP，作為非解碼排列，在5′終端上具有AMV-Ω排列、在3′終端上具有質粒產生的500鹵基排列。所謂上述AMV-Ω排列是指將紫花苜蓿花葉病毒(AMV-mRNA)的5′終端引導結構與煙草花斑病毒mRNA(TMV-mRNA)的5′終端Ω排列直接結合的鹵基排列(WO01/27260號公報)。由于添加這些非解碼系列，因而增強了RNA的穩定性。其結果若使用該RNA，則提高無細胞蛋白質的合成效率。而且即使使用5′終端上具有CAP的mRNA，也可獲得以下相同的結果。
然后，小麥胚芽提取物含量占48％全容量(濃度為200A260nmunits/ml)，配制了由下列最終濃度的組分[1,000units/ml核糖核酸抗生劑(RNAsin)(寶公司制造)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml纖維酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鳥苷三磷酸(GTP)、16mM纖維磷酸、0.380mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40、600μg/ml mRNA]構成的蛋白質合成反應液。為了測量蛋白質的合成量，對上述1ml的蛋白質合成反應液，添加4μCi的14C高亮酸(300mCi/mmol)[Proc，Natl Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]。
這種蛋白質合成反應液放入口徑7mm、5mm以及3mm的反應容器(分別為微型濃度滴定盤、1.5ml容量的試管以及0.2ml容量的試管)中，為了不使界面出現紊亂，在其上部靜靜地將5倍容量度供給液[30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、1.2mg/ml ATP、0.25mM的GTP、16mM的纖維磷酸、0.380mM的精脒、以及20種L型氨基酸(各0.3mM)層疊。在靜止條件下，在26℃下經過3、6、9以及17個小時的培養，進行合成蛋白質的反應。所合成的蛋白質的質量根據普通方法，以放射性同位素的三氯醋酸難溶部分的攝入量為指標進行測量。所合成的蛋白質經x線自動照相術采用普通方法[Endo，Y.etal.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]進行檢測。其結果表示在圖2(A)以及圖2(B)中。
為了對照，實施了現有的修補式無細胞蛋白質合成方法。在該方法中，mRNA、小麥胚芽提取物、以及含有小麥胚芽提取物的蛋白質合成反應液，雖與上述連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法中所使用的液體相同，但也在不添加供給溶液上有所不同。
如圖2(A)所示，在所有的修補式(○-○)方法中，在反應開始后的1小時內，停止了蛋白質的合成反應。其結果與現刊[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]所記載的結果完全一致。
一方面，在采用口徑為7mm的反應容器(界面的面積為0.385cm2)的層疊式(大型□--□)中，即使反應開始17小時，也還繼續合成反應，其合成量達到現有的修補方法的9倍以上。另一方面使用規格尺寸不同的反應容器，研究了影響該合成反應的反應相與供給相間的界面面積的影響，其結果發現反應開始9小時后的合成效率在與使用口徑7mm的反應容器時相比較，5mm口徑的反應容器(界面的面積為0.196cm2)(中型□--□)中合成效率為91％；在口徑3mm的反應容器(界面的面積為0.071cm2)(小型□-□)中合成效率為75％。
而且如圖2(B)所示的x線自動照相術，由現有的修補法以及連續擴散修補式的兩種方式合成的蛋白質合成反應時間經過與合成物分子量以及合成量，如圖2(A)所示，均完全支持采用14C-亮氨酸攝入量的測定研究蛋白質合成量所獲得的實驗結果。在圖2(B)中，表示出連續擴散修補式為層疊式。而且采用連續擴散修補式進行蛋白質合成的結果僅表示出在口徑為7mm反應容器所得到的結果。
而且在該方法中，使用下述對照例1中所示出的復制、解碼整體型蛋白質合成法在復制反應液中合成mRNA后，繼續由使用凝膠過濾法及透析法將該復制反應溶液的組分變換成適于解碼反應的組分構成的溶液。通過將所得到的溶液用作合成反應溶液，進而即使在合成與上述相同的蛋白質反應時也能獲得相同的結果。
從以上的結果可以看出①使用小麥胚芽提取液的連續擴散修補式蛋白質合成方法，比現有的修補法明顯提高合成效率；②其合成效率在反應相與供給相間的界面面積越大越優異。而且也判明了采用該方法導致的合成量上升是由于延續合成反應的時間所造成的緣故。實施例2作為稀釋修補式無細胞蛋白質合成方法的一個實施例，進行了通過使用含有在實施例1中配制的小麥胚芽提取物以及GFP進行編碼的mRNA蛋白質合成溶液，按現有的修補式在26℃進行15分鐘的預培養，然后添加5倍容量的稀釋溶液后，經在靜置條件下，進一步在26℃進行3、6、9小時培養，合成了蛋白質。稀釋溶液使用了與在實施例1中配制的供給溶液相同組分的溶液。所合成蛋白質的量進行與實施例1相同的測定，其結果示于圖2(A)(■-■)及圖2(B)。
如圖2(A)所表明的那樣，與在1小時內合成反應的現有的修補式(O-○)比較，如果用稀釋式進行無細胞蛋白質合成，則直到反應開始6小時止，呈線性延續了合成反應(■-■)。
而且圖2(B)所示的x線自動照相術照片完全支持圖2(A)示出的14C-亮氨酸攝取量研究蛋白質合成量所獲得的實驗結果。
該稀釋修補式無細胞蛋白質合成方法的合成效率雖不如實施例1表示的連續擴散修補式，但蛋白質的合成量與現有的修補法相比，則是它的3倍，而表現出相當高的合成效率。
而且在該方法中，也使用下述對照例1示出的復制、解碼整體形蛋白質合成方法，在復制反應液中合成mRNA后，繼續使用凝膠過濾法和透析法等將該復制反應溶液組分轉換成適于解碼反應的組分構成的溶液，在將所得到的溶液用作合成反應溶液、進而即使在合成與上述相同的蛋白質時也獲得同樣的結果。
而且在上述稀釋修補式無細胞蛋白質合成方法中，在省略預培養反應操作時，未發現上述的那種合成反應顯著延續現象。另外，在使用大腸桿菌提取液的無細胞蛋白質的合成系中也未發現稀釋修補式的效果。
如上所述，在使用小麥胚芽提取物的無細胞蛋白質合成系中，證實了稀釋修補式無細胞蛋白質的合成方法也是蛋白質合成的有效手段。
除了mRNA是編碼DHFR的mRNA以外，還使用與實施例1相同組分的蛋白質合成反應液進行與實施例1相同的蛋白質合成，其結果示于圖3。測量所合成蛋白質的量是以按照常規方法將放射性同位素三氯醋酸不溶部分色譜的吸入量作為指標來進行，所合成蛋白質的檢驗使用由SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法進行分離和考馬氏亮藍(CBB)染色法[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]進行著色。
如圖3(A)所示，在DHFR合成中，連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法(■-■)的合成反應時間也比現有的修補法(○-○)有明顯地延續。采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法分析合成反應的時間經過與合成物量的結果[圖3(B)，箭頭表示DHFR考馬氏亮藍著色帶]完全支持圖3(A)示出的結果。從測定合成DHFR帶著色強度可以判明采用連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法在8小時反應中，每1ml的反應容量可合成0.9mg的DHFR。實施例4通過使用大腸桿菌提取液證實了連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法即使使用從任何生物種配制細胞提取液的無細胞蛋白質合成系也是普遍有效的。
根據現刊[Pratt，J.M.，Transcription and Translation(1984)，179-209，Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds，IRL Press，Oxford]配制了大腸桿菌提取液。而且在本實施例中，首先用復制、解碼整體型無細胞蛋白質合成系(參照對照例1)合成mRNA。在通過凝膠過濾法將含有該mRNA的復制反應溶液轉變成適于解碼反應的反應溶液組分后，加在反應容器中，通過與實施例相同的方法將溶液層疊，在靜置條件下在30℃進行了蛋白質合成反應。
首先配制含50％總容量的大腸桿菌提取液、且由下述的最終濃度組分，即57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸銨、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、0.3U/ml丙酮酸酶(PYRUVATNAZE)、0.17mg/ml大腸桿菌tRNA混合液、34mg/ml的L-5甲酰基5，6，7，8-四氫葉酸、6.7μg/m質粒(將GFP遺傳基因編碼)、33μg/ml T7RNA聚合酶、1.2mM的ATP、0.85mM的GTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)組成的大腸桿菌無細胞蛋白質合成反應液，在30℃進行90分鐘的培養，合成了mRNA。然后通過凝膠過濾法將上述溶液的組分轉變成適于解碼反應的組分后，將該溶液25μl移送到反應容器(口徑7mm微型濃度滴定盤)上，靜靜地將下述組分的供給溶液層疊，在30℃下合成蛋白質。在以氨基酸攝入作為指標測定蛋白質合成時，將4μCi14C-亮氨酸(300mCi/mmol)添加到1ml上述反應溶液中。
構成mRNA復制造型的質粒，使用以具有木川報告的T7-噬菌作催化劑排列的pK7-RAS[Kigawa，T.，et al.，(1995)J.Biomol.NMR，6，129-134]為基礎，由RAS遺傳基因置換水母GFP遺傳基因的溶液。
大腸桿菌無細胞蛋白質合成系利用的供給溶液組分由最終濃度為57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸銨、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、34mg/ml的L-5甲酰基-5，6，7，8四氫葉酸、1.2mM的ATP、0.85mM的GTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)構成。以蛋白質合成攝入氨基酸量為指標進行測量時，對于1ml反應溶液，添加4μCi14C-亮氨酸。
圖4(A)中示出了由14C-亮氨酸的攝入量來測定的蛋白質的合成結果。GFP的合成反應在現有的修補法(○-○)中，在反應開始后3小時內完全停止，但在連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法(■-■)中，延續到直至反應開始17小時后。由氨基酸攝入量計算合成蛋白質量時，采用連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法的合成量達到修補法合成蛋白質量的4倍以上。采用圖4(B)示出的x線自動照相術的合成反應時間經過與合成物的分子量以及合成量的分析結果完全支持圖4(A)的結果。另一方面，在上述蛋白質合成反應溶液(反應相)中，將上述供給溶液(供給相)層疊后，立即由渦流攪拌器將兩相混合的對照性實驗中，蛋白質合成量明顯地低于現有的修補法。
這一事實與Kim的報告完全相同[Kim，D.M.，(1996)Eur.J.Biochem.239，881-886]，即在大腸桿菌無細胞蛋白質合成系中制備反應溶液中高濃度的細胞提取液對提高合成效率是十分重要的。這一結果明確地表明，連續擴散修補式所觀察到的蛋白質合成反應延續時間的延長現象僅僅是由于反應溶液中蛋白質的合成中所需要的成分，例如不是由于核蛋白體等濃度的下降所引起的反應速度下降，而是連續擴散修補式無細胞蛋白質合成方法所具有的特性。
另一方面，使用大腸桿菌提取液在復制解碼整體型無細胞蛋白質合成系(參照對照例1)中，首先在合成mRNA后，與實施例1相同，使供給液在反應溶液上層疊，在靜置條件下即使在30℃進行蛋白質合成反應也可得到與上述相同的結果。
實施例5下面，說明通過利用凝膠過濾法的不連續修補式制造小麥胚芽的無細胞蛋白質合成方法的實施例。首先與實施例1配制的溶液相同，使蛋白質的合成溶液填加到普通的小型試管或96穴槽的濃度滴定盤上，在靜置條件下按照通常的方法在26℃下進行反應。在該反應條件下，蛋白質合成數小時，例如在含有48％總容量的小麥胚芽提取液時，反應開始1小時內，合成反應完全停止。這一現象可從采用蛋白質對氨基酸的攝入量的測量以及蔗糖密度梯度離心法進行核糖體分析中發現[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]。在上述合成反應停止的反應溶液使用由預先在含有基質及能量源，例如氨基酸、ATP、GTP、蛋白質合成反應中所需要的其它離子與緩沖液中進行平衡的交聯葡聚糖糖柱色譜G-25色柱進行凝膠過濾后，另在26℃進行了蛋白質合成。該供給溶液的組分與實施例1中使用的供給溶液相同。
如在圖5所示的14C-亮氨酸的攝入結果那樣，在現有的修補式中，合成反應在反應開始后1小時內完全停止(■-■)。但是，在反應開始3小時后，進行如上所述的凝膠過濾操作(圖5中用箭頭表示)。而且在培養時，再次開始蛋白質的合成反應(□-□)。另外，從14C-亮氨酸的攝入速度梯度大致與反應開始初期的速度梯度相同，所以判明了與反應初期的蛋白質合成效率相比沒有降低凝膠過濾后的蛋白質合成效率。
而且，在該方法中使用下述對照例1中示出的復制解碼整體型蛋白質的合成方法在復制反應溶液中合成mRNA后，繼續將在凝膠過濾法和透析法等中將該復制反應溶液的組分轉換為由適于解碼反應的組分構成的溶液，并將所得到的溶液用作合成反應液，在進行與上述同樣的蛋白質合成時也獲得了相同的結果。
由于使用小麥胚芽的上述無細胞蛋白質合成系是極其穩定的[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]，因此，通過反復進行該凝膠過濾操作，可使反應時間延續很長時間。因此，上述不連續修補式無細胞蛋白質合成方法，例如作為在使用小麥胚芽的無細胞蛋白質的合成系中的高效率合成方法是有用的。對照例1由復制解碼整體型蛋白質合成方法在復制反應溶液中合成mRNA后，繼續將在凝膠過濾法和透析法等中將該復制反應溶液的組分轉換為由適于解碼反應的組分構成的溶液，可將所得到的溶液用作合成反應溶液。
首先，作為反應容器，使用安裝了凝膠過濾器的旋轉鼓，在同一容器內將造型DNA、4種基質核糖核苷-5′-3磷酸，而且按照需要添加CAP分子、RNA聚合酶、精脒、鎂離子以及由適當的緩沖液等構成的反應溶液[80mM HEPES-KOH(pH8.2)、16mM醋酸鎂、2mM精脒、10mM二硫蘇糖醇、2.5mM ATP、2.5Mm GTP、2.5mM CTP、2.5mM的UTP、1U/μL核糖核酸酶抗生劑、3U/μL SP6RNA核糖核酸酶(寶公司制造)]。按照其它用途，配制從上述的復制反應溶液除去造型DNA、RNA聚合酶以及核糖核酸酶抗生劑的溶液，使用透析外液，進行透析式連續合成mRNA。
在mRNA合成后，將旋轉鼓低速離心旋轉，通過使用實施例1中示出的蛋白質合成溶液(不含mRNA)，進行凝膠過濾操作，將上述復制反應溶液轉換為適于解碼反應的蛋白質合成溶液。
工業實用性涉及本發明的上述無細胞蛋白質的合成方法利用了半透明膜的限外過濾膜法和透析膜法，而且不使用在樹脂上將解碼造型固定的柱層析法等[Spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]的繁雜方法，通過在傳統的修補式方法中分別引用3種高效率合成反應技術，即使通過任意一種手段都可以高效率地合成利用組織、細胞提取物的無細胞系中的蛋白質。
涉及本發明的蛋白質合成方法不具有使用現在正在進行的連續式無細胞蛋白質合成方法中所發現的膜材料強度的降低程度，以及因網眼阻塞而導致膜性能下降以及操作繁雜性等缺點，因此與傳統方法比較，可更高效率地進行蛋白質的合成。所以，涉及上述本發明的技術將是對今后基因組項目結束而同時帶來數量龐大的遺傳基因的功能解析，以及面臨構成結構解析基礎的遺傳基因產物(蛋白質)的生產自動化所需要的基礎的重要技術。可以認為尤其是對多被測體用全自動無細胞蛋白質合成機械手的研制等無細胞蛋白質合成系統的自動化之重要技術是不可欠缺的。
權利要求
1.一種無細胞蛋白質合成方法，該合成方法采用連續擴散修補式，其特征在于，使含有生物體提取物的合成反應溶液(反應相)與基質以及能量源供給液(供給相)直接接觸，通過兩相直接接觸界面的自由擴散，將供給相的基質以及能量源分子連續供給反應相的解碼反應系；同時通過將反應相生成的副產物排出，延長合成反應的延續時間，提高合成反應效率。
2.根據權利要求1所述的無細胞蛋白質合成方法，其特征在于，生物體提取物為小麥胚芽提取液。
3.根據權利要求1所述的無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于，生物體提取物是大腸桿菌提取液。
4.根據權利要求1所述的無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于，將反應相生成的副產物稀釋，向供給相排出。
5.根據權利要求1所述的無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于，在反應相與供給相間形成的直接接觸界面為垂直面狀。
6.一種無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于，在將含有小麥胚芽提取液的無細胞蛋白質合成反應溶液進行預培養(預熱)后，添加基質及能量源供給溶液，稀釋含有小麥胚芽提取液的無細胞蛋白質合成反應溶液。
7.一種無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于，在修補式無細胞蛋白質合成方法中，在合成反應停止后的反應溶液中，使用凝膠過濾柱或半透明膜，再供給蛋白質合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及纖維磷酸等原料以及能量源；同時通過從反應溶液中排出反應中所生成的副產物，提高合成反應的效率。
全文摘要
本發明的目的是提供一種無細胞蛋白質的合成方法，該方法使含有生物體提取物的合成反應溶液(反應相)與基質以及能量源供給溶液(供給相)直接接觸，通過接觸界面使供給相的基質及能量源分子自由擴散，連續向反應相供給；同時將反應相生成的副產物排出到供給相，以延長反應的延續時間；該方法通過在將含有小麥胚芽提取物的反應溶液預培養后，添加稀釋溶液加以稀釋，以延長合成反應的延續時間；該方法在合成反應停止后的反應液中使用凝膠過濾柱和半透明膜將蛋白質合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及纖維磷酸等基質以及能量源再供給；同時不連續排出反應中的副產物，進而提高反應效率。
文檔編號C12P21/02GK1449449SQ01814793
公開日2003年10月15日 申請日期2001年8月28日 優先權日2000年8月29日
發明者遠藤彌重太, 澤崎達也, 小笠原富夫 申請人:遠藤彌重太