專利名稱：制備作為動物飼料添加劑的d-泛酸和/或其鹽的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備D-泛酸和/或其鹽的改進方法以及所述物質作為動物飼料添加劑的用途。
作為生物合成輔酶A的原料，D-泛酸鹽廣泛分布于植物界和動物界中。與通過膳食消耗足量泛酸的人類不同，D-泛酸鹽缺乏癥狀常常不僅見于植物，而且也見于動物。因此，D-泛酸鹽的可利用性具有重大經濟價值，特別是在動物飼料工業中。
傳統上，D-泛酸鹽通過化學合成由D-泛內酯和β-丙氨酸鈣來制備(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(Ullmann工業化學大全)，第六版，1999，電子版，“維生素”一章)。D-泛內酯的制備需要經由非對映鹽的復雜且經典的外消旋體拆分。由該化學合成得到的工業產物通常是D-泛酸的鈣鹽，即D-泛酸鈣。
與化學合成相比，使用微生物的生物技術生產方法的優點在于選擇性(對映體純)生產可用于高級生物的D型泛酸。因此，如化學合成中所需的復雜的外消旋體拆分就不必要了。
已知有大量使用微生物來制備D-泛酸的發酵方法，包括EP-0 590857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193中所述的方法。
因此，EP 1 006 189和EP 1 001 027描述了制備泛酸鹽的方法，其中在發酵溶液中得到的最大D-泛酸含量為1g/l。然而，對于經濟地制備含有D-泛酸的動物飼料添加劑，發酵溶液中這樣低的泛酸含量(即以固含量計不到10重量％)是不適用的。迄今所述方法的另一缺點在于產物從發酵培養基中的分離需要許多復雜的后處理步驟。尚不知在工業規模上經濟的制備方法。
德國公開申請DE 100 16 321描述了一種制備含有D-泛酸的動物飼料添加劑的發酵方法。然而，與上述制備D-泛酸的發酵方法一樣，該方法的一個重大缺點在于必須將該泛酸的前體-β-丙氨酸經由發酵培養基供入微生物中以得到所需產物的經濟產率。
另外，US 6,013,492和WO 96/332839描述了通過從培養基中濾除不溶性成分(例如細胞物質)，將濾液吸附到活性炭上，隨后用有機溶劑、優選甲醇洗脫D-泛酸，用氫氧化鈣中和以及隨后將D-泛酸鈣結晶而從發酵溶液中對D-泛酸進行后處理。其重大缺點在于結晶過程中損失有價值的產物以及使用從產物中難以除去且需要復雜的溶劑回收步驟的有機溶劑。
EP 0 590 857描述了一種制備D-泛酸的發酵方法，其中培養微生物需要供入β-丙氨酸。將該發酵溶液過濾以分離除去生物質，然后使其通過陽離子交換劑并然后通過陰離子交換劑，之后用氫氧化鈣中和，蒸發濃縮，加入活性炭，再次過濾以及加入甲醇和氯化鈣以結晶。所得含有泛酸鈣的產物除了含有鈣鹽形式的D-泛酸外，還含有摩爾比為1∶1的氯化鈣。降低氯化鈣含量需要電滲析和隨后的噴霧干燥。該方法的缺點在于由于大量復雜的工藝步驟和有機溶劑的使用使得既不經濟又不生態。
本發明的目的是提供一種含有D-泛酸和/或其鹽的動物飼料添加劑以及通過沒有上述缺點的制備D-泛酸和/或其鹽的改進方法來制備它的方法。出于經濟上的原因，此處理想的方法是，其中β-丙氨酸的供入大大降低或根本不需要。另外，制備其二價鹽形式且尤其是堿土金屬鹽形式的D-泛酸是所需的，因為該泛酸的二價鹽與其一價鹽相比具有更低的吸濕性，因而對于進一步應用例如用作動物飼料添加劑具有不太顯著的團聚趨勢。
我們發現該目的通過本發明有利地實現。
本發明涉及一種制備D-泛酸和/或其鹽的方法，其包括如下步驟a)使用至少一種生物，該生物產生D-泛酸，在該生物中去調節泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養基中發酵生成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養基中供入有0-20g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)通過施加電場使該含有D-泛酸鹽的發酵溶液通過一個或多個離子選擇膜，其中低分子量離子從該含有D-泛酸鹽的溶液中除去，
c)加入鈣堿和/或鎂堿以將該含有游離D-泛酸的溶液的pH設定為5-10，得到含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液，以及d)將該含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液進行干燥和/或配制。
在本發明方法的變體中，在步驟c)或d)中，得到或加入含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的懸浮液。
本發明步驟a)中的發酵可使用本身已知的程序以分批、補料分批或反復的補料分批方式或連續方式進一步進行。在這種情況下使用常規緩沖體系如含有NaOH、KOH或氨的磷酸鹽緩沖液將所得泛酸中和。
在本發明方法的其它變體中，在步驟a)中，通過發酵在培養基中生成至少10g/l、優選至少20g/l、特別優選至少40g/l、非常特別優選至少60g/l、尤其至少70g/l D-泛酸鹽。
對本發明而言，詞語“產生”指所述生物可合成比其自身代謝需要所需量要大的D-泛酸和/或其鹽。在本發明的有利變體中，所合成的D-泛酸和/或其鹽的量不存在于細胞內部，但理想的是通過生物全部釋放到培養基中。該釋放通過本身公知的機理可以是主動的或被動的。
根據本發明，所用產生D-泛酸的生物是微生物。這些微生物根據本發明包括真菌、酵母和/或細菌。根據本發明，優選使用真菌如毛霉菌屬或酵母如酵母屬(Saccharomyces)或德巴利酵母屬(Debaromyces)，在這當中優選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根據本發明，有利地使用棒狀桿菌(coryneform bacteria)或芽孢桿菌科(Bacillaceae)。在本發明范圍內優選的例如是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、短桿菌屬(Bevibacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)或根瘤菌屬(Rhizobium)的細菌。此處特別優選的例如是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、短桿菌(Brevibacteriumbreve)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、緩病芽孢桿菌(B.lentimorbus)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、堅強芽孢桿菌(B.firmus)、泛酸芽孢桿菌(B.pantothenticus)、環狀芽孢桿菌(B.circulans)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)和一組以其16sRNA表征的其它芽孢桿菌種，或Actinum mycetalis。該列舉目的在于解釋，決不是對本發明的限制。
此外，本發明還包括使用基因修飾生物以用于本發明制備含有游離D-泛酸和/或其鹽的動物飼料添加劑。這類基因修飾生物例如可通過化學誘變和隨后使用合適的“篩選法”篩選來分離。根據本發明，稱作“生產菌株”的也包括在內，它們適于制備本發明產物且在D-泛酸方向的代謝通量方面具有基因修飾，其中在D-泛酸和/或其鹽經由細胞膜排出方面的修飾也包括在內。這例如可通過對所用生物的相關代謝生物合成途徑中的關鍵位置的修飾來實現。
也可使用由必需的或可能需要的同源和/或異源核苷酸序列轉移得到的轉基因生物來合成所需產物。在這種情況下，單獨和/或組合位于基因組中的和/或位于載體上的一個或多個基因可以超表達和/或去調節。
這類轉基因生物可有利地含有額外的拷貝和/或基因修飾的基因，所述基因選自panB、panC、panD、panE和/或其組合和/或甚至是象panBCD操縱子那樣的組織單元。另外，如EP 1 006 189、EP 1 006192、EP 1 006 193或EP 1 001 027所述，可有利地在生物中操作其它代謝途徑，例如異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑。結果，泛酸生物合成的支化鏈前體物質越發可利用。合適的話，將用于該生物合成途徑的基因，即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD有利地超表達。
另外，本發明還包括在所用的產生D-泛酸的生物中對天冬氨酸α-脫羧酶(panD)例如通過超表達和/或去調節進行基因修飾。
對本發明而言，詞語“去調節”指在生物合成代謝途徑中改變或修飾至少一個編碼一種酶的基因，使得改變或修飾該酶在該微生物中的活性。優選改變至少一個編碼一種生物合成代謝途徑的酶的基因，使得該基因產物以更大程度形成，或者具有增加的活性。術語“去調節的代謝途徑”也包括其中改變或修飾一個以上編碼一種以上酶的基因以改變或修飾該一種以上酶的活性的生物合成代謝途徑。
改變或修飾可包括但不限于除去內源啟動子或調節成分；同時引入強啟動子、誘導型啟動子或多個啟動子；除去調節序列以改變該基因產物的表達；改變該基因的染色體位置；改變在該基因附近或該基因內的DNA序列，例如核糖體結合位點(RBS)；增加該基因組中該基因的拷貝數或引入數目不等的質粒拷貝；修飾蛋白(例如調節蛋白、抑制因子、增強子、轉錄激活因子等)，它們在基因轉錄和/或在翻譯得到基因產物中起著作用。這也包括所有屬于現有技術的其它去調節基因的表達的可能方式，例如使用反義寡核苷酸或阻斷阻抑蛋白。
去調節也可包括對例如導致除去基因產物中的反饋調節或導致基因產物的更大或更小比活性的基因的編碼區的改變。
此外，對酶的基因修飾根據本發明是有利的，這些修飾影響泛酸前體的流出和/或泛酸流出產生輔酶A。編碼這些酶的基因的實例是alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX等。該列舉目的在于解釋，決不是對本發明的限制。
另外，基因修飾是有利的，這些修飾保證輔因子(例如亞甲四氫葉酸、氧化還原等同物等)以對于泛酸產生而言最優的量的細胞生產。
因此，β-丙氨酸有利地已經以與相應的非基因修飾生物相比增加的濃度存在于細胞中，因此不必將其作為前體加入培養基中，例如EP-A 0 590857中所要求的。其中去調節泛酸(pan)和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或天冬氨酸α-脫羧酶(panD)的生物合成的微生物是有利的。而且，微生物中酮泛解酸還原酶(panE)的額外超表達是有利的。
根據本發明，合適的話，若合成輔酶A所需的coaA基因的活性降低或者該基因被徹底切斷(例如在芽孢桿菌屬種中)，則將額外有利。這是因為芽孢桿菌屬除含有coaA外還含有其它提供這種酶催功能的基因(＝coaX)。該coaX基因或相應酶的活性也可改變，優選降低，或者甚至消除，條件是coaA本身仍舊具有足夠的酶活性，即使是降低的酶活性，也就是說coaA的酶活性沒有徹底喪失。除各種基因的超表達之外，這些基因的啟動區的基因操作也是有利的，條件是該操作導致該基因產物的超表達。
在本發明實施方案中，使用根據附件(PCT/US 0025993)描述的細菌菌株，例如枯草芽孢桿菌PA 824和/或其衍生物。在另一實施方案中，根據本發明在本發明方法中使用如附件(US 60/262,995)中所述的枯草芽孢桿菌PA 668微生物。這些枯草芽孢桿菌PA 824和PA 668菌株按如下方式生產從具有基因型trpC2(Trp-)的枯草芽孢桿菌168菌株(Marburg菌株ATCC 6051)開始，通過Trp+標記(來自枯草芽孢桿菌野生型W23)轉導生產PY79菌株。經典的基因工程方法(例如Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)在Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢桿菌屬的分子生物學方法)(1990)(John Wiley & Sons，Ltd.，Chichester，英國)中所述)將ΔpanB和ΔpanE1突變引入PY79菌株中。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的基因組DNA和枯草芽孢桿菌菌株PA303(基因型P26panE1)的基因組DNA將所得菌株轉化。所得菌株PA327具有基因型P26panBCD、P26panE1，且為色氨酸營養缺陷體(Trp-)。使用枯草芽孢桿菌菌株PA327，在10ml含有SVY培養基(將25g/l Difco Veal肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸鈉、2.7g/l硫酸銨加入740ml水中，將該混合物高壓滅菌，然后加入200ml 1M磷酸鉀(pH7.0)和60ml 50％無菌的葡萄糖溶液)的培養物中，得到不超過3.0g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養基補加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸。
枯草芽孢桿菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的生產描述在下列部分借助E.Coli的panBCD操縱子的序列信息(見Merkel等人，FEMSMicrobiol.Lett.，143，1996247-252)，從枯草芽孢桿菌GP275質粒文庫開始，使用經典的基因工程方法來克隆芽孢桿菌屬的panBCD操縱子。為了進行克隆，使用E.coli菌株BM4062(birts)和該芽孢桿菌屬操縱子靠近birA基因的信息。將該panBCD操縱子引入可在E.coli中復制的質粒中。為了改善該panBCD操縱子的表達，使用枯草芽孢桿菌噬菌體SP01(P26)的強組成型啟動子，并將panB基因前面的核糖體結合位點(＝RBS)用人工RBS替換。在芽孢桿菌屬中緊鄰天然panB基因上游的DNA片段連接在質粒上的P26panBCD盒前面。將該質粒轉化成枯草芽孢桿菌菌株RL-1(通過經典的誘變得到的枯草芽孢桿菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC 6051)，基因型trpC2(Trp-))，并且通過同源重組，用P26panBCD操縱子代替天然panBCD操縱子。所得菌株稱作PA221，并且具有基因型P26panBCD，trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA221，在10ml含有SVY培養基的培養物中，得到不超過0.92g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養基中補加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸。
枯草芽孢桿菌菌株PA303(基因型P26panE1)的生產描述在下列部分利用E.Coli panE基因序列，通過類似方法克隆芽孢桿菌屬panE序列。發現在枯草芽孢桿菌中存在兩種同源E.Coli panE基因，稱作panE1和panE2。缺失分析發現panE1基因負責90％的泛酸產生，而缺失panE2基因對泛酸產生并無重大影響。此處與克隆panBCD操縱子相似，用強組成型啟動子P26代替該啟動子，并用人工結合位點代替panE1基因前面的核糖體結合位點。將P26panE1片段克隆到載體中，該載體的構建使得該P26panE1片段能整合至枯草芽孢桿菌基因組中的原始panE1基因座。轉化和同源重組之后所得的菌株稱作PA303，并且具有基因型P26panE1。使用枯草芽孢桿菌菌株PA303，在10ml含有SVY培養基的培養物中，得到不超過1.66g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養基中補加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸。
通過用含有P26ilvBNC操縱子和壯觀霉素的標記基因的質粒將PA327轉化而進一步構建所述菌株。該P26ilvBNC操縱子整合入amyE基因座中，這通過PCR來顯示。將一種轉化體稱作PA340(基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、specR、trpC2(Trp-))。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA340，在10ml含有僅補加有5g/lβ-丙氨酸的SVY培養基的培養物中，得到不超過3.6g/l(24h)的泛酸滴定度；在10ml含有補加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸的SVY培養基的培養物中，得到不超過4.1g/l(24h)的泛酸滴定度。
另外，將去調節的ilvD盒引入菌株PA340中。為此，將含有ilvD基因的質粒在控制含有人工RBS2的P26啟動子的情況下轉化入PA340。通過同源重組將P26ilvD基因整合入原始ilvD基因座中。所得菌株PA374具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA374，在10ml含有SVY培養基的培養物中，得到不超過2.99g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養基中僅補加有5g/lβ-丙氨酸。
為了在不供入β-丙氨酸的情況下使用菌株PA374來產生泛酸，將編碼天冬氨酸α-脫羧酶的基因panD的附加拷貝引入菌株PA374中。為此，將菌株PA401的染色體DNA轉化入PA374。通過在四環素上的選擇得到菌株PA377。
所得菌株PA377具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和trpC2(Trp-)。
在不供入前體的情況下，使用枯草芽孢桿菌菌株PA377，在10ml含有SVY培養基的培養物中，得到不超過1.31g/l(24h)的泛酸滴定度。
枯草芽孢桿菌菌株PA401(基因型P26panD)的制備描述在下列部分由panBCD操縱子將枯草芽孢桿菌panD基因克隆入帶有四環素標記基因的載體。將啟動子P26和上述人工RBS克隆在panD基因前面。限制酶切消化產生含有四環素標記基因和panD基因的片段。將該片段重新連接，并轉化到上述菌株PA221。將該片段整合入菌株PA211的基因組中。所得菌株PA401具有基因型P26panBCD、P26panD、tetR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA401，在10ml含有已補加有5g/lα-酮異戊酸的SVY培養基的培養物中，得到不超過0.3g/l(24h)的泛酸滴定度。在10ml含有已補加有5g/1 D-泛解酸和10g/l L-天冬氨酸的SVY培養基的培養物中，得到不超過2.2g/l(24h)的泛酸滴定度。
從菌株PA377開始，用菌株PY79的染色體DNA的轉化來產生色氨酸-原養菌株。該菌株PA824具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和Trp+。
在不供入前體的情況下，使用枯草芽孢桿菌菌株PA824，在10ml含有SVY培養基的培養物中，得到不超過4.9g/l(48h)的泛酸滴定度(對照PA377不超過3.6g/l(48h))。
PA668的制備描述在下列部分由野生型panBCD操縱子將芽孢桿菌屬panB基因克隆并插入除含有氯霉素抗性基因外還含有vpr基因座的枯草芽孢桿菌序列的載體中。
在panD基因5’端之前引入強組成型啟動子P26。通過限制酶切消化得到一個含有P26panB基因、氯霉素抗性的標記基因以及枯草芽孢桿菌vpr序列的片段。將分離出來的片段重新連接并用于轉化菌株PA824。所得菌株稱作PA668。PA668的基因型為P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmR和Trp+。
分離PA668的兩種菌落并分別稱作PA668-2A和PA668-24。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA668-2A，在10ml含有沒有供入前體的SVY培養基的培養物中，在48h內得到1.5g/l的泛酸滴定度。在10ml含有補加有10g/l天冬氨酸的SVY培養基的培養物中，得到不超過5g/l的滴定度。
使用枯草芽孢桿菌菌株PA668-24，在10ml含有沒有供入前體的SVY培養基的培養物中，在48h內得到1.8g/l的泛酸滴定度。在10ml含有補加有10g/l L-天冬氨酸的SVY培養基的培養物中，得到不超過4.9g/l的滴定度。
所述菌株的確切構建參見PCT/US 0025993和US 60/262,995的附件。
使用上述菌株PA377，在SVY培養基(25g/l Difco Veal肉浸汁，5g/lDifco酵母提取物，5g/l色氨酸，5g/l谷氨酸鈉，2g/l(NH4)2SO4，10g/lKH2PO4，20g/l K2HPO4，0.1g/l CaCl2，1g/l MgSO4，1g/l檸檬酸鈉，0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l組成如下的痕量鹽溶液0.15gNa2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O與水共同構成1升)中以10升規模在連續供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制發酵中，在36h(48h)內在發酵液中得到的泛酸濃度為18-19(22-25g/l)。
在PA824(PA377的色氨酸-原養衍生物)的葡萄糖限制發酵的情況下，在酵母提取物培養基(10g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸鈉、8g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l檸檬酸鈉、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量鹽溶液)中以10升規模在連續供入葡萄糖溶液下，在36h、48h和72h內在發酵液中得到的泛酸濃度分別為20g/l、28g/l和36g/l。
通過培養基的進一步優化，使用菌株PA824，在由10g/l Difco酵母提取物、10g/l NZ胺A(Quest International GmbH，Erftstadt)、10g/l谷氨酸鈉、4g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l檸檬酸鈉、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量鹽溶液組成的培養基中以10升規模在連續供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制發酵中，在36h(48h)內在發酵液中得到的泛酸濃度為37g/l(48g/l)。
通過培養基的進一步優化、通過增加發酵時間、通過工藝和菌株改進以及通過各步驟的組合可以進一步提高發酵液中泛酸的濃度。因此，通過將為上述PA824的衍生物的菌株發酵也可得到上述泛酸濃度。衍生物可通過經典的菌株發育和通過其它基因工程操作來制備。通過培養基、菌株和發酵方法的發展，可將發酵液中泛酸滴定度增加到大于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l。
本發明方法的本質優點在于發酵在培養基中進行，該培養基除含有至少一種碳源和氮源之外就不再含有其它作為起始化合物的前體。也就是說，D-泛酸的生物合成與其它前體的供入沒有關系。對本發明而言，這些前體是諸如β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-纈氨酸和/或α-酮異戊酸和/或其混合物的物質。
在本發明方法的優選變體中，產生D-泛酸的生物的發酵在培養基中進行，該培養基含有碳源和氮源，但在發酵過程中不向其中加入或供入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。也就是說，為了產生至少10g/l培養基、優選至少20g/l、特別優選至少40g/l、非常特別優選至少60g/l、尤其至少70g/l的D-泛酸，根據本發明不需要供入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。
與前體的供入無關這一點尤其是本發明方法與已知方法相比的重大經濟優點，因為許多前體是非常昂貴的。
然而，本發明不排除加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，因此使得通過加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽可進一步提高D-泛酸的產率。若例如假定泛酸所有的所需前體都以足量存在，則只有panD基因的活性限制泛酸產生的進一步增加，因此例如可通過加入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽將泛酸的產率再提高50％。
在本發明的有利變體中，可向培養基中加入不超過20g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，以將泛酸的產率額外提高50％以上。優選向培養基中加入約15g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。
根據本發明，適合用于培養基中以將上述生物發酵的碳源的實例是糖類如淀粉水解產物(單-、二-、低聚糖)，優選葡萄糖或蔗糖，以及甜菜或甘蔗糖蜜，蛋白質，蛋白質水解產物，大豆粉，玉米漿，脂肪，游離脂肪酸，從前面的發酵再循環的細胞或其水解產物，以及酵母提取物。該列舉不是對本發明的限制。
另外，本發明方法有利的特征在于到發酵結束時總的糖含量降至最低，因為否則的話這將由于粘連使隨后發酵溶液的干燥和/或配制變得困難。根據本發明，這可通過在碳源被消耗后(在分批培養的情況下)或在碳進料(在以補料分批或反復的補料分批方式的工藝工序的情況下)被中斷和/或被調節以使該碳源的濃度基本為零(在補料分批、反復的補料分批或連續工藝工序的情況下)之后繼續發酵一段時間而實現。
根據本發明，這通過在中斷加入碳源(例如糖溶液)之后，繼續發酵直到在該發酵溶液中溶解氧濃度(pO2)為其飽和值的至少80％，優選90％，特別優選95％而達到。
根據本發明，合適的氮源的實例是氨、硫酸銨、尿素、蛋白質、蛋白質水解產物或酵母提取物。該列舉不是對本發明的限制。
另外，發酵培養基含有無機鹽和/或微量元素，例如氨基酸和維生素。合適的發酵培養基的確切組成大量公知，并且對本領域熟練技術人員而言是可得的。
在用適合的產生D-泛酸的生物對發酵培養基進行接種(以本領域熟練技術人員公知的細胞密度)之后，合適的話加入消泡劑，培育該生物。培養基pH的任何必要調節都可使用各種無機或有機堿或酸如NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、鹽酸、甲酸、琥珀酸、檸檬酸或類似物質來實現。
考慮到發酵過程中所用的緩沖體系(該緩沖體系如上所述例如可以是NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、鹽酸、甲酸、琥珀酸、檸檬酸或類似物質)，所生成的D-泛酸取決于所用的緩沖體系而以各自的鹽的形式存在于發酵溶液中。由于根據本發明這種情況下，尤其是D-泛酸的一價陽離子形式的鹽是不利的，或者呈鈣鹽或鎂鹽形式的D-泛酸是優選的，因此根據本發明使用電隔膜分離法來制備發酵溶液。
本發明此處包括所有可得類型的電隔膜分離法，如膜電解或電滲析。憑借本領域熟練技術人員的部分知識就可作出合適的選擇。
根據本發明，優選使用電滲析。此處，不僅可使用只使用單極膜的電滲析，而且也可使用使用單極和/或偶極膜的電滲析。特別優選只使用單極膜的電滲析，尤其是具有對一價離子具有選擇性的稱作單選擇膜的單極膜的電滲析。
原則上，可將任何常用于電滲析方法中的膜用于進行本發明方法。本發明電滲析上下文中使用的膜優選是市購的常規離子交換膜。
可使用的陰離子交換膜例如是Tokuyama Corp.的Neosepta AM1、AM2、AM3、AMX、AMH、AFN和Asahi Glass的AMV。
陽離子交換膜的實例是Neosepta CM1、CM2、CMX、CMH、CMB、Asahi Glass CMV以及Du Pont de Nemours的Nafion 435或350。
可提及的單選擇陽離子交換膜例如是Neosepta CMS膜。
可使用的單選擇陰離子交換膜例如是Tokuyama Corp.的NeoseptaACS膜或Asahi Glass的Selmion ASV膜。
所用電極可以是不銹鋼的、鎳的、貴金屬的，例如鉑或其它本領域熟練技術人員公知的適合的材料。
根據本發明，使用單極電滲析，可不僅將陰離子，而且還將陽離子通過在電場中遷移通過陰離子或陽離子交換膜而從含有泛酸鹽的溶液中轉移到第二溶液(濃溶液，CONC)中，于是從含有泛酸的溶液(稀溶液，DIL)中除去。根據本發明，有利的是，低分子量離子從含有泛酸的溶液中除去。對本發明而言，低分子量離子是通過培養基和/或緩沖體系的組合物引入發酵液中的但終產物中不需要的離子。例如這些離子是下列離子銨離子、鉀離子、鈉離子、鐵離子、氯離子、磷酸根離子或硫酸根離子。
在本發明的另一方案中，可進行一價陽離子如Na+或銨離子的離子交換，而保留多價陽離子如Ca2+。為此，使用對一價離子具有選擇性的陽離子交換膜。因此，例如將CaCl2溶液加入回路I中，在通過陽離子交換膜與回路I分開的第二回路II中加入含有一價陽離子的泛酸溶液。然后，通過對一價離子具有選擇性的且位于室II和室III之間的陽離子交換膜，優選將一價陽離子轉移到第三室III中。同時，陰離子如氯離子從室I通過位于室I和室III之間的陰離子交換膜轉移到室III中。鈣離子從室I通過陽離子交換膜轉移到室II中。這樣直接得到D-泛酸鈣。當存在弱酸如泛酸的鹽時，若代替CaCl2，將HCl水溶液加入室I中，則也可以以這種排列得到游離D-泛酸。
本發明還包括使用無機或有機陰離子形式的鈣鹽和/或鎂鹽。根據本發明，有利的是使用氯化鈣和/或鎂、硝酸鈣和/或鎂、氫氧化鈣和/或鎂、甲酸鈣和/或鎂、乙酸鈣和/或鎂、丙酸鈣和/或鎂、氨基乙酸鈣和/或鎂或乳酸鈣和/或鎂。
在本發明的替代實施方案中，當使用偶極電滲析時，陽離子可有利地從含有泛酸鹽的溶液中通過陽離子交換膜轉移到第二溶液中，于是從該含有泛酸的溶液中除去，而通過解離偶極膜中的水同時提供質子。在第二溶液中，使用由解離偶極膜中的水提供的氫氧根離子形成已轉移的陽離子的相應的堿。
在本發明的另一實施方案中，當使用偶極電滲析時，陰離子可有利地從含有泛酸鹽的溶液中通過陰離子交換膜轉移到第二溶液中，于是從該含有泛酸的溶液中除去，而通過解離偶極膜中的水同時提供氫氧根離子。在第二溶液中，使用由解離偶極膜中的水提供的質子形成已轉移的陰離子的相應的酸。
本發明還包括另一替代實施方案，其中通過使用偶極電滲析，首先，陰離子有利地從含有泛酸鹽的溶液中通過陰離子交換膜轉移到第二溶液中，于是從該含有泛酸的溶液中除去，而通過解離偶極膜中的水同時提供氫氧根離子；其次，陽離子從含有泛酸鹽的溶液中通過陽離子交換膜轉移到第三溶液中，于是從該含有泛酸的溶液中除去，而通過解離偶極膜中的水同時提供質子。在第二溶液中，使用由解離偶極膜中的水提供的質子再形成已轉移的陰離子的相應的酸；在第三溶液中，使用由解離偶極膜中的水提供的氫氧根離子形成已轉移的陽離子的相應的堿。
根據本發明，優選在本發明方法中，使用酸或堿將含有泛酸鹽的溶液的pH設定為泛酸的等電點。由此可進一步增加游離D-泛酸的產率，或進一步將損失降至最低。
單極電滲析是特別優選的變體，因為與偶極單滲析相比它高度成本有效。
也可使用偶極電滲析，尤其當不加入酸或堿來調節pH時，或者當已經存在的酸或堿金屬氫氧化物溶液可進一步使用時。
根據本發明，所有電滲析變體都具有離子交換樹脂再生過程中不產生廢水的優點。
本發明電分離法的使用優選從含有D-泛酸鹽的溶液中除去不需要的低分子量離子(外來離子)，如銨離子、鉀離子、鈉離子、鐵離子、氯離子、磷酸根離子或硫酸根離子。也就是說，優選形成游離D-泛酸或其所需的鹽，如D-泛酸鈣和/或D-泛酸鎂。
根據本發明，一價陽離子，優選銨離子、鉀離子和/或鈉離子的含量降至≤1g/kg溶液的濃度。
不需要的陰離子，例如氯離子、硫酸根離子或磷酸根離子的含量也可通過選擇離子交換膜、優選通過使用陰離子交換膜而顯著降低。
根據本發明，通過加入鈣堿和/或鎂堿將所得含有游離D-泛酸的溶液的pH設定為3-10。pH為5-10是有利的。優選將該pH設定為5-9，特別優選6-9，非常特別優選6-8。這樣得到含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液。為了中和，優選將氫氧化鈣、碳酸鈣、氧化鈣、氫氧化鎂和/或堿式碳酸鎂以固體和/或水懸浮液形式加入該溶液中。
根據本發明，在這種情況下優選用鈣堿和/或鎂堿的水懸浮液中和該含有游離D-泛酸的溶液。與使用相應固體的情形相比，作為使用水懸液的結果，該中和進行得更迅速，并且沒有較大的pH波動。
根據本發明，本發明方法的特征在于將包含2-55重量％、優選10-50重量％、特別優選20-40重量％的氫氧化鈣的水懸浮液加入步驟c)的溶液中。本發明另外還包括一種其中將包含2-65重量％、優選10-50重量％、特別優選20-40重量％的碳酸鈣的水懸浮液加入步驟c)的溶液中的方法。在本發明的另一實施方案中，將包含2-60重量％、優選10-50重量％、特別優選20-40重量％的氫氧化鎂的水懸浮液加入本發明方法步驟c)的溶液中。本發明還包括一種其中將包含2-25重量％、優選10-20重量％的堿式碳酸鎂的水懸浮液加入步驟c)的溶液中的方法。
使用本身已知的方法，例如噴霧干燥、噴霧粒化、流化床干燥、流化床粒化、轉鼓式干燥或旋轉急驟干燥(Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第六版，1999，電子版，“固體材料的干燥”一章)將發酵溶液干燥和/或配制。對流干燥中氣體入口溫度為100-280℃，優選120-210℃。氣體出口溫度為50-180℃，優選60-150℃。為了建立所需粒度分布和有關的產物性能，可分離出細顆粒并再循環。另外，可將粗材料在磨中研磨，并且然后同樣再循環。
根據本發明，在上述方法中，在產生具有高生物價值的所需產物的同時，減少復雜的后處理步驟是有利的，尤其是避免使用有機溶劑。另外，根據本發明，所產生的廢水量顯著減少。因此這導致進一步節省復雜的后處理和處理車間。因此，本發明方法的優點在于與傳統方法相比它更簡單、不易出錯、耗時更少、顯著便宜并因而更經濟。
然而，這并不排除本發明方法可以變化。本文開頭提及的本發明的工藝步驟a)-d)可通過一個或多個本領域熟練技術人員熟悉的下列工藝步驟來補充。在這種情況下，本發明涵蓋額外(操作)工藝步驟與(必需)工藝步驟a)-d)的所有可能組合。
因此，例如可通過加熱(滅菌)或其它方法如巴氏消毒法或無菌過濾將來自工藝步驟a)-c)的溶液消毒。
在本發明方法的其它變體中，在干燥和/或配制所述溶液之前，可進行至少一個下列步驟和/或這些步驟的組合生物質的溶菌和/或滅菌和/或從發酵溶液中分離除去該生物質和/或加入其它添加劑和/或優選通過除去水將該發酵溶液濃縮。
因此，本發明還涉及一種其中在發酵溶液中仍舊進行生物質的溶菌和/或滅菌或直到從該發酵溶液中分離除去該生物質之后才進行前述步驟的方法。這例如可通過優選80-200℃下的溫度處理和/或優選用硫酸或鹽酸的酸處理和/或優選用溶菌酶的酶催方式來進行。
在本發明的另一實施方案中，可通過過濾、分離(例如離心分離)和/或傾析從本發明方法步驟a)、b)或c)的溶液中除去發酵微生物的細胞。也可通過施加電場使步驟a)、b)或c)的溶液不經分離除去所存在的生物而直接通過一個或多個離子選擇膜。
經由膜電解或電滲析后處理得到的溶液可在中和之后通過合適的蒸發器如降膜式蒸發器、薄膜式蒸發器或旋轉式蒸發器濃縮。這些蒸發器例如由GIG(4800 Attnang Puchheim，奧地利)、GEA Canzier(52303 Diiren，德國)、Diessel(31103 Hildesheim，德國)和Pitton(35274 Kirchhain，德國制造。
為了改善終產物的顏色性能，可進行其中將少量活性炭加入該工藝過程中所得的溶液中的額外過濾步驟，并然后將該懸浮液過濾。或者，可使發酵過程中所得的溶液通過小活性炭床。為此所需的活性炭用量為該溶液重量的百分之幾，并且該量憑借本領域熟練技術人員的知識和經驗是已知的。
這些過濾通過在過濾之前向各溶液中加入工業助凝劑而得以簡化(例如Sedipur CF 902或Sedipur CL 930，產自BASF AG，Ludwigshafen)。
在本發明的有利實施方案中，發酵排出物(發酵液)通過加熱來滅菌，然后通過離心分離、過濾或傾析除去細胞物質。在基于發酵排出物加入50-1000mg/kg、優選100-200mg/kg工業上傳統的助凝劑之后，將該混合物過濾通過活性炭與砂子的短床以得到具有高D-泛酸含量的不含生物質的溶液。然后通過施加電場使該處理后的溶液通過一個或多個離子選擇膜。
然后將該溶液例如通過噴霧干燥而干燥。這可以并流、逆流或混合流進行。為了霧化，可使用所有已知的霧化器，尤其是離心霧化器(霧化盤)、單流噴嘴或雙流噴嘴。優選的干燥溫度條件是150-250℃的塔入口溫度和70-130℃的塔出口溫度。然而，干燥也可在更高或更低的溫度水平下進行。為了得到非常低的殘留濕氣，可以在流化床下游提供另一干燥步驟。
噴霧干燥也可在FSD或SBD干燥器中進行(FSD流化床噴霧干燥器；SBD噴霧床干燥器)，如由Niro(丹麥哥本哈根)和APV-Anhydro(丹麥哥本哈根)制造的，它們是噴霧干燥器與流化床的組合。
在噴霧干燥過程中，可添加防結塊劑。這可減少干燥器壁上的沉積并改善流動特性，確切地在細粒粉末的情況下。可使用的防結塊劑尤其是硅酸鹽、硬脂酸鹽、磷酸鹽和玉米淀粉。
原則上，干燥也可在噴霧的流化床中進行，在這種情況下這不僅可連續進行，還可分批進行。可將溶液不僅從頂部(頂部噴霧)和從底部(底部噴霧)噴霧，而且還可從側面(側面噴霧)進行噴霧。
本發明還涉及一種用作動物飼料添加劑和/或動物飼料添加物的組合物，這種情況下它可通過如下步驟制備a)使用至少一種生物，該生物產生D-泛酸，在該生物中去調節泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養基中發酵生成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養基中供入有0-20g/l、優選0g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)通過施加電場使該含有D-泛酸鹽的發酵溶液通過一個或多個離子選擇膜，其中低分子量離子從該含有D-泛酸鹽的溶液中除去，c)加入鈣堿和/或鎂堿以將該含有游離D-泛酸的溶液的pH設定為3-10，得到含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液，以及d)將該含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液進行干燥和/或配制。
在本發明的變體中，所述組合物的特征在于在步驟c)或d)中得到或加入含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的懸浮液。
根據本發明，所述組合物的進一步特征在于它包含濃度為至少1-100重量％、優選至少20-100重量％、特別優選至少50重量％的D-泛酸鹽。本發明涉及一種包含D-泛酸的二價陽離子形式的鹽，優選D-泛酸鈣和/或D-泛酸鎂的組合物。根據本發明，優選D-泛酸的一價陽離子形式的鹽的含量≤1g/kg的組合物。
根據本發明，通過上述方法，得到滿足飼料添加劑要求的D-泛酸鈣或D-泛酸鎂。這些要求例如是較高含量的D-泛酸鹽和與目標生物的高相容性以及高的表示本發明產物的“維生素活性”的生物價值。
本發明將通過下列實施例更詳細地描述，然而這些實施例不是對本發明的限制。
實施例1在容量為14升的裝有攪拌器和氣體引入裝置的實驗室發酵罐中加入具有下列組成的含水發酵培養基
滅菌后，額外加入下列無菌培養基成分
所述痕量鹽溶液具有下列組成0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O與水共同構成1升。該痕量鹽溶液通過無菌過濾加入。初始液體體積為8.4升。上面所給含量以該值為基礎。
向該溶液中，加入160ml枯草芽孢桿菌PA824的接種培養物(OD＝10，在SVY培養基(SVY培養基25g Difco Veal肉浸汁、5gDifco酵母提取物、5g谷氨酸鈉、2.7g(NH4)2SO4在740ml水中的溶液，滅菌；加入200ml無菌的1M K2HPO4(pH 7)和60ml無菌的50％葡萄糖溶液(終體積1升))中)，并將所得混合物于43℃和劇烈攪拌下在12L/min的氣體引入速率下發酵。該菌株按照PCT/US 0025993的附件進行描述。
在52h內，加入6升無菌水溶液，其組成如下
發酵在葡萄糖限制的條件下進行。在發酵過程中，通過加入25％濃度的氨溶液或20％濃度的磷酸將pH保持為7.2。氨同時還起發酵用氮源的作用。控制攪拌器元件的轉速，以將溶解的氧氣含量保持為其飽和值的30％。通過隨時加入消泡劑以控制起泡。在停止加入碳源之后，繼續發酵直到溶解的氧氣含量(pO2)達到其飽和值的95％。然后結束發酵，并將該生物加熱破壞。為此，將該發酵溶液滅菌60分鐘。通過沉積出來表明已破壞。然后通過離心分離將細胞分離除去。在細胞分離之后，D-泛酸鹽的濃度在52h后為24.7g/l。
按相似方法，也可生產未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的發酵液。
將上述通過加熱滅菌的且通過離心分離基本除去生物質的發酵排出物與額外的D-泛酸混合，并用硫酸將pH設定為約2。將所得溶液過濾通過砂子/活性炭的小床。溶液中D-泛酸的含量為67.7g/l。
將900g該濾液按如下進行電滲析處理在有效池面積為1.85dm2且具有5個室的電滲析池(裝有陰離子-和陽離子交換膜(類型分別為Tokuyama Corp.的Neosepta AMX Sb和CMX Sb)中，將濾液以29mA/cm2的初始電流密度脫鹽。在達到預設極限電壓20V之后，在實驗流程中將電流密度連續降低。溫度為33-40℃。加入作為濃縮進料的0.5％濃度(w/w)NaCl溶液。該濃縮物(CONC)富集在實驗流程中，而外來離子(例如銨離子、氯離子、鐵離子、鉀離子、鈉離子或磷酸根離子)從該濾液(稀溶液，DIL)中除去。在電解液循環中，為了沖洗電極，加入5％濃度(w/w)的硫酸鈉溶液。在該實驗流程中，在不同的稀溶液離子電導率值下，從含有稀溶液的室中取樣并分析。分析給出在下表中，并表明隨著實驗時間的推移，所述離子從該稀溶液中除去，該稀溶液的電導率相應下降。小的一價離子如氯離子與大體積的多價離子如磷酸根離子相比更快地被除去。
稀溶液的分析結果給出在下表中。
PTA＝泛酸所有稀溶液樣品的pH都為2-3。771g稀溶液排出物含有76g/l的游離D-泛酸。
此處表明，發酵所得的D-泛酸溶液可通過電解成功地除去干擾陽離子。可由所得的經脫鹽的D-泛酸制備如實施例2所述的非吸濕性D-泛酸鈣粉末。
實施例2在容量為14升的裝有攪拌器和氣體引入裝置的實驗室發酵罐中加入具有下列組成的含水發酵培養基
滅菌后，額外加入下列無菌培養基成分
所述痕量鹽溶液具有下列組成0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O與水共同構成1升。該痕量鹽溶液通過無菌過濾加入。初始液體體積為5.5升。上面所給含量以該值為基礎。
向該溶液中，加入55ml枯草芽孢桿菌PA824的接種培養物(OD＝10，在SVY培養基(SVY培養基25g Difco Veal肉浸汁、5gDifco酵母提取物、5g谷氨酸鈉、2.7g(NH4)2SO4在740ml水中的溶液，滅菌；加入200ml無菌的1M K2HPO4(pH 7)和60ml無菌的50％葡萄糖溶液(終體積1升))中)，并將所得混合物于43℃和劇烈攪拌下在12L/min的氣體引入速率下發酵。該菌株按照PCT/US 0025993的附件進行描述。
在48h內，加入6升無菌水溶液，其組成如下
發酵在葡萄糖限制的條件下進行。在發酵過程中，通過加入25％濃度的氨溶液或25％濃度的磷酸將pH保持為7.2。氨同時還起發酵用氮源的作用。控制攪拌器元件的轉速，以將溶解的氧氣含量保持為其飽和值的30％。通過隨時加入消泡劑以控制起泡。在停止加入碳源之后，繼續發酵直到溶解的氧氣含量(pO2)達到其飽和值的95％。然后結束發酵，并將該生物加熱破壞。為此，將該發酵溶液滅菌30分鐘。通過沉積出來表明已破壞。然后通過離心分離將細胞分離除去。在細胞分離之后，D-泛酸鹽的濃度在48h后為24.1g/l。
按相似方法，也可生產未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的發酵液。
將2817ml發酵罐排出物與1183ml濃度為178.9g/l的泛酸溶液混合，并用25％濃度的氫氧化銨溶液(pH 6.5)中和。然后將該混合物過濾通過砂子/活性炭。濾液中D-泛酸的含量為67g/l，主要呈銨鹽形式。將約720g該溶液按照實施例1進行電滲析處理使用3.5g 40％濃度的氫氧化鈣懸浮液將550g稀溶液排出物(密度為1.017g/ml)的pH調節至7.5。得到D-泛酸鈣水溶液(551.03g，D-泛酸鈣含量為40.9g/l)。
將該D-泛酸鈣水溶液在Niro Minor實驗室噴霧干燥器中干燥。塔入口溫度為約200℃，塔出口溫度為90℃。使用雙流噴嘴在2巴壓力下進行霧化。所添加的隔離劑是Sipernat 22F。得到具有下列技術指標的粉末產物(數據以重量％表示)水含量2.3％D-泛酸鈣46.1％銨離子0.60％鉀離子0.47％
鈉離子1.1％實施例3在容量為200升的裝有攪拌器和氣體引入裝置的發酵罐中，將800g50％濃度的酵母提取物、438g谷氨酸鈉、3200g大豆粉、640g硫酸銨、800g KH2PO4、1600g K2HPO4和50ml消泡劑Tego KS與70升水混合，并將該混合物在121℃下滅菌30分鐘。
然后加入溶液1和2。
溶液1按如下制成將1670g葡萄糖·H2O、10.2g CaCl2·2H2O和170.7g MgCl2·6H2O溶解在9升水中，并滅菌30分鐘。
溶液2按如下制成將800ml檸檬酸亞鐵溶液(200g/l檸檬酸鈉、2g/lFeSO4·7H2O，無菌過濾)與80ml痕量鹽溶液(0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6gMnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O與水共同構成1升，并無菌過濾)混合。
向該溶液中，加入2升枯草芽孢桿菌PA668的接種培養物(OD＝10，在SVY培養基(SVY培養基25g Difco Veal肉浸汁、5g Difco酵母提取物、5g谷氨酸鈉、2.7g(NH4)2SO4在740ml水中的溶液，滅菌；加入200ml無菌的1M K2HPO4(pH 7)和60ml無菌的50％葡萄糖溶液(終體積1升))中)，并將所得混合物于43℃和劇烈攪拌下在3m3/min的氣體流速下發酵。該菌株按照US 60/262,995的附件進行描述。
在48h內，加入約10升無菌的葡萄糖水溶液。該水溶液按如下制成將90kg葡萄糖·H2O和55kg水混合，并滅菌30分鐘。然后，加入300ml痕量鹽溶液(組成見上)和3升檸檬酸亞鐵溶液(組成見上)。然后加入1升無菌過濾的90g/l CaCl2·2H2O溶液和2升無菌過濾的375g/l谷氨酸鈉溶液。
發酵在葡萄糖限制的條件下進行。在發酵過程中，通過加入25％濃度的氨溶液或20％濃度的磷酸將pH保持為7.2。氨同時還起發酵用氮源的作用。控制攪拌器元件的轉速，以將溶解的氧氣含量保持為其飽和值的30％。通過隨時加入消泡劑以控制起泡。在停止加入碳源之后，繼續發酵直到溶解的氧氣含量(pO2)達到其飽和值的95％。然后結束發酵。通過在碟式分離機中分離將細胞除去。上清液中殘留細胞通過加熱滅菌而破壞。在48h后停止時，D-泛酸鹽的濃度為13.7g/l。在分離和滅菌之后，D-泛酸鹽的濃度為10.7g/l。按相似方法，也可生產未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的發酵液。
將3000g經這樣預處理的發酵溶液按如下進一步處理將該批料的三分之二在約10℃下用相當于相等濃度的多價陰離子(40％溶液)的CaCl2沉淀；將該批料的三分之一用等量的Ca(OH)2(固體)相應沉淀。將溶液在冰箱中儲存一夜，然后通過壓濾器(Seitz深度過濾器700)與沉淀的沉降物分離。然后將各溶液混合，并通過在約10℃下加入另外10g Ca(OH)2使其呈堿性(pH＝8.7)并再沉淀。同樣過濾除去再沉淀的沉降物。
然后，將1800g該溶液在35℃下在三回路電滲析組件中進行鹽交換。在這種情況下，使發酵液通過由兩個陽離子交換膜連接的產物室。在陰極側上，單選擇陽離子交換膜(Tokuyama Soda，CMS)將產物從濃縮物回路中分離，在陽極側上，產物室通過常規陽離子交換膜(TokuyamaSoda，CMX)與CaCl2回路分開。濃縮物和CaCl2回路通過陰離子交換膜(Tokuyama Soda，AMX)分離。在該濃縮物中，充有750g 0.5％濃度的NaCl溶液，在該CaCl2回路中，充有900g 3.05％濃度的CaCl2溶液。在電極沖洗回路中，有0.1M Na2SO4溶液在循環。該實驗以30mA/cm2在總膜面積為500cm2的由5個上述基本單元組成的組件中以分批方式恒電流進行。所選擇的停止標準是在CaCl2回路中最小電導率為4mS/cm。對產物和濃縮物回路中的陽離子的分析結果總結在下表中。
由此計算出，除去了51％的鈉、66％的銨離子和61％的鉀。平均電流產率為82％。兩個相鄰回路中泛酸的損失在每種情況下為所用物質量的0.08％。在實驗過程中產物回路的pH為7-7.5，在濃縮物和CaCl2回路中pH為約6。
在實驗過程中，根據CaCl2回路中的電導率從大約11V降至16V，總的電壓降增加。
然后，將這樣通過電滲析處理的溶液成功地噴霧干燥，得到終產物。此處表明，在適當預處理的情況下，利用單選擇陽離子交換膜的三回路電滲析可用于一價陽離子的離子交換，而保留二價陽離子，以增加終產物的噴霧干燥能力。
權利要求
1.一種制備D-泛酸和/或其鹽的方法，其包括如下步驟a)使用至少一種生物，該生物產生D-泛酸，在該生物中去調節泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養基中發酵生成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養基中供入有0-20g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)通過施加電場使該含有D-泛酸鹽的發酵溶液通過一個或多個離子選擇膜，其中低分子量離子從該含有D-泛酸鹽的溶液中除去，c)加入鈣堿和/或鎂堿以將該含有游離D-泛酸的溶液的pH設定為3-10，得到含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液，以及d)將該含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液進行干燥和/或配制。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述培養基中沒有供入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所用的產生D-泛酸的生物是細菌、酵母或真菌。
4.如權利要求1-3任一項所述的方法，其中所用微生物是來自芽孢桿菌科的細菌。
5.如權利要求1-4任一項所述的方法，其中使用芽孢桿菌屬的細菌，優選枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌種。
6.如權利要求1-5任一項所述的方法，其中在步驟a)中，生成D-泛酸和/或其鹽，含量為至少10g/l培養基，優選至少20g/l，特別優選至少40g/l，非常高度優選至少60g/l培養基。
7.如權利要求1-6任一項所述的方法，其中在步驟c)中，將溶液的pH設定為5-10。
8.如權利要求1-7任一項所述的方法，其中在步驟c)中，將溶液的pH設定為5-9，優選6-9，特別優選6-8。
9.如權利要求1-8任一項所述的方法，其中在步驟b)中，使用單極和/或偶極離子交換膜。
10.如權利要求1-9任一項所述的方法，其中在步驟b)中，使用單極離子交換膜。
11.如權利要求1-10任一項所述的方法，其中在步驟b)中，使用單選擇離子交換膜。
12.如權利要求1-11任一項所述的方法，其中將含有D-泛酸的發酵液的pH在步驟b)處理之前設定為D-泛酸的等電點pH。
13.如權利要求1-12任一項所述的方法，其中在步驟b)中，將單極離子交換膜的電流密度設定為1-100mA/cm2，優選10-80mA/cm2，特別優選20-40mA/cm2。
14.如權利要求1-13任一項所述的方法，其中在步驟b)中，將偶極離子交換膜的電流密度設定為1-150mA/cm2，優選30-100mA/cm2，特別優選70-90mA/cm2。
15.如權利要求1-14任一項所述的方法，其中在步驟b)中，將一價陽離子，優選銨離子、鉀離子和/或鈉離子的含量降至≤1g/kg溶液的濃度。
16.如權利要求1-15任一項所述的方法，其中為了中和，將氫氧化鈣、碳酸鈣、氧化鈣、氫氧化鎂和/或堿式碳酸鎂以固體和/或水懸浮液形式加入步驟c)的溶液中。
17.如權利要求1-16任一項所述的方法，其中將包含2-55重量％、優選10-50重量％、特別優選20-40重量％的氫氧化鈣的水懸浮液加入步驟c)的溶液中。
18.如權利要求1-17任一項所述的方法，其中將包含2-65重量％、優選10-50重量％、特別優選20-40重量％的碳酸鈣的水懸浮液加入步驟c)的溶液中。
19.如權利要求1-18任一項所述的方法，其中將包含2-60重量％、優選10-50重量％、特別優選20-40重量％的氫氧化鎂的水懸浮液加入步驟c)的溶液中。
20.如權利要求1-19任一項所述的方法，其中將包含2-25重量％、優選10-20重量％的堿式碳酸鎂的水懸浮液加入步驟c)的溶液中。
21.如權利要求1-20任一項所述的方法，其中在步驟c)或d)中，得到或加入含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的懸浮液。
22.一種用作動物飼料添加劑和/或動物飼料添加物的組合物，其中它可通過如下步驟制備a)使用至少一種生物，該生物產生D-泛酸，在該生物中去調節泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養基中發酵生成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養基中供入有0-20g/l、優選0g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)通過施加電場使該含有D-泛酸鹽的發酵溶液通過一個或多個離子選擇膜，其中低分子量離子從該含有D-泛酸鹽的溶液中除去，c)加入鈣堿和/或鎂堿以將該含有游離D-泛酸的溶液的pH調節至3-10，得到含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液，以及d)將該含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的溶液進行干燥和/或配制。
23.如權利要求22所述的組合物，其中在步驟c)或d)中，得到或存在含有泛酸鈣和/或泛酸鎂的懸浮液。
24.如權利要求22或23所述的組合物，包含D-泛酸的二價陽離子形式的鹽，優選D-泛酸鈣和/或D-泛酸鎂。
25.如權利要求22-24任一項所述的組合物，包含濃度為至少1-100重量％、優選至少22-100重量％、特別優選至少50重量％的D-泛酸鹽。
26.如權利要求22-25任一項所述的組合物，其中D-泛酸的一價陽離子形式的鹽的含量≤1g/kg。
全文摘要
本發明涉及一種制備D－泛酸和/或其鹽的改進方法以及所述物質作為動物飼料添加劑的用途。
文檔編號C12P13/02GK1492935SQ02805330
公開日2004年4月28日 申請日期2002年2月20日 優先權日2001年2月21日
發明者K－U·鮑爾德紐斯, C·貝克, A·費歇爾, H-P·哈爾茨, M·洛沙德伊特, M·萊曼, K-U 鮑爾德紐斯, 車亂撂 申請人:巴斯福股份公司