無細胞蛋白質合成用轉錄模型的設計、結構及使用其合成無細胞麥胚芽蛋白質的稀釋批式法的制作方法

專利名稱：無細胞蛋白質合成用轉錄模型的設計、結構及使用其合成無細胞麥胚芽蛋白質的稀釋批式法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種無細胞蛋白質的合成方法，該方法提供一種從遺傳基因合成無細胞蛋白質合成系統用的翻譯模型用轉錄模型的一般設計原理及其結構，以及使用該轉錄模型可簡便、高效率地合成無細胞麥胚芽蛋白質。
后基因組計劃的一個中心課題是分析多種多樣的蛋白質基因的聚合體的結構與功能的關系。研究中所獲得的成果包括在結構生物學和生物化學的基礎生物學等的研究中，闡述了在作為其應用醫學領域的基因研究中遺傳基因翻譯結果同病因的關系，而且期待著以至在醫藥研制、生產的廣闊領域中提供一種重要的理論。
作為在生物體外高效率地在細胞內進行蛋白質合成反應的方法，迄今為止，正在積極地研究從從生物體中提取，例如作為細胞內含有蛋白質翻譯裝置的核糖體成分等的成分，并在該核糖體提取液中加入構成翻譯模型、基質的氨基酸、能量源、各種離子、緩沖液，再加入其它有效基因，在試管內合成蛋白質的所謂無細胞蛋白質合成方法等。(特開平6-98790，特開平6-225783，特開平7-194，特開平9-291，特開平7-147992)。
在無細胞蛋白質合成的反應系，即無細胞蛋白質合成系中使用的蛋白質合成用的細胞提取液或生物體組織提取液的配制中，正在使用大腸桿菌、麥胚芽或家兔網狀紅血球等。由于無細胞蛋白質合成系在合成肽的速度和翻譯反應的準確性的兩個問題上，保持了與生物體細胞相媲美的性能，而且具有不需要復雜的化學反應工序和繁雜的細胞培養工序的優點，因此研制迄今為止正在實際使用的系統。然而，一般說來從生物體細胞提取的細胞提取液，其蛋白質的合成性極其不穩定，因此蛋白質合成效率低，另外還因為細胞提取液在保存中的質量也顯著下降，因此在無細胞蛋白質合成系中獲得的合成量因放射性同位體標識等可檢測程度的量很少，因此不能作為實際生產蛋白質的生產方法。
作為現有高效率無細胞蛋白質合成方法，可以例舉出由Spirin等人研制的連續式無細胞蛋白質合成方法[Spirin，A.，et.al.，(1993)Methods inEnzymology，217，123-142]。他們報告了一種通過將發現編入目的基因的質粒添加在使用從大腸菌、麥胚芽或家兔網狀紅血球配制的細胞提取液的轉錄以及翻譯共用的無細胞蛋白質的合成系中，從而顯示出可更高效率地合成蛋白質。其中，采取一種使用兼有轉錄以及翻譯功能的大腸菌提取液的無細胞蛋白質合成系，在其連續式無細胞蛋白質合成法中，每1ml反應系得到最高達到1mg左右的產品。
但是，使用大腸桿菌的無細胞蛋白質合成系以發現編入目的基因質粒為模型，尤其在將該質粒以環型使用時，雖可發揮蛋白質的高合成能力，但是如果使用直鏈質粒和聚合酶鏈式反應(以下簡稱為PCR)建立的直鏈轉錄模型，則由于大腸桿菌提取液中混入的DNA分解酶作用，在2小時左右的短時間內分解為模型DNA，因此每1ml可合成蛋白質的量比現有批式相同等級的反應系將降低數十μg。于是，在現有方法中從大腸桿菌、麥胚芽或家兔網狀紅血球配制的無細胞蛋白質合成用的細胞提取液或組織提取液中，將混入一組核酸分解酶、翻譯阻礙蛋白質基因、蛋白質分解酶等，由于這些分解元素的作用，在蛋白質合成反應中產生翻譯反應系失活和惰性化([Ogasawara，T.，et al.，(1999)EMBO J.，18，6522-6531]。所以即使使用任意一種細胞提取液或組織提取液的蛋白質合成系，其合成效率均低、獲得的蛋白質量也少。
最近發明者等提供了一種解決這些無細胞蛋白質合成系缺點的方法，即①無細胞蛋白質合成用細胞提取物制劑以及無細胞蛋白質合成法(WO00/68412號公報)；②利用具有通用性以及高效率功能的模型分子及其利用方法(WO01/27260號公報)，成功地進一步提高了無細胞麥胚芽蛋白質合成系中蛋白質合成效率。在各發明者研制的無細胞麥胚芽蛋白質合成系中，不含有核酸分解酶以及阻礙翻譯反應的基因組[Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564](WO00/68412號公報)，所以，作為轉錄模型，可高效率地實施以迄今為止被視為難題的直鏈DNA的蛋白質合成。
另一方面，通過利用現有的PCR法的模型DNA的結構法，配制上述高效率麥胚芽無細胞蛋白質合成系中使用的轉錄模型。在這種方法中，作為引物采用了作為識別DNA聚合酶以及結合部位媒介物的催化劑部位的整個領域和有助于翻譯放大與mRNA穩定化的結構，此后，使用了一部分直至含有作為目的遺傳基因的ORF(翻譯框)的物質。通過使用這種引物，試驗了從目的基因建立無細胞蛋白質合成用轉錄模型的結構。因此在采用PCR法的現有轉錄模型的結構方法中，由于除了作為目的完整長鏈的轉錄模型外，還為放大反應中產生的非特異DNA儲存了具有啟動子的短鏈DNA批。由于排出這種DNA批相當困難，因此如果以采用上述引物的PCR產物作為轉錄模型進行RNA合成，則所得到的大半分子就變為非特異性短鏈DNA的轉錄產物低分子RNA。在這些RNA分子中還含有翻譯初始序列的RNA批，這些批被識別為mRNA的翻譯結果，除目的遺傳基因的翻譯產物外，還出現了大量的低分子翻譯產物，從而成為導致目的翻譯產物的吸收量和濃度下降的原因。
于是，在整個長度的催化劑設計中含有互補的堿基序列的5′端的引物，并在使用通過利用其所建立的轉錄模型的現有翻譯模型的結構方法中，存在著目的基因的轉錄效率極低、且翻譯模型產生高噪聲的很大缺點。
另外即使使用按這種方法建立的轉錄模型，由于在轉錄反應與翻譯反應中的最佳的鎂濃度顯著不同，因此認為在使用現有批式麥胚芽無細胞蛋白質合成系的轉錄以及翻譯整體型的高效率合成蛋白質是不可能的。而且作為轉錄基質殘留物的4種核糖核苷三磷酸(4NTPs)和副產物的二氫吡咯酸反應，也是無細胞蛋白質合成系合成效率低的原因。
隨著后基因組項目的進行，今天已經搞清許多基因的結構，另外數萬種cDNA克隆也產生游離體。作為面向21世紀的基礎科學及應用科學中遺傳基因的功能與結構的分析、蛋白質分析、藥品制造，第一步首先需要簡便、高效率地從這些龐大的遺傳基因中合成作為遺傳基因產物的蛋白質。作為加以實現的主要技術，期待于①保持高翻譯模型活性的mRNA的設計；建立②合成mRNA用的轉錄模型結構技術；以及將之加以應用的簡便的③無細胞翻譯技術。
本發明的一方面是一種5′端的引物的堿基序列用于由PCR法制作在無細胞蛋白質合成方法中使用的翻譯模型分子用的轉錄模型，是含有在RNA聚合酶的啟動子和具有部分互補性的堿基序列(4)；含有序列表的序列表編號2或序列表的序列編號3中記述的堿基序列的堿基序列(5)；含有序列表的序列編號3記述的堿基序列的堿基序列(6)；含有上述(5)或(6)的堿基序列的主要部分的堿基序列(7)；在上述(4)～(7)中的任意一種堿基序列和在核糖核酸控制基因條件下可進行雜交的堿基序列；或與其任意一種互補的堿基序列。
本發明的一方面涉及一種轉錄模型的建立方法，該方法是在由PCR法制作在無細胞蛋白質合成方法中使用的5′端非翻譯序列的翻譯模型分子用的轉錄模型時使用的堿基序列。其特征在于在將由兩種不同的堿基序列構成的兩種多核苷酸(A)、(B)用作5′端的引物，由PCR建立的轉錄模型的方法中，該兩種PCR用引物的堿基序列是滿足僅由任意一種該引物建立的DNA不發生轉錄的條件，一種該引物，從啟動子5′的端至少具有包含啟動子功能一部分的堿基序列互補的序列；但至少在該啟動子3′端的RNA聚合酶識別部位用一部分不具有互補堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸A；一種其它的該引物從該啟動子3′的端，在至少含有RNA聚合酶識別部位的一部分的堿基序列中具有互補的堿基序列，但至少在該啟動子5′的端的催化劑功能部位上由不具有互補的堿基序列構成的堿基序列的多核苷酸B；本發明的一方面涉及上述轉錄模型的建立方法，該方法在多核苷酸(B)的堿基序列上還繼續插入GA或GAA序列，在其下游賦于mRNA翻譯放大的堿基序列；另外使用由在不含有翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因的ORF(翻譯框)的一部分，或不含有ORF的ORF上游的堿基序列上連接互補堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸。
本發明的一方面涉及上述轉錄模型的建立方法，其特征在于在多核苷酸的翻譯部初始的密碼與ORF間編入組氨酸標簽和GST(谷胱苷肽S-轉換酶)、myb等標簽或抗原表位用的堿基序列。
本發明的一方面涉及一種轉錄模型的建立方法，其特征在于在由PCR法制作無細胞蛋白質合成方法中使用的翻譯模型分子用的轉錄模型的方法中，作為該轉錄模型5′端的引物，使用由序列表的序列編號2記述的堿基序列構成的多核苷酸；由連接在序列表的序列編號3中記述的堿基序列中作為煙草花斑病毒產生的Ω序列與作為翻譯初始密碼的ATG堿基序列構成的多核苷酸；以及作為序列表的序列編號5中記述的堿基序列中翻譯初始密碼的ATG，然后與由連接作為轉錄目的的遺傳基因固有的ORF的5′端堿基序列相連接的堿基序列構成的多核苷酸。作為該轉錄模型的3′端的引物，采用由序列表的序列編號1中記述的堿基序列構成的多核苷酸。
本發明的一方面是一種由PCR法制作轉錄模型用的引物組，該引物組含有作為5′端的引物，從啟動子5′端，在至少含有引物功能部位一部分的堿基序列上具有互補的序列，但至少在該啟動子3′的端的RNA聚合酶識別部位的一部分由不具有互補堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸(A)；從啟動子的3′端，在至少含有RNA聚合酶識別部位的一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列，但在該啟動子5′端，由至少不具有互補堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸(B)；以及在多核苷酸(B)上可退火的堿基序列上繼續連接翻譯初始密碼ATG、或目的遺傳基因的ORF(翻譯框)的一部分，或在不含有ORF的ORF上游的堿基序列上將互補的堿基序列構成的多核苷酸(C)；作為3′端的引物，在含有克隆遺傳基因的傳病媒介的抗藥性遺傳基因等標記遺傳基因的轉錄終止子序列與在一部分Ori間存在的堿基序列與能形成互補鏈的堿基序列的多核苷酸。
本發明的一方面是上述的引物組，該引物組由多核苷酸(B)從啟動子的3′端，在至少含有RNA聚合酶識別部位一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列，但至少該啟動子的5′端的啟動子功能部位繼續在不具有互補堿基序列的堿基序列上插入GA或GAA序列，在其下游進一步將造成mRNA的翻譯放大的序列連接，而且由在翻譯初始密碼ATG、或不含目的遺傳基因的ORE的ORE上游(5′端)的堿基序列上連接互補序列的堿基序列構成的多核苷酸。
本發明的一方面是引物組，該引物組是為由PCR制造供建立5′端的引物含有由在序列表的序列編號2中記述的堿基序列構成的多核苷酸；由連接序列表的序列編號3中記述的堿基序列上的煙草花斑病毒的Ω序列與作為翻譯初始密碼的ATG的堿基序列構成的多核苷酸；以及由連接序列表的序列編號5中記述的堿基序列中，作為翻譯初始密碼的ATG與然后作為轉錄目的遺傳基因固有的ORE的5′端堿基序列連接的堿基序列構成的多核苷酸；作為3′端的引物含有在無細胞蛋白質合成法中使用的翻譯模型分子用的轉錄模型。
本發明的一方面是一種轉錄模型，該模型是無細胞蛋白質合成方法中使用的高效率mRNA合成用的轉錄模型，通過上述任意一種建立方法都可加以制作。
本發明的一方面是轉錄模型，該模型是無細胞蛋白質合成方法中使用的高效率mRNA合成用的轉錄模型，使用上述任意一種引物組可通過PCR進行合成。
本發明的一方面是無細胞蛋白質合成方法，該方法作為翻譯模型使用由上述任意一種建立方法制作的轉錄模型或從上述任意一種轉錄模型轉錄的mRNA。
本發明的一方面是上述無細胞蛋白質的合成方法，該方法在合成mRNA后通過凝膠過濾進行純化。
本發明的一方面是無細胞蛋白質合成方法，該方法為轉錄以及翻譯連續型稀釋方式，其特征在于由上述任意一種建立方法制作轉錄模型，由轉錄用溶液進行轉錄反應后，添加無細胞蛋白質合成用的反應溶液，在添加后的反應溶液中至少將鎂的濃度降低到翻譯最佳濃度，同時降低該反應溶液中的轉錄基質及轉錄生成物的濃度，進而延長翻譯反應的持續時間。
本發明的一方面是無細胞蛋白質的合成方法，該方法是轉錄及翻譯整體型稀釋方式，其特征在于由上述任意一種建立方法制作轉錄模型，在由無細胞蛋白質合成用反應溶液進行轉錄反應后，添加稀釋溶液稀釋，至少將該反應溶液中的鎂濃度降低到翻譯的最佳濃度，同時降低該反應溶液中的轉錄基質及轉錄生成物的濃度，進而延長翻譯的持續時間。
本發明的一方面是無細胞蛋白質的合成方法，該方法是轉錄及翻譯連續型稀釋方式，其特征在于在反應容器中添加cDNA，實施上述任意一種轉錄模型的建立方法，在該反應容器中制作轉錄模型，由含有RNA聚合酶與含有4種多核苷酸三磷酸的轉錄溶液進行轉錄反應后，再次添加無細胞蛋白質合成反應用溶液，在反應溶液中，至少將鎂濃度降低到翻譯的最佳濃度進行翻譯反應。
本發明的一方面是無細胞蛋白質的合成方法，該方法為轉錄及翻譯整體型稀釋方式，其特征在于在反應容器中添加cDNA，實施上述任意一種轉錄模型的建立方法，在該反應容器中制作轉錄模型，添加RNA聚合酶和含有4種多核苷酸三磷酸的無細胞蛋白質合成反應溶液進行轉錄反應后，添加稀釋溶液稀釋，在該合成溶液中至少將鎂的濃度降低至翻譯的最佳濃度進行翻譯反應。
本發明的一方面是上述任意一種無細胞蛋白質的合成方法，該方法將鎂濃度降低至翻譯最佳濃度，將鎂濃度從約1mM降低到約6mM。
本發明的一方面是上述任意一種無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于轉錄反應在約30～45℃下實施，而翻譯反應在約20～30℃下實施。
本發明的一方面是上述任意一種無細胞蛋白質的合成方法，其特征在于使用麥胚芽提取物。
(a)表示將作為ORF配入GFP遺傳基因的pUC19制作的pEU結構和PCR法建立的轉錄模型建立用引物。
(b)表示SP6 RNA聚合酶產生的轉錄產物。
(c)使用這些mRNA的批式麥胚芽無細胞蛋白質中的蛋白質合成作為14C-亮氨酸攝入量指標進行測定的結果。圖中所謂Cap是在mRNA的5′端上添加7mGpppG合成的帶有Cap的RNA，所謂Circular是將環狀多核苷酸作為轉錄模型建立的mRNA。
圖2是表示采用按照對照例1中的現有方法設計的5′端的引物的轉錄模型的建立方法以及轉錄產物及其翻譯的活性。
(a)是作為轉錄模型建立用的多核苷酸與PCR用引物的模式圖；(b)表示主要PCR產物；(c)是表示從作為PCR產物所得到的轉錄模型預測為由SP6 RNA聚合酶轉錄的RNA分子中的模式圖；圖3是表示采用按照對照例1現有方法設計的5′端的引物由建立的轉錄模型得到的轉錄產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
各電子流是分別配入3種cDNA或GFP遺傳基因(如圖中所示翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的轉錄模型所得到的mRNA，左側電子流為分子量標記。星狀標記表示整個長度的轉錄產物。
圖4是表示使用由對照例1現有方法設計的5′端的引物建立的轉錄模型所得到的轉錄產物，實施無細胞蛋白質合成后的翻譯產物的自體放射照相術。
各電子流是由分別配入3種cDNA或GFP遺傳基因(如圖中所示翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的轉錄模型所得到的轉錄產物翻譯的翻譯產物。左側的電子流為分子量標記。星狀標記表示整個長度的翻譯產物。箭頭表示低分子產物。
圖5是表示使用實施例2中RNA聚合酶啟動子分斷型標記的轉錄模型的建立方法及其轉錄產物以及其翻譯活性。
(a)是作為轉錄模型建立用的模型用的多核苷酸與PCR用引物的模式圖；(b)表示主要PCR產物；(c)是表示從作為PCR產物所得到的轉錄模型預測為由SP6 RNA聚合酶轉錄的RNA分子中的模式圖；圖6是使用實施例2中RNA聚合酶啟動子分斷型引物建立的轉錄模型所得到的轉錄產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
各電子流是由分別在將3種cDNA或GFP遺傳基因(如圖中所示翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、14kDa以及27kDa)插入的模型多核苷酸制作的轉錄模型得到的mRNA。左側的電子流為分子量標記。
圖7是使用由實施例2中RNA聚合酶啟動子分斷型引物建立的轉錄模型所得到的轉錄產物無細胞蛋白質合成后的翻譯產物的自體放射照相術。
各電子流是由分別配入3種cDNA或GFP遺傳基因(如圖中所示翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的轉錄模型所得到的轉錄產物翻譯的翻譯產物。左側的電子流為分子量標記。
圖8表示采用由實施例2中RNA聚合酶啟動子分斷型引物建立的轉錄模型轉錄的mRNA透析式麥胚芽無細胞蛋白質合成方法合成蛋白質。
各電子流使用從分別配入3種cDNA或GFP遺傳基因(如圖中所示翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模型多核苷酸制作的轉錄模型所得到的轉錄產物翻譯的翻譯產物。左側的電子流為分子量標記。星號表示各轉錄產物。
圖9表示采用實施例3中稀釋方式的麥胚芽無細胞蛋白質合成方法合成蛋白質。(a)測定現有的批式( )與稀釋法( )中的14C-亮氨酸的蛋白質攝入量的時效變化的結果，因此縱軸的放射能讀數用等量的胚芽提取液表示；(b)是所得到的蛋白質的自體放射照相術；

圖10表示采用實施例4中轉錄以及翻譯整體型稀釋方式麥胚芽無細胞蛋白質合成方法合成的蛋白質。(a)測定現有的批式( )與稀釋法( )中的14C-亮氨酸的蛋白質攝入量的時效變化的結果，圖中小 、中 、大 表示轉錄反應階段中RNA合成基質濃度，分別為1.5mM、2.5mM、3.0mM。( )是現有的批式；( )表示稀釋法。
(b)是所得到的蛋白質的自體放射照相術；圖11表示由cDNA試驗合成蛋白質試驗方法的概圖。
以下，以麥胚芽無細胞蛋白質合成系以及該合成系中能夠得到功能的轉錄模型的設計方法和建立方法為例說明本發明，本發明的基本原理不僅限定于本專利說明書所表示的方法，而且也可應用在采用由其它微生物和動物細胞的細胞提取物的無細胞蛋白質合成系及其使用的轉錄模型的設計與建立上。轉錄模型建立中使用的引物結構發明者等使用已經穩定且可實現高效率的麥胚芽提取液的無細胞蛋白質合成系，研制了高翻譯模型活性中所需要的mRNA的5′及3′端非翻譯結構，且正在申請專利(WO01/27260號公報)。尤其是搞清了mRNA中賦予長鏈的3′端非翻譯結構，對提高無細胞蛋白質合成反應效率是極其有效的。
(1)3′端的引物的結構由于通過PCR法建立了對于增強翻譯模型活性是有效的、且具有盡可能短的3′端非翻譯結構的mRNA的轉錄模型，因此作為標準遺傳基因，以配入水母的綠色螢光蛋白質(Green Fluorescent Protein)(GFP)遺傳基因的質粒[參照圖1的(A)]為模型實施了PCR。
在由PCR法制造了GFP遺傳基因的轉錄模型放大用的5′端的引物中，使用了由5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′的堿基序列構成的多核苷酸。
3′端的引物使用下述3種引物(參照圖1)進行了比較。引物III(序列表的序列編號1)是形成在抗藥性標記遺傳基因(在圖1中為Ampr)的轉錄終止子序列與DNA轉錄初始的堿基序列間存在著的堿基序列與互補鏈的堿基序列，引物I及II是參考序列。
引物I5′GGGAAGATAAACAGTATTTT3′(mRNA1轉錄用)
引物II5′CCCTCGAGGCGTGGGCCCCA3′(mRNA2轉錄用)引物III5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′(mRNA3轉錄用)研究結果發現，引物III作為轉錄模型結構用的3′端的引物是最理想的，可以提供為得到具有高翻譯模型活性的mRNA的最佳轉錄模型。
作為使用PCR法合成構成無細胞蛋白質合成法中使用的翻譯模型分子3′端非翻譯序列的轉錄模型的堿基序列，可以例舉出由上述序列表的序列編號1中記述的堿基序列構成的引物III作為理想的序列結構。但是不僅限定于此，而且也可以是由在含有克隆遺傳基因的傳病媒介的抗藥性遺傳基因等標記遺傳基因的轉錄終止子序列與DNA轉錄初始堿基序列(Ori)一部分的序列之間存在的堿基序列，例如堿基序列構成的引物由含有各個傳病媒介固有的堿基序列與形成互補鏈的堿基序列，但不是具有特定的堿基序列的物質。例如含有序列表的序列編號1中記述的堿基序列的主要堿基序列；與這些堿基序列在核糖核酸控制基因條件下可形成雜交的堿基序列；而且也可以是由這些互補的堿基序列構成的引物。因此，所謂“在核糖核酸控制基因條件下進行雜交”意味著，例如在6×SSC、0.5％SDS以及50％甲酰胺溶液中升溫到42℃后，在0.1×SSC、0.5％SDS溶液中，甚至在68℃清洗條件下依然可以觀察到呈陽性的雜交信號。例如通過Molecular CloningALaboratory Manual(戈德爾哈博實驗室，1989)等記述的方法，可得到這種堿基序列。
如果使用涉及本發明的上述3′端的引物，則可用PCR法簡便得到對增強翻譯模型活性有效、且盡可能短的3′端非翻譯結構的mRNA的轉錄模型。由PCR法放大長鏈DNA，在其反應性質上一般說來往往是比較困難的，但是通過采用本發明則可采用PCR法建立現在被認為是困難的長鏈非翻譯領域中所添加的mRNA的轉錄模型。
(2)使用由PCR法產生現有方式的5′端的引物轉錄模型的設計及結構作為標準遺傳基因，利用了分別在質粒pUC19克隆白鼠肝臟的3種cDNA(分別將18kDa、25kDa、44kDa的編碼蛋白質)與GFP(27kDa的蛋白質)編碼的cDNA。
在第一階段的PCR中，作為5′端的引物使用了具有來源于煙草花斑病毒的Ω堿基序列(5′ACATTCTACAACTACA3′；序列表的序列編號5)的下述引物3。在以下示出的堿基序列中，下劃線部分的ATG是ORF的初始密碼，X是遺傳基因固有的ORF的5′端的堿基序列。因此，作為遺傳基因固有的ORF的5′端的堿基序列，使用了從上述各cDNA的5′端連續的19個核苷酸構成的堿基序列，X的數量也可是約13個～30個。
引物35′ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX3′作為PCR用的3′端的引物使用了上述mRNA3轉錄用引物III(序列表的序列編號1)。
在第2階段的PCR中，作為5′端的引物，使用了對應于RNA聚合酶的啟動子堿基序列的全部范圍的下述引物1。
引物15′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′和繼該堿基序列后含有Ω序列及遺傳基因固有的ORF的5′端堿基序列(XXXXXXXXXXXXXXXXXXX，19堿基)的以下序列(引物2)。因此，作為遺傳基因固有的ORF的5′端堿基序列，使用了從上述各cDNA的5′端連續地19個核糖苷酸構成的堿基序列，X的數量也可是約13個～30個。
引物25′GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′PCR用3′端的引物，以上述mRNA3轉錄用的引物III(序列表的序列編號1)的堿基序列為基礎，使用了在啟動子上錯開3個堿基，設計、制造下述引物IV(序列表的序列編號4)。
引物IV5′GTCAGACCCCGTAGAAAAGA3′(3)在使用了啟動子分斷型引物的轉錄模型的設計及結構在低背景的轉錄模型的設計及結構中，作為5′端的引物，設計、使用了由RNA3聚合酶序列與在各個部分具有互補性的兩種不同的堿基序列構成的引物。該引物一方面雖在從啟動子的5′端，在至少含有啟動子功能一部分的堿基序列上具有互補的序列，但是啟動子的3′端的RNA聚合酶識別部位的一部分，至少由不具有互補的堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸(A)，例如是①下述的引物；另一方面，從啟動子的3′端，在至少含有RNA聚合酶識別部位一部分的堿基序列上具有互補的啟動子的5′端，由在啟動子功能部位至少不具有互補的堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸(B)；例如下述引物②，即上述兩種引物是在各啟動子堿基序列其它一部分的堿基序列上具有互補堿基序列的啟動子的分斷型引物。該兩種啟動子分斷型引物具有從使用該兩種引物通過PCR建立的DNA發生轉錄，但僅任意一種該啟動子都具有不從所建立的DNA發生轉錄的特征。這里舉例示出的啟動子分斷型引物①以及②是SP6啟動子基礎的引物，但涉及本發明的啟動子分斷型引物不僅僅限于上述種類，而且根據這些堿基序列可做成各種各樣的啟動子。
引物①5′GCGTAGCATTTAGGTGACACT3′(序列表中的序列編號2)(下劃線部分是與SP6啟動子的5′端互補序列，但缺少與3′端的互補序列ATA)。
引物②5′GGTGACACTATAGAA(序列表中的序列編號3)，(下劃線部是與SP6啟動子的3′端互補的序列，但缺少與5′端的互補序列ATTTA)連接Ω序列(71堿基)和而且連接著由克隆的遺傳基因產生的ATG。
引物③與上述引物3相同作為標準遺傳基因，利用了3種來源于白鼠肝臟的cDNA和分別在pUC19上克隆了編碼GFP的cDNA的引物。在第一階段，作為5′端的引物，繼作為來源于Ω序列的5′ACATTCTACAACTACA3′(序列表的序列編號5)后，使用了含有與從目的遺傳基因翻譯初始密碼ATG開始了22堿基的ORF的5′端相互輔助系列的引物(完整長度38堿基)；作為3′端的引物，使用了mRNA3轉錄用的引物III(序列表的序列編號1)。而且在第二階段的PCR，作為5′端的引物使用引物①及②；作為3′端的引物，使用上述引物IV(序列表的序列編號4)的(引物的摩爾比①∶②∶IV＝100∶1∶100)。PCR不一定是需要分為2個階段，即使將整個工程在一個階段實施，那么本發明的基本技術也不發生任何變化。
在比較使用上述現有方式的5′端的引物建立起來的轉錄模型，與涉及上述本發明的啟動子分斷型的5′端的引物建立起來的轉錄模型時，翻譯模型的合成效率以及無細胞蛋白質合成效率，在采用啟動子分斷型引物的這一方比任一種模型都提高了效率。
如引物①及引物②那樣的啟動子分斷型引物，甚至可使用在轉錄反應后不發生目的尺寸的mRNA分離，而且對為了由PCR法建立可使用在無細胞蛋白質合成系的、具有5′端非翻譯序列的高翻譯活性的mRNA的翻譯模型是有用的。即在從使用啟動子分斷型引物，由PCR法得到的轉錄模型轉錄的mRNA中，幾乎不含有混雜在以使用現有型的引物所得到的mRNA中產生非特異性的短鏈mRNA。在無細胞蛋白質合成方法中，非特異性短鏈mRNA以目的蛋白質的強力合成阻礙物發生作用，而構成了使合成量顯著降低的原因。但是如果使用涉及本發明的翻譯模型，則由于不影響該短鏈mRNA，因此可更高效率地進行無細胞蛋白質的合成。另外由于使用啟動子分斷型引物，從用PCR法得到的轉錄模型轉錄的mRNA在合成后，可不將目的尺寸的mRNA單獨分離，在無細胞蛋白質合成系中使用，因此可簡便地進行該mRNA的合成或從該mRNA合成蛋白質。
為建立成為上述無細胞蛋白質合成法中使用的翻譯模型分子合成用的轉錄模型的DNA堿基序列的5′端PCR用的引物的堿基序列，可能是包含具有RNA聚合酶的啟動子和部分具有互補性的堿基序列；可能是序列表的序列編號2或序列表的序列編號3中記述的堿基序列；可能是含有序列表的序列編號3中記述的堿基序列的堿基序列；可能是含有這些堿基序列的主要部分的堿基序列；可能是這些堿基序列與在核糖核酸控制基因條件下可雜交的堿基序列，或這些互補的堿基序列。
如果采用涉及本發明的上述5′端的引物，則通過PCR法可簡便地得到將成為背景的轉錄產物量控制到最小限度的轉錄模型。在使用上述端的引物建立轉錄模型時，也可使用例如由作為上述5′端的PCR用的引物的堿基序列不同的堿基序列構成的兩種引物。而且，作為3′端的引物，使用涉及本發明的上述3′端的引物是理想的。
在此，上述兩種5′端的引物是滿足由僅用任意一種引物所建立的DNA不發生轉錄的這種條件。一種該引物只是從啟動子的5′端在至少含有啟動子功能部位一部分的堿基序列上具有互補的序列，但至少在啟動子的3′端的RNA聚合酶識別部位的一部分上，由不具有互補堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸(A)；由該引物的其它一種從啟動子的3′端至少在含有RNA聚合酶識別部位的一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列，但至少在啟動子的5′端的啟動子功能部位由不具有互補堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸(B)是理想的。
而且上述多核苷酸(B)在其序列上而且繼續插入GA或GAA序列，在其下游賦予mRNA的翻譯放大序列；而且也可是在不含有翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因的ORF(翻譯框)的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的堿基序列上由連接互補的序列的堿基序列構成的多核苷酸。賦予mRNA的翻譯放大的堿基序列，而且也可以是由連接在不含有翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因ORF(翻譯框)的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的堿基序列中互補的序列構成的多核苷酸。賦予mRNA放大的堿基序列，如由煙草花斑病毒的Ω序列和紫花苜蓿花葉病毒的前導序列的堿基序列(AMV)，并將其直接結合的AMV的Ω序列，或由Ω序列的29種堿基Ω序列等，也可是不限于此而賦予翻譯增大的堿基序列。
另外作為上述的5′端的引物，可使用含有將在不含有通過添加上述多核苷酸(A)與多核苷酸(B)，在多核苷酸(B)可進行退火的堿基序列之后5′端翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因的ORF的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的堿基序列連接的多核苷酸(C)的3種多核苷酸的引物。目的遺傳基因ORF(翻譯框)的一部分是由該ORF的5′端連續地約13堿基至約30堿基構成的堿基序列。在此多核苷酸(B)從啟動子的3′端至少在含有RNA聚合酶識別部位的一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列，即至少不具有該啟動子的5′端的催化劑功能部位上的互補的堿基序列的堿基序列后插入GA或GAA序列，在其下游還連接賦予mRNA翻譯放大的序列；而且也可是由連接在翻譯初始密碼ATG或不含有目的遺傳基因的ORF的一部分或ORF的ORF上游(5′端)的堿基序列連接互補序列的堿基序列構成的多核苷酸。
另外在上述5′端的引物的翻譯部分初始密碼與ORF間，可配入組氨酸標記谷胱甘肽S-轉移酶(GST)或myb等標記或抗原表位合成用的堿基序列。如果使用這樣的引物制作成的轉錄模型，則在最終得到的翻譯產物上述標記或抗原表位可以該翻譯產物的精制或標記用以添加。
上述兩種引物搭配或上述3種引物的搭配，可作為為制作各種遺傳基因的轉錄模型用、或具有通用性的5′端的引物來加以使用。以下將把引物搭配稱作引物組。另一方面，加在上述引物組中作為3′端的引物在含有克隆遺傳基因的傳病媒介的標記基因，例如在含有抗藥性遺傳基因等轉錄終止子序列和一部分Ori的序列間存在著的堿基序列可形成互補鏈的堿基序列構成的多核苷酸搭配的引物組是由于通過PCR制作成各種各樣基因及其轉錄模型，因此可用作具有通用性的有用的基因組。
(轉錄及翻譯整體型稀釋方式蛋白質的合成方法及其轉錄和連續翻譯型稀釋式蛋白質的合成方法)如果利用由使用涉及本發明的引物所得到的轉錄模型，則可簡便且高效率地合成蛋白質。例如上述原理及方法建立的轉錄模型的合成mRNA作翻譯模型，添加在蛋白質合成中含有足夠量的麥胚芽提取液的無細胞蛋白質合成反應溶液中，進行無細胞蛋白質的合成，則與使用現有的轉錄模型合成的mRNA進行蛋白質的合成相比，可長時間地持續合成反應。在由該轉錄模型合成mRNA時，可利用眾所周知的轉錄反應。無細胞蛋白質的合成方法也可根據現有方法進行[Madin K.et.al.，(2000)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564](WO00/68412號公報)。另外，如果采用凝膠過濾法精制合成mRNA，則可進一步提高蛋白質的合成效率。
另一方面，如果將涉及本發明的引物由PCR法得到的轉錄模型與已經報告的轉錄及翻譯整體型無細胞蛋白質的合成方法(WO00/68412號公報)配合進行蛋白質的合成，那么將另外用途轉錄制作成的mRNA添加到無細胞蛋白質合成系中的繁雜性是可以回避的。在使用該轉錄模型的轉錄及翻譯整體型麥胚芽無細胞蛋白質合成法中，首先將轉錄反應在適用于轉錄反應的條件下進行。理想的是將轉錄反應在約30～45℃，更理想的是在約35～40℃中進行。然后通過在反應溶液中添加適當的稀釋液達到適于翻譯反應的條件后進行蛋白質的合成。翻譯反應的溫度選擇為按照目的蛋白質的適合該翻譯的溫度，理想的是約20～30℃。而且稀釋溶液如果是適用于添加翻譯反應所需要的能量源及氨基酸等的翻譯反應的緩沖時，該反應溶液中的鎂濃度至少要降低到翻譯的適當溫度，最理想的是應降到約1mM～6mM而添加適當的容量。通過添加稀釋溶液可同時降低該反應溶液中含有的轉錄基質及轉錄生成物的濃度，其結果可使蛋白質合成反應的持續時間延長，進而提高合成效率。
具體說來，例如轉錄翻譯整體型稀釋方式無細胞蛋白質合成方法，首先配制含有容量為48％的下述最終濃度的麥胚芽提取液(濃度200A260units/ml)的下列濃度的組成[1,000units/ml核糖核酸酶阻礙物(RNAsin)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、16mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、2.5mM腺苷三磷酸(ATP)、2.5mM鳥苷三磷酸(GTP)、2.5UTP、2.5CTP、1500單元/ml的SP6 RNA聚合酶、16Mm肌磷酸、1.48mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)、25μg/ml的轉錄模型的DNA]構成的反應溶液，在30℃進行3小時的轉錄反應，然后用稀釋反應液。稀釋溶液由30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、0.4mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.94mM的ATP、0.25Mm的GTP、16mM肌磷酸、0.380mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)構成。通過這種稀釋主要成分變成如下的濃度，即麥胚芽提取液的原液濃度8％(原液濃度200A260nmunits/ml)、30Mm HEPS-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、3mM醋酸鎂、1.2mMATP等。另外，由于未查清GTP、UTP、CTP在反應中的消耗量，因此尤其不能計算稀釋后的各濃度。
在上述轉錄和翻譯整體型稀釋方式的無細胞蛋白質合成方法中，將作為翻譯反應中需要的細胞提取物的麥胚芽提取物最初添加在反應溶液中，因此在該轉錄反應中也存在該提取物。該提取物無需從最初添加，而在合成后添加稀釋溶液時，為了使最終濃度能達到適合于翻譯反應濃度，稀釋溶液和同時或在稀釋溶液中混合的也可添加在無細胞蛋白質合成系中。這種方法在這里被稱作轉錄以及連續式翻譯稀釋方式無細胞蛋白質合成法。
轉錄以及翻譯整體型或轉錄以及連續翻譯型的稀釋式無細胞蛋白質合成法不含有繁雜的操作，因此簡便，而且可直接用PCR法建立轉錄模型，在無細胞系可高效率地合成蛋白質。而且，如果將目的遺傳基因產物以組氨酸標記和谷胱甘肽S-轉移酶溶合的蛋白質的形式合成，由于使用與其相對應的配位體的固化物可以高效率地精制遺傳基因產物。
例如如圖11所示，使用具有可在所有遺傳基因上通用的涉及上述本發明通用性的引物組(5′端的3種或3′端的1種)，通過轉錄以及翻譯整體型或轉錄以及連續翻譯型的稀釋方式合成無細胞蛋白質法可簡便、且高效率地進行合成。
首先在反應容器中加cDNA，這時作為反應容器，使用市場銷售的多穴槽濃度滴定盤，例如96穴槽濃度滴定盤等，在每個穴槽內分別加不同蛋白質進行翻譯的cDNA，一次性全成多種蛋白質。于是在多穴槽濃度滴定盤的各個穴槽中，加不同種的cDNA，可用作cDNA實驗。CDNA實驗也可使用市場銷售的產品。對上述cDNA實驗添加上述引物組進行PCR，其結果形成轉錄模型。
然后在實施轉錄及翻譯整體型稀釋方式的蛋白質合成法時，在各容器中加入RNA聚合酶、4NTPs、麥胚芽提取物等的無細胞蛋白質合成用反應溶液(例如參考下述的實施例5)，將溫度保持在約30℃～45℃，更理想的是在約35℃～40℃進行所要求時間的轉錄反應。然后添加稀釋溶液，將鎂濃度降低到翻譯反應最佳濃度后，將溫度保持在約20℃～30℃進行翻譯反應，其結果可得到作為翻譯產物的蛋白質。
在轉錄模型制作結束后實施連續翻譯型稀釋方式的蛋白質合成法時，在各容器中加入含有RNA聚合酶、4NTPs的轉錄用溶液(例如參照下述實施例4)將溫度保持在約30℃～45℃，更理想的是保持在約35℃～40℃進行所要求時間的轉錄反應，將溫度保持在約20℃～30℃進行翻譯反應。
然后添加含有麥胚芽提取物等的無細胞蛋白質合成用反應溶液，在預先以添加上述無細胞蛋白質合成用反應溶液的其它反應容器中，例如在多穴槽濃度滴定盤中以該反應后的溶液作底層，在該無細胞蛋白質合成用反應溶液成為上層，靜靜地疊層放置，也可進行無細胞蛋白質的合成反應。在這種方法中，在上層和下層間形成的界面上，2層溶液中含有的物質發生擴散，逐漸將上層與下層相互混合，因此可緩緩地連續地進行翻譯反應，因此可在長時間內進行蛋白質的合成。
以上通過本發明利用迄今為止被視為困難的PCR法的簡便、高效率的無細胞蛋白質的合成，通過利用麥胚芽高效率無細胞蛋白質合成系，以及涉及本發明的mRNA轉錄模型建立方法以及轉錄及翻譯整體型稀釋方式無細胞蛋白質合成方法或轉錄以及連續翻譯型無細胞蛋白質合成法首次成為可能。另外，使用包括啟動子的部位翻譯放大結構以及ORF的一部分的現有單鏈引物建立的無細胞蛋白質合成模型用DNA，則由于除目的遺傳基因翻譯產物以外，產生大量的低分子翻譯產物，因此翻譯效率降低，但是通過本發明可消除這一缺點。通過采用上述啟動子分斷型引物的PCR法建立無細胞蛋白質合成用轉錄模型的原理，不僅僅局限于使用麥胚芽提取物的無細胞蛋白質的合成系，而且也可作為使用大腸菌等其它細胞提取物的無細胞蛋白質的合成系中的模型設計原理。
若根據本發明，則在克隆為任意傳病媒介的遺傳基因中，如果準備在該基因中具有互補序列的5′端和3′端固有的引物，則通過使用可在所有基因上具有可通用使用的通用性上述各引物組對被克隆的任意基因都可簡便、高效率地進行無細胞蛋白質的合成。因此本發明在于提供一種基礎的重要技術，該技術將面對在基因組項目即將結束的同時所形成的龐大數量的遺傳基因的功能解析與結構解析為基礎的遺傳基因產物(蛋白質)的生產。
作為PCR的模型使用了以示于圖1(A)中的麥胚芽無細胞蛋白質合成系用的質粒而研制的pEU(WO01/27260號公報)中通過通常方法克隆水母的GFP遺傳基因的物質。這種質粒的結構是在5′端上游上序列SP6 RNA聚合酶的引物序列，然后是作為翻譯初始反應系序列的煙草花斑病毒(TMV)的Ω序列，然后連接GFP遺傳基因，在3′端下游插入轉錄初始點(Ori)，然后在其下游作為標準遺傳基因插入抗氨芐青霉素遺傳基因(Ampr)[圖1(A)]。
被使用的5′端的引物是含有SP6啟動子的引物(5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′)，3′端的引物I、II或III(序列表的序列編號1)[圖1(a)]，其序列如下。這些引物是委托AMASIRM FALMASIR公司制造的。
引物I5′GGGAAGATAAACAGTATTTF3′(mRNA1轉錄用)引物II5′CCCTCGAGGCGTGGCCCCA3′(mRNA2轉錄用)引物III5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′(mRNA3轉錄用)作為編入上述水母GFP遺傳基因的pEU，供模型用的上述引物在以下條件下進行了PCR。
PCR用反應溶液1× ExTaq緩沖劑200μM dNTP(脫氧核糖核苷酸)10nM 引物(5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′)10nM 引物I、或II或III0.025U ExTaq DNA聚合酶50pg/μl 模型質粒DNAPCR的反應條件98℃下1分鐘↓
(98℃下10秒鐘→60℃下30秒鐘→72℃下5分鐘)作為30循環↓72℃下4分鐘↓4℃然后將上述得到的PCR產物作為轉錄模型，使用SP6 RNA聚合酶使按下述配制的轉錄溶液在37℃下反應2小時得到作為轉錄產物的mRNA。
轉錄用溶液(mRNA溶液)(μl) 最終濃度PCR產物2.50.4μl/μl5×緩沖劑 5 1×25mM NTPs 3 3mM111U/μl RNase阻礙物 1 4.4U/μl50U/μl SP6RNA聚合酶 0.75 1.5U/μl離子交換水(Milli Q)12.75合計 25另外，將這里使用的5×緩沖劑的組成示出下表。
5×緩沖劑 (1×最終濃度)400mM HEPES-KOH pH7.6 80mM80mM醋酸鎂 16mM10mM精脒 2mM50mM二硫蘇糖醇 10mM
圖1(b)中示出具有由上述設計建立的轉錄模型轉錄的不同堿基數的3′端非翻譯序列mRNA分子的模式圖。mRNA1是使用引物I建立的結構，mRNA2是使用引物II建立的結構，mRNA3是使用引物III(序列表的序列編號1)建立的結構。
圖中的Cap是在mRNA的5′端上添加7mGpppG合成的帶有Cap的GFPmRNA，為了使用mRNA2的引物II建立的561堿基的3′端非翻譯序列。而且，該圖中Circular是以環狀質粒為轉錄模型而建立的GFPmRNA。主要包括1900堿基或5900堿基構成的兩種長鏈的3′端非翻譯序列。這些序列根據WO01/27260號公報已經公布的方法制作并分別對照實驗用于無細胞蛋白質的合成反應。
使用補片式麥胚芽無細胞蛋白質合成系，在3小時的翻譯反應后研究了使用上述建立的轉錄模型所得到的mRNA的轉錄模型活性。該翻譯反應是根據Madin等人的方法[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564]以及WO00/68412號公報中記述的方法實施的。而且蛋白質的合成以14C-亮氨酸的攝入量的測定為指標進行測定，縱軸的放射能讀數用胚芽提取液量表示。其結果如圖1(c)所示，由使用引物III(序列表的序列編號1)建立的模型轉錄的mRNA3(5′端為Ω序列，在3′端具有1896堿基的非翻譯序列GFPmRNA)高效率的翻譯效率，其效率與具有由帶有Cap的mRNA和周期序列(Circular)質粒轉錄的長鏈的3′端非翻譯序列的mRNA媲美。
即沒有查清在構成為添加在麥胚芽無細胞蛋白質合成系中使用的mRNA上3′端非翻譯序列用的轉錄模型的DNA堿基序列的結構中，以在克隆例如像引物III(序列表的序列編號1)的堿基序列那樣的遺傳基因的終止子的抗氨芐青霉素遺傳基因的轉錄終止子序列和Ori間存在的堿基序列和能形成互補鏈的堿基序列作為引物來設計而使用的方法是有效的。
對照例1轉錄模型結構用引物的設計與轉錄模型的PCR結構(采用現有方法的轉錄模型的建立法)為了通過PCR法得到具有5′及3′mRNA轉錄模型，因而設計并建立了PCR中使用的引物。所謂mRNA的5′端非翻譯結構，如已在WO01/27260號公報中公布的那樣，來源于紫花苜蓿花葉病毒(AMV)的堿基序列、煙草花斑病毒(TMV)的Ω序列以及使其直接結合的AMV-Ω序列，而且將剪短的Ω序列29堿基Ω序列添加到mRNA中，對提高無細胞蛋白質合成的反應效率是極其有效的。在此選用這些5′端非翻譯結構中的TMVΩ序列作為5′端非翻譯序列。作為3′端非翻譯序列使用了上述實施例1中示出的1896堿基構成的序列(參照圖1)。
首先研究了使用作為轉錄模型的5′端序列結構法通用的3種引物的現有的PCR法(圖2)。在圖2(a)中，有關這里所嘗試的PCR法的概況示出了配入目的蛋白質翻譯的遺傳基因的質粒結構、5′端序列結構用3種引物(引物1、2、3)與3′端序列結構用的引物III的模式圖。將引物1、2、3的堿基序列表示如下，在引物3的堿基序列中X表示目的遺傳基因固有的ORF的5′端的堿基序列。引物III與實施例1中使用的引物相同。這些引物是與實施例1相同的方法制作的。引物15′GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3′引物25′GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′引物35′ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX3′作為轉錄模型結構用的模型使用插入在pUC19上由cDNA試驗選出的基因的質粒。在質粒中，分別與實施例1相同的方法插入白鼠肝臟的3種cDNA以及GFP遺傳基因(翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)。與實施例1相同進行使用上述引物的PCR，將所得到的PCR產物作為轉錄模型，與實施例1相同的方法在試驗上進行2小時的轉錄反應得到了轉錄產物。
在圖2(b)中表示現有PCR法得到的主要放大產物與非特異性產生的短鏈DNA的副產物，而且在(c)中示出將該副產物以原狀態轉錄模型使用的合成轉錄產物的模式圖。在圖2(c)中，(1)中表示的mRNA是完整長度的mRNA，可給予完整長度的翻譯產物；(2)中示出的mRNA給予低分子翻譯產物；(3中示出的mRNA由于缺少Ω序列，因此而沒有翻譯模型活性。如果從轉錄反應中的生物化學特性考慮，那么所合成的RNA分子大多數可以預想為是DNA鏈長短的PCR產物所產生的。
圖3表示采用常規方法進行上述轉錄產物的聚丙烯酰胺電泳圖。各電子流表示使用由分別插入3種cDNA或GFP遺傳基因(翻譯產物的分子量為25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)基因的模型質粒制作的轉錄模型所得到的轉錄產物，即mRNA。而且星狀標記表示完整長度的轉錄產物。從圖3可知，ORF越大的遺傳基因其轉錄效率越低，而且使用這種方法轉錄的大部分產物是低分子RNA，所以由PCR法產生的非特異性短鏈DNA分子中含有啟動子。這種現象很好的與上述圖2(b)及(c)的預測完全吻合。
然后，從上述的各種復制產物中不能分離目的尺寸的mRNA，通過在將轉錄產物脫氯后添加麥胚芽無細胞蛋白質合成系中進行3小時反應，得到翻譯產物并按常規方法將其賦予自體放射照相術進行檢測[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230][Madin K.et.al.(2000)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564]。翻譯反應是根據上述[Madin K.et al(2000)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97，559-564]及WO00/68412號公報記述的方法實施，其結果示于圖4，如圖4中星狀標記所示，發現少量的翻譯產物分別對應于該mRNA量。在轉錄產物中，轉錄產物量多的18kDa蛋白質(參照圖3)的合成量雖高，但大半翻譯產物是分離成在圖4箭頭所示出的SDS-聚丙烯酰胺的低分子領域的低分子。這是在低分子轉錄產物中保持作為5′端的翻譯初始增強結構的Ω序列和ORF的5′端的一部分，但是缺少ORF的3′端的mRNA含量高的部分。由于這些mRNA批具有與翻譯初始基因很強的親和性，因此與目的蛋白質的強力合成阻礙物發生作用而成為明顯降低合成量的原因。
實施例2高效率轉錄模型結構用引物的設計與采用PCR的高效率轉錄模型的結構(著眼于RNA聚合酶啟動子的的轉錄模型結構法)
在根據對照例1中示出的現有方法的引物設計方法中，在反應后不將目的尺寸的mRNA單獨分離，不能得到為采用PCR法將具有在無細胞蛋白質合成系中可使用的5′端非翻譯序列的具有高翻譯活性的mRNA轉錄模型的有效引物。因此，充分靈活運用RNA聚合酶性質的機制，即根據RNA聚合酶識別由完整的堿基序列構成的啟動子不能識別不完整的堿基序列構成的結構的這一事實，通過設計、制造這種有效的引物，而且實施了采用該引物的轉錄模型的建立方法(圖5)。
在圖5(a)中，配入以采用這里所試驗的PCR方法中使用的目的蛋白質進行翻譯的遺傳基因的質粒結構，表示5′端序列結構用的3種引物(引物①、②及③)和3′端序列結構用的引物3的模式圖。以下示出各引物的堿基序列。這些引物使用與實施例1相同的方法制作。這里設計的引物①是具有至少含有從引物的5′端的啟動子功能一部分的堿基序列上具有互補的序列是至少在該啟動子的3′端的RNA聚合酶識別部位的至少一部分上不含有互補的堿基序列的結構；引物②具有從該啟動子的3′端在至少含有RNA聚合酶識別部位一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列是在該引物的5′端至少在啟動子的功能部位上不具有互補的堿基序列的結構，即引物引物①及②是啟動子分斷型的引物。引物③與上述引物3相同，引物III與實施例1中使用的引物相同。而且由于在第二階段進行PCR，所以作為3′端非翻譯結構序列用引物，還可使用通過合成引物IV(序列表的序列編號4)。引物IV以上述引物III(序列表的序列編號1)的堿基序列為基礎，在例子中偏離3堿基而設立的結構，因此在下述堿基序列中示出，而且在下述引物序列中X表示質粒中編入的遺傳基因固有的ORF的5′端的序列。
引物①5′GCGTAGCATTTAGGTGACACT3′引物III5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′引物IV5′GTCAGACCCCGTAGAAAAGA3′引物③5′ACATTCTACAACTACAATGXXXXXXXXXXXXXXXXXX3′引物②5′GGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAATG3′圖5(b)示出了使用這種引物放大的主要PCR產物的模式圖。圖5(b)中的(2)及(3)示出的DNA由于采用RNA聚合酶的識別極其低，所以預測出在事實上不能進行RNA合成。而且可以期待采用通過這種方法設計的引物所建立的轉錄模型將變成如圖5(c)。
通過使用這些引物進行了轉錄模型的建立。首先，作為轉錄模型結構用的模型，使用了在pUC19中配入由cDNA試驗選擇的遺傳基因的對照例1相同的質粒。由第二階段的PCR法在下述條件下使用上述引物制作了轉錄模型。在PCR法中作為聚合酶使用了寶公司制造的ExTaq DNA聚合酶。
第一階段PCR用混合物(最終濃度)1× ExTaq緩沖劑200μM dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)10nM 引物③10nM 引物III0.025U ExTaq DNA聚合酶50pg/μl 模型質粒DNA第二階段PCR用混合物(最終濃度)
1×ExTaq緩沖劑200μMdNTP100nM 引物①100nM 引物IV1nM 引物②0.025UExTaq DNA聚合酶0.05μl 第一階段的PCR產物PCR的反應條件(使用與第一階段及第二階段的PCR相同的條件。)98℃下1分鐘↓(98℃下10秒鐘→60℃下30秒鐘→72℃下5分鐘)作為30循環↓72℃下4分鐘↓4℃然后將上述得到的PCR產物作為轉錄模型，使用SP6 RNA聚合酶使按下述配制的轉錄溶液在37℃下反應2小時得到作為轉錄產物的mRNA。
轉錄用溶液(mRNA溶液)(μl) 最終濃度PCR產物10 0.4μl/μl
5×緩沖劑 5 1×25mMNTPs 3 3mM111U/μlRnase阻礙物1 4.4U/μl50U/μlSP6RNA聚合酶0.751.5U/μl離子交換水(MilliQ) 5.25合計 25另外，表中使用的5×緩沖劑的組成是與實施例1中使用的緩沖劑相同。
圖6示出了采用所得到的轉錄產物的聚丙烯酰胺電泳圖的分析結果。沒有發現低分子轉錄產物的存在，而發現了合成具有各遺傳基因的轉錄產物而預測的移動度的RNA。
將這些mRNA標樣進行脫氯作為翻譯模型通過添加在間歇式麥胚芽無細胞蛋白質合成系中進行蛋白質合成。合成反應根據[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]以及WO00/68412號公報記述的方法實施。圖7中示出在26℃下進行3小時蛋白質合成反應后的自體放射照相術進行分析的結果。
若比較圖4和圖7，發現轉錄模型存在著明顯的差別，即使用涉及本發明方法中的設計及所建立的轉錄模型時比現有建立的轉錄模型未發現低分子翻譯產物的合成，而發現了任意蛋白質均可進行高效率地合成。
另一方面，通過使用上述的設計及其所建立的引物使用由PCR得到的轉錄模型，按昭WO00/68412號公報記述的透析膜的透析法進行24小時的無細胞蛋白質的合成。將各反應液的1μl通過SDS凝膠電泳將蛋白質涂成考馬氏亮藍色彩，其結果示于圖8，圖中的星狀標記表示由各遺傳基因合成的蛋白質帶。由各染色帶圖案發現可高效率地合成任意一種蛋白質。通過測定帶的染色強度可以發現每1ml反應溶液，其25kDa蛋白質的合成量為0.5mg、18kDa蛋白質的合成量為3.2mg、44kDa蛋白質的合成量為1.2mg、27kDa蛋白質的合成量為1.3mg。
實施例3(使用由PCR法建立的轉錄模型的稀釋方式麥胚芽無細胞蛋白質合成法)利用實施例2的透析膜的連續式無細胞蛋白質合成法，雖具有高效率，但操作十分繁雜。因此，作為更簡便的方法，在合成含有低濃度胚芽提取液的無細胞蛋白質合成用反應溶液中實施了現有的間歇式無細胞蛋白質的合成反應。
在這種方法中，使用了由現有已知的間歇式無細胞蛋白質合成系中使用的組成的反應溶液[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]。首先作為反應溶液，應配制由含有容量為48％容量的麥胚芽提取液(200A260umunits/ml)的下列最終組成1000units/ml核糖核酸酶阻礙物(RNAsin)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml核糖核酸酶、1.2mMATP、0.25mMGTP、16mM肌酸磷酸、0.380mM精脒以及20種L型氨基酸(各0.3mM)600μg/ml的GFP翻譯的mRNA構成的反應溶液。該mRNA是從由PCR用實施例2記述的方法相同，通過使用上述實施例2中記述的啟動子分斷型引物轉錄的mRNA，在5′端具有Ω序列而不具有CAP結構，擔當著1896堿基的3′端的非翻譯序列。在26℃將上述反應溶液在15分鐘前保溫(藻青蛋白)后通過添加5倍量的稀釋溶液[30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、1.2mMATP、0.25mMGTP、16mM肌磷酸、0.380mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)，加以稀釋(稀釋方式)。
另外，在以氨基酸的攝入量為指標測定蛋白質合成時，使用在稀釋溶液中每1ml添加4μCi14C-亮氨酸的溶液。在稀釋后重新在26℃下初始蛋白質的合成反應。將其結果示于圖9(a)中。縱軸的放射能讀數是由單位等量的麥芽提取液量表示。14C-亮氨酸的攝入量，即蛋白質合成反應在現有的間歇方式( )中，在1個小時內停止反應；但在涉及本發明的稀釋方式( )中合成反應持續9小時，但與現有的間歇方式相比可合成約8倍量的蛋白質。而且將所得到的蛋白質添加在自體放射照相術中，將其結果示于圖9(b)中。圖中左側電子流是表示分子量標記，箭頭是表示作為合成反應物的GTP。即使在自體放射照相術中可以查清在稀釋方式中合成反應可以持續9小時。另一方面，以完整長度的蛋白質從其移動度合成產物，可儲存在反應溶液中。
這里所表示的稀釋方式的無細胞蛋白質合成法不包括復雜的操作，即使使用在PCR中建立的轉錄模型，也可高效率地合成無細胞蛋白質。
實施例4(使用由PCR法建立的轉錄模型的轉錄以及連續翻譯型稀釋方式麥胚芽無細胞蛋白質合成法)
實施例3中的稀釋方式麥胚芽無細胞蛋白質合成方法，具有高的翻譯效率，但也存在著必須將其它轉錄的mRNA添加在無細胞蛋白質合成系中的這種操作的繁雜性。因此，實施了一種將現有轉錄系及翻譯系和稀釋方式同時搭配的新的轉錄及連續翻譯型稀釋方式無細胞蛋白質的合成法。首先配制了下述示出的轉錄反應用溶液。這里使用的PCR產物是使用在上述實施例2中記述的啟動子的分斷型引物以及Ampr與Ori間具有互補性的3′側引物，通過與實施例2相同的方法建立的轉錄模型中，作為遺傳基因插入GFP結構。在37℃下通過將該轉錄用溶液保溫3小時后，合成了mRNA。
轉錄用溶液(mRNA溶液)(μl) 最終濃度PCR產物 10 0.4μl/μl5×緩沖劑5 1×25mMNTPs 3 3mM111U/μlRnase阻礙物 1 4.4U/μl50U/μlSP6 RNA聚合酶 0.75 1.5U/μl離子交換水(MilliQ) 5.25合計 25另一方面，通過僅改變上述轉錄溶液組成中的NTPs的最終濃度配制組成為2.5mM或1.5mM的溶液，并分別進行轉錄反應。而且，這里使用的5×緩沖劑的組成是與實施例1中使用的組成相同。
所得到的mRNA溶液由于鎂離子、ATP、GTP濃度比翻譯反應的最佳濃度高，所以僅僅通過添加無細胞蛋白質合成反應用麥胚芽提取液，通過這種狀態連續，在同一系內不能進行翻譯反應。為此，在所得到的mRNA溶液25μl中添加了下述無細胞蛋白質合成用反應溶液。由此鎂離子的濃度可稀釋到翻譯反應的最佳濃度，即達到3.19mM為止，可合成蛋白質。
反應溶液(μl)最終濃度麥胚芽提取物 128％1000mMHEPES-KOH pH7.8 2 30mM4000mM醋酸鉀 3.5 100mM1000mM醋酸鎂 0 3.19mM10mM精脒 1 0.4mM50mM二硫蘇糖醇1.5 2.5mM2.5mM氨基酸混合物 16.6 0.3mM100mMATP 1.3 1.2mM20mMGTP 0 0.33mM500mM肌酸磷酸 4.8 16mM111U/μlRnase阻礙物 0 0.74U/μl15μg/μltRNA 2 0.2μg/μl40μg/μl肌酸激酶 1.5 0.4μg/μl100μCi/ml14C-亮氨酸 3 4μCi/ml離子交換水(Milli Q) 75.8
而且通過該稀釋操作，使阻礙翻譯反應的的轉錄基質的殘余成分核糖核苷三磷酸以及副產物的焦磷酸降低到1/6。在該操作后，反應溫度設定為作為翻譯溫度的26℃，繼續保溫。將其結果示于圖10。
在圖10(a)中，示出了由氨基酸攝入量測定出的GFP的合成結果。NTPS濃度在使用2.5mM(中 )或3mM(大 )的轉錄溶液時，顯示出合成反應可持續9小時，比間歇式( )可合成約8倍量的蛋白質。該合成效率與實施例3中示出的mRNA添加型稀釋方式無細胞蛋白質合成系( )的程度相同。
另一方面還示出了圖10(b)所得到的蛋白質的自體放射照相術，從該圖中也發現了在轉錄及連續翻譯型稀釋方式中，加上合成反應可持續9小時，由其移動度合成產物作為整個長度的蛋白質，正儲存在反應液中。在轉錄反應中使用的核糖核苷酸濃度在2.5mM(中 )時，所合成的蛋白質量呈最大值，在SDS-凝膠電泳后，可得到考馬氏亮藍染色法染色的蛋白質圖案，在測定GFP染色帶的強度時，每1ml反應液的GFP的合成量為0.82mg。
如上所述，使用啟動子分斷型引物以及Ampr和Ori具有互補性的3′側的引物，通過采用與實施例2相同的方法建立的轉錄模型，可實施轉錄及連續翻譯稀釋方式麥胚芽無細胞蛋白質的合成法，進而可效率更好、更簡便地蛋白質合成。
實施例5(使用由PCR法建立的轉錄模型的轉錄及翻譯整體型稀釋方式麥胚芽無細胞蛋白質合成法)
首先，配制由含有48％容量的麥胚芽提取液(濃度200A260nmunits/ml)按下述最終組成[1000 units/mlRNA核糖核酸酶阻礙物(RNAsin)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、16mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、2.5mMATP、2.5mMGTP、2.5mMUTP、2.5mMCTP、1500單元/ml的SP6RNA聚合酶、16mM肌酸磷酸1.48mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)、25μg/mlDNA]構成的反應溶液。這里所用的DNA是使用上述實施例2中記述的啟動子分斷型引物以及AMPr與Ori間具有互補性的3′端的引物，并按實施例2記述的方法建立的轉錄模型，作為遺傳基因是插入GFP的結構。通過將上述反應溶液在30℃下培養3小時，轉錄mRNA。
該合成溶液中的鎂離子的濃度以及ATP與GTP的濃度顯著高于翻譯最佳濃度的濃度值，因此，雖可進行轉錄反應，但不能進行正常的蛋白質合成反應。為了使蛋白質合成反應開始，通過在mRNA合成后添加上述反應溶液5倍容量的稀釋溶液[30mM HEPES-KOH(pH7.6)95mM醋酸鉀、0.4mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.94mMATP、0.25mMGTP、16mM肌酸磷酸、0.380mM精脒，20種L型氨基酸(各0.3mM)構成，在以氨基酸的攝入量為指標測量蛋白質合成時，對本溶液含有4μCi的14C-亮氨酸]，使鎂離子的濃度直至降低到翻譯反應的最佳濃度(3.19mM)。通過這種方法發現，可以進行與實施例4相同的蛋白質的合成。
轉錄及反應整體型或轉錄及連續翻譯型稀釋方式無細胞蛋白質的合成法不含有繁雜的操作，是極其簡便的，另一方面，通過直接采用由PCR法建立的轉錄模型，可在蛋白質的無細胞系進行高效率地合成。
發明效果由于本發明可建立具有通用性、高翻譯模型活性，且可進行結構簡單的無細胞蛋白質合成用的轉錄模型的設計及其結構，而且還可使用該轉錄模型的極其簡便的無細胞蛋白質合成法。即建立了①保持高翻譯模型活性的mRNA的設計；②具有以PCR技術為基礎進行高翻譯效率的mRNA轉錄用的通用性，而可從遺傳基因的角度建立可控制轉錄本底的轉錄型用引物的設計；③可建立采用已建立的無細胞蛋白質合成用轉錄模型的簡便的無細胞蛋白質合成技術。
若根據本發明，即使在克隆為任意傳病媒介的遺傳基因中準備與具有對該遺傳基因互補的序列的5′端與3′端的兩種固有引物，則通過采用對全部遺傳基因可共同使用的通用性的引物(5′端的3種與3′端的1種)，對于所克隆的任意的遺傳基因均可簡便高效率地合成無細胞蛋白質。這里所說明的發明成果由于具有不需要向現有的連續式無細胞蛋白質合成方法那樣復雜的裝置和繁雜的操作等特點，所以可提供面對隨著基因組項目的結束而所帶來龐大數量的遺傳基因的功能解析與結構解析的遺傳基因產物(蛋白質)的生產所需要的最基本的重要技術。尤其是面對多被測體用全自動無細胞蛋白質合成機械人的研制等對無細胞蛋白質合成系統的自動化是個十分重要的技術。因此，本發明從包含結構生物化學與生理化學的基礎生物學出發，在以至對作為應用的醫藥研制及生產等廣大領域內將做出相當大的貢獻。
序列表樣本序列表的序列編號1供建立PCR用引物所設計的多核苷酸序列表的序列編號2供建立PCR用引物所設計的多核苷酸序列表的序列編號3供建立PCR用引物所設計的多核苷酸序列表的序列編號4供建立PCR用引物所設計的多核苷酸序列表的序列編號5為建立PCR用引物，根據煙草花斑病毒的Ω序列病毒所設計的多核苷酸序列表 圖權利要求
1.一種堿基序列，該堿基序列是通過PCR法制作無細胞蛋白質合成法中使用的3′端非翻譯序列的翻譯模型分子用的轉錄模型所使用的3′端的引物的堿基序列；堿基序列1含有能形成在含有將遺傳基因克隆的傳病媒介的抗藥性遺傳基因等標記遺傳基因的轉錄終止子序列和一部分Ori的序列間，存在的堿基序列和互補鏈的堿基序列；堿基序列2在序列表的序列編號1中記述；堿基序列3含有在序列表的序列編號1中記述的主要部分；上述堿基序列1～3中的任意一種和在核糖核酸控制基因條件下可進行雜交或具有這些互補鏈。
2.一種堿基序列或與此等任意一種互補的堿基序列，該堿基序列是在通過PCR法制作供制造具有無細胞蛋白質合成法中的翻譯模型分子的轉錄模型時使用的5′端的引物的堿基序列；堿基序列4含有具有在RNA聚合酶的啟動子的序列與部分互補的堿基序列；堿基序列5序列表的序列編號2或序列表的序列編號3中記述；堿基序列6含有序列表的序列編號3中記述的堿基序列；堿基序列7含有上述堿基序列5或6中的主要部分；在上述堿基序列4～7中的任意一項的堿基序列與在核糖核酸控制基因條件下可進行雜交。
3.一種轉錄模型的建立方法，該方法是在通過PCR法制作供制造無細胞蛋白質合成法中使用的翻譯模型分子的轉錄模型時使用的5′端的引物的堿基序列。其特征在于在使用由兩種不同的堿基序列構成的兩種多核苷酸(A)、(B)用作5′端的引物、由PCR建立轉錄模型的方法中，該兩種PCR用引物的堿基序列應滿足僅由該引物的任意一種建立的DNA不發生轉錄的條件，該一種引物從5′端在至少含有啟動子功能部位一部分的堿基序列上具有互補的序列，但至少在該啟動子的3′端的RNA聚合酶識別部分，有一部分不含有互補的堿基序列構成的多核苷酸(A)；該其它一種引物的從該啟動子的3′端在至少含有RNA聚合酶識別部位一部分的序列上具有互補的堿基序列，但該啟動子的5′端，由在啟動子的功能部位上至少不具有堿基序列互補的的堿基序列構成的多核苷酸(B)。
4.根據權利要求3記述的轉錄模型建立方法，該方法使用在多核苷酸(B)的堿基序列上，而且相繼插入GA或GAA序列，將mRNA的翻譯放大賦于其下游的堿基序列；而且，由將翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因的ORF(翻譯框)的一部分或在不含有ORF的ORF的上游的堿基序列上，由堿基序列連接互補的的堿基序列構成的多核苷酸。
5.根據權利要求4記述的轉錄模型的建立方法，其特征在于在多核苷酸的翻譯部分的初始密碼與ORF間，編入組氨酸標記和GST(谷胱苷肽S-轉換酶)、myb等標記或抗原表位合成用的堿基序列。
6.一種轉錄與翻譯整體型稀釋方式的無細胞蛋白質合成方法，該方法在用PCR法制作供制造中使用的翻譯模型分子的轉錄模型中，作為該轉錄模型的5′端的引物，使用由序列表的序列編號2中記述的堿基序列構成的多核苷酸；由連接在序列表的序列編號3中記述的堿基序列上的煙草花斑病毒的Ω序列，和作為翻譯初始密碼NTG的堿基序列構成的多核苷酸；以及由連接序列表的序列編號5中記述的堿基序列上作為翻譯初始密碼的ATG，和其后作為轉錄目的的遺傳基因固有的ORF的5′端堿基序列的堿基序列構成的多核苷酸；作為該轉錄模型的3′端的引物，使用由序列表的序列編號1中記述的堿基序列構成的多核苷酸。
7.一種引物組，該引物組是供采用PCR法制作轉錄模型用的引物組，作為5′端的引物，含有多核苷酸(A)由從啟動子的5′端，在至少含有啟動子功能部位一部分的堿基序列上具有互補的序列，在該啟動子的3′端的RNA聚合酶識別部位的一部分的堿基序列至少不具有互補的堿基序列構成；多核苷酸(B)由從該啟動子的3′端，在至少含有RNA聚合酶識別部位一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列，但在至少該啟動子的5′端的啟動子功能部位由不具有互補堿基序列的堿基序列構成；多核苷酸(C)在多核苷酸(B)上，繼可以進行退火的堿基序列，不含有翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因的ORF(翻譯框)的一部分，或不含有ORF的ORF的上游的堿基序列上連接的互補堿基序列；作為3′端的引物，含有在含有將遺傳基因克隆的傳病媒介的抗藥性遺傳基因等標記遺傳基因的轉錄終止子序列和一部分Ori間存在的、可形成堿基序列和互補鏈的堿基序列的多核苷酸。
8.根據權利要求7所述的引物組，即多核苷酸(B)從啟動子的3′端，在至少含有RNA聚合酶識別部位一部分的堿基序列上具有互補的堿基序列，繼該啟動子的5′端的啟動子功能部位，在至少不具有互補的堿基序列的堿基序列后插入GA或GAA序列，在其下游另連接賦予mRNA翻譯放大的序列；而且由在不含有翻譯初始密碼ATG或目的遺傳基因的ORF的ORF上游的堿基序列上，連接互補的序列的堿基序列構成的多核苷酸。
9.一種引物組，由PCR法制作為建立無細胞蛋白質合成方法中使用的翻譯模型分子用的轉錄模型，作為5′端的引物，含有該引物組由序列表的序列編號2中記述的堿基序列構成的多核苷酸；由連接在序列表的序列編號3中記述的堿基序列上，作為由煙草花斑病毒的Ω序列和作為翻譯初始密碼ATG的堿基序列構成的多核苷酸；以及繼序列表的序列編號5中記述的堿基序列中，作為翻譯初始密碼的ATG及其后連接作為轉錄目的的傳基因固有的ORF的5′端堿基序列構成的多核苷酸；作為3′端的引物，含有由序列表的序列編號1記述的堿基序列構成的多核苷酸。
10.權利要求3至權利要求6中任意一項記述的建立方法制作的轉錄模型，該模型是無細胞蛋白質合成法中使用的高效率mRNA合成用的轉錄模型。
11.使用權利要求7至權利要求9任意一項中記述的引物組，由PCR合成的轉錄模型是無細胞蛋白質合成法中使用的高效率mRNA合成用的轉錄模型。
12.由權利要求3至權利要求6中任意一項記述的建立方法制作的轉錄模型的權利要求10至權利要求11中記述的轉錄模型，將所轉錄的mRNA用作翻譯模型的無細胞蛋白質合成法。
13.根據權利要求項12中記述的無細胞蛋白質合成方法，是在合成mRNA后由凝膠過濾進行精制。
14.一種轉錄及連續翻譯型稀釋方式的無細胞蛋白質的合成法，其特征在于該方法是采用權利要求3至權利要求6中的任意一項記述的建立方法制作轉錄模型，并通過轉錄溶液進行轉錄反應后，添加無細胞蛋白質合成用反應溶液，在添加后的反應溶液中，至少將鎂的濃度降低到翻譯的最佳濃度；同時降低該反應溶液中的轉錄基質及轉錄副產物的濃度以延長翻譯反應的持續時間。
15.一種轉錄及翻譯整體型稀釋方式的無細胞蛋白質合成法，其特征在于該方法采用權利要求3至權利要求6中任意一項記述的建立方法制作轉錄模型，在通過無細胞蛋白質合成用反應溶液進行轉錄反應后，添加稀釋溶液加以稀釋，在該反應溶液中，至少將鎂的濃度降低到翻譯最佳濃度；同時降低該反應溶液中的轉錄基質及轉錄生成物的濃度，延長反應的持續時間。
16.一種轉錄及連續翻譯整體型稀釋方式的無細胞蛋白質合成法，其特征在于在反應容器中添加cDNA，通過實施權利要求3至權利要求6中的任意一項記述的轉錄模型的建立方法，在該反應容器中制作轉錄模型，由含有RNA聚合酶和4種多核苷酸三磷酸的轉錄用溶液進行轉錄反應后，進一步添加無細胞蛋白質合成溶液，將反應溶液中的鎂濃度至少降低到翻譯最佳濃度，進行翻譯反應。
17.一種轉錄及翻譯整體型稀釋方式的無細胞蛋白質合成法，其特征在于在反應容器中添加cDNA，通過實施權利要求3至權利要求6中的任意一項記述的轉錄模型的建立方法，在該反應容器中制作轉錄模型，添加含有RNA聚合酶和4種多核苷酸三磷酸的無細胞蛋白質合成反應用溶液進行轉錄反應后，添加稀釋溶液進行稀釋，將該合成溶液中的鎂濃度至少降低到翻譯最佳濃度，進行翻譯反應。
18.權利要求14至權利要求17中任意一項記述的無細胞蛋白質的合成方法，該方法將鎂濃度降低到翻譯最佳濃度，將鎂濃度由約1mM降低到約6mM。
19.權利要求14至權利要求18中任意一項記述的無細胞蛋白質的合成方法，該方法在30℃～45℃中實施轉錄反應，且翻譯反應在20℃～30℃下實施。
20.權利要求12至權利要求19中任意一項記述的無細胞蛋白質的合成方法，該方法采用麥胚芽提取物。
全文摘要
本發明的目的旨在提供一種多核苷酸，并提供一種該多核苷酸的轉錄模型的建立方法等。為設計、建立有通用性、模型活性高、且結構簡單的無細胞蛋白質合成用的轉錄模型用的3’側PCR引物，在傳病媒介抗藥性遺傳基因等標記遺傳基因的轉錄終止子序列和Ori間形成堿基序列和互補鏈的各個傳病媒介固有的堿基序列構成的多核苷酸；5’側PCR引物，是兩種滿足僅使用一種引物不產生從所建立的DNA進行轉錄條件的引物，在從啟動子至少含有啟動子功能一部位的堿基序列上具有互補序列的多核苷酸；和從啟動子的3’端至少含有RNA聚合酶識別部位的堿基序列上具有互補序列的多核苷酸。
文檔編號C12P21/02GK1449444SQ01814809
公開日2003年10月15日 申請日期2001年8月28日 優先權日2000年8月30日
發明者遠藤彌重太, 澤崎達也, 小笠原富夫 申請人:遠藤彌重太