專利名稱：氨基葡糖和從微生物質中制備氨基葡糖的方法
技術領域：
本發明涉及氨基葡糖組合物和制造氨基葡糖組合物的方法。
背景技術：
氨基葡糖是已被證明可明顯治療性減輕關節炎和關節痛的營養補劑(nutraceutical supplement)。盡管機制尚不完全清楚，但相信氨基葡糖的功能是幫助恢復軟骨以減輕關節的炎癥，因此對病人有明顯的益處。
目前，氨基葡糖基本來源于獲取的天然原料，例如甲殼類動物和其它水生生物。用不同的生產技術把這些生物的殼和外骨骼組分轉化成氨基葡糖。對一些應用來說可以用這些天然原料生產氨基葡糖，但是它們是有些限制的。這些限制包括野生甲殼類由于天然生長在不受控制的環境中使得它們在組分上有明顯變異。甲殼類動物根據生長條件及其品種在其大小和組分上有差異。同樣，在沒有控制的生長條件下，甲殼類動物暴露在環境污染中，包括重金屬，它將滯留在氨基葡糖或其它從甲殼類動物生產的產品中。甲殼類動物的收獲經常是季節性的，因此甲殼類動物的供應和價格會因時間明顯變化。
對來源于甲殼類動物的氨基葡糖的進一步憂慮是很大一部分人群對甲殼類動物過敏并且不能使用包含來自甲殼類動物成分的產品。經過高度處理的材料，例如氨基葡糖，如果適當制備就不會產生任何過敏的危險；但依然憂慮是高度過敏的個體甚至對來源于天然甲殼類動物的微小痕量過敏原仍會過敏。即使如果不存在這種過敏原，來源于甲殼類動物的氨基葡糖也會引起某些對甲殼類動物過敏個體的憂慮，因為這些個體消費者不一定知道是否所有的過敏原均被去除。
跟甲殼類動物來源的氨基葡糖現有來源相關的另一個問題是一些甲殼類動物的供應是從世界上的大海或大洋中收獲的。過度捕撈甲殼類動物對環境會有很大的負面影響。因此，相信某些消費者更喜歡使用那些不是捕撈自海洋生命的氨基葡糖。即使如果捕撈甲殼類動物對環境的影響不是負面的，仍擔心年年野生甲殼類動物供應數量上的限制和數量不一致的限制。
因此，就要建立安全的、一致的和高質量的氨基葡糖來源，它是經濟的并且對環境的影響是最小的。
發明概述本發明涉及氨基葡糖，包括適合于人或動物用(consumption)的含有氨基葡糖的材料。本發明的氨基葡糖來源于包含幾丁質的發酵的真菌生物質。適合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如來源于曲霉屬(Aspergillus sp.)、青霉屬(Penicilliunsp.)、毛霉屬(Mucor sp.)的真菌源和它們的組合。真菌生物質的使用產生高質量的產品，其通常產生僅有低水平的雜質的相同的氨基葡糖。本發明的氨基葡糖通常有相對低的灰分含量，和低的重金屬含量。除此之外，做為真菌生物質產品，所述的氨基葡糖不會對那些對甲殼類動物過敏的人產生危險。
本發明也涉及通過發酵的真菌生物質的酸水解來產生氨基葡糖的方法。從微生物質得到氨基葡糖的方法包括在酸性溶液中反應包含幾丁質的生物質，特別是在升高溫度下，在酸中反應包含幾丁質的生物質。
從本發明詳述和權利要求書中可明顯看出本發明別的其它特征和優點。上面公開內容的原則概述不是描述本公開內容的每一個說明的實施方案或每一個實施例。下面的詳述部分利用這里公開的原則對某些實施方案進行更具體地舉例說明。
附圖參照下面的附圖更全面地解釋本發明，其中
圖1中的表顯示按照本發明制備氨基葡糖的示例方法的隨時間變化的氨基葡糖的產量百分比。
圖2是按照本發明制備的氨基葡糖的層析圖譜。
圖3是按照本發明制備的氨基葡糖的層析圖譜。
同時，本發明的原則可以有不同的修改和不同的形式，通過實施例詳述其細節。然而應該理解本發明不限于描述的特定實施方案。相反，在公開內容的精神和范圍內，意圖是包括所有的修改、等價物(equivalents)和改變。
發明詳述本發明涉及氨基葡糖，包括適合于人或動物用的含有氨基葡糖的材料。氨基葡糖來源于存在于多種真菌生物質的幾丁質。幾丁質是天然的多糖，結構是2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(N-乙酰基-D-氨基葡糖)(2-acetoamido-2-deoxy-D-glucose(N-acetyl-D-glucosamine))的無支鏈的多聚體。通過通用的重復結構描繪這一分子式 幾丁質是典型的無定形固體，幾乎不溶于水，稀酸和堿。盡管幾丁質有多種商業應用，但是更大的商業應用是通過把多聚體結構轉化成單個的2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖組分，這就是已知的氨基葡糖。在結構上，氨基葡糖是用氨基取代第二位碳(C-2)上的OH基的修飾的葡萄糖。通用的結構是
如上所述，本發明的氨基葡糖來源于包含幾丁質的發酵的真菌生物質。適合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如來自于曲霉屬(Aspergillus sp.)、青霉屬(Penicilliun sp.)，毛霉屬(Mucor sp.)和它們的組合的真菌源。真菌生物質的使用產生高質量的產品，其產生僅有低水平的雜質的基本相同的氨基葡糖。本發明的氨基葡糖通常有相對低的灰分含量，和低的重金屬含量。除此之外，做為真菌生物質產品，氨基葡糖不會對那些對甲殼類動物過敏的人產生危險。
現在更詳細地描述氨基葡糖組成、原材料和生產方法。
A.氨基葡糖本發明的氨基葡糖來源于相對相同的真菌生物質源，因此一般有基本相同的組成。根據純化氨基葡糖或所希望的氨基葡糖鹽的方法；產生的包含氨基葡糖的組合物有不同水平的純度，包括超過95％的純度、98％的純度和甚至99.8％的純度的組合物。氨基葡糖組合物也包含另外的成分，例如另外的鹽。在此情形下，希望組分的總純度相對于不希望的雜質能夠維持在超過95％、98％甚至99.8％的純度水平。
本發明的氨基葡糖有如下通式 這個通式依氨基葡糖不同鹽的存在而不同，包括檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽和葡糖酸鹽等。同樣，在不脫離本發明范圍的情況下氨基葡糖可以被取代或修飾。因此，這里使用的術語氨基葡糖是指不同形式的氨基葡糖，包括鹽復合物和取代的氨基葡糖。
這個通式依氨基葡糖不同鹽的存在而不同，包括檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽和葡糖酸鹽等。同樣，在不脫離本發明范圍的情況下氨基葡糖可以被取代或修飾。因此，這里使用的術語氨基葡糖是指不同形式的氨基葡糖，包括鹽復合物和取代的氨基葡糖。
通常氨基葡糖是高純度的，但可能包含別的成分，包括葡萄糖，未反應的幾丁質和其它材料。優選地氨基葡糖包含少于10％的葡萄糖，更優選的少于5％的葡萄糖，甚至更優選的少于2％的葡萄糖。氨基葡糖可能也包含其它的有機雜質。例如氨基葡糖可能包含有機酸。但是，如果存在有機酸，通常發現其只有非常有限的數量，例如象上述的葡萄糖的水平或甚至更小的數量。本發明的氨基葡糖有相對低的灰分含量。灰分含量通常少于5％，更典型的是少于2％，在一些實施例中甚至少于1％。在本發明的氨基葡糖中鈣的水平通常也是低的。通常重金屬含量同樣低，典型的低于百萬分之100份，更典型的低于百萬分之50份，甚至更典型的低于百萬分之20份。在某些實施方案中該水平低于百萬分之10份。氨基葡糖有正比旋光，例如氨基葡糖的鹽酸鹽是正69到74度的比旋光。
本發明的氨基葡糖在純凈干燥形式下通常是相對白色的。但當溶解在水溶液中是無色的。在一個實施例中，20％重量比氨基葡糖溶液的美國公共衛生協會(American public Health Association)(APHA)的顏色少于50。通常氨基葡糖也有很小的氣味，并且通過氣味就可以區別于來源于甲殼類動物的氨基葡糖。
B.微生物真菌生物質原材料適合的原材料包括基本上相同的微生物質源，典型的是真菌生物質，例如含有全部細胞于重10％以上的幾丁質的絲狀真菌，例如來源于曲霉屬(Aspergillus sp.)、青霉屬(Penicilliun sp.)、毛霉屬(Mucor sp.)的真菌源。適合的真菌生物質包括黑色曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、魯克氏毛霉(Mucor rouxii)、產黃青霉(Penicillium chrysogenum)、點青霉(Penicilliumnotatum)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum)；尤其是季也蒙氏假絲酵母(Candidaguillermondi)、黑色曲霉(Aspergillus niger)和土曲霉(Aspergillus terreus)。生物質通常從商業的發酵反應中回收，例如有機酸的商業產品，包括檸檬酸。同樣，可以專門為這個過程生產適合生產氨基葡糖的生物質而不是用其它過程的副產品。這里使用的術語微生物不包括浮游植物和甲殼動物或軟體動物。
本發明尤其適合使用幾丁質水平超過生物質干重5％的生物質。此類生物質中通常含占生物質干重5-25％和可占生物質干重10％-20％的幾丁質。同樣，為了制備高質量的氨基葡糖，有時希望在生物質的生長過程中，在相對相同的溫度和營養水平的基本上可控制的方式下生產微生物質。
C.氨基葡糖的生產方法本發明也涉及形成氨基葡糖的方法。包括從發酵的真菌生物質的酸水解形成。酸水解破壞了醚鍵和使幾丁質分子脫去乙酰基產生游離的氨基葡糖。酸水解足以破壞幾丁質成為氨基葡糖，但是使氨基葡糖分子基本上完整。水解反應條件有破壞一些存在于真菌生物質中其它成分(如葡聚糖，蛋白和脂類)的額外優勢。通常通過在強酸溶液中處理真菌生物質超過4小時而進行此類酸水解。
生產氨基葡糖通常包括以下步驟提供含幾丁質的生物質，在酸性溶液中反應含幾丁質的生物質形成氨基葡糖和從酸性溶液中分離氨基葡糖。該反應通常具有真菌生物質原材料中全部幾丁質含量50％以上的氨基葡糖產量。
強酸可用于水解真菌生物質，包括濃度小于50％的酸，更常用的是5-25％濃度的酸。適合的強酸包括適當水平的鹽酸、硫酸、磷酸和檸檬酸。
通常氨基葡糖的形成反應使用5-20％的酸、2-50％預處理的生物質(依據干重，盡管通常生物質在有水存在下處理)和35-93％的水。在某些實施例中反應混合物包含8-12％的鹽酸、4-8％的生物質(依據干重)和80-90％的水。
包含生物質、酸和水的混合物，加熱并維持在升高的溫度。混合物通常加熱到或接近它的沸點并維持在回流條件超過5小時，更典型的是超過8小時，通常少于16小時。希望使反應持續足夠長以完全地破壞幾丁質，但不持續長到低效率或過多的分解氨基葡糖。
在酸溶液中反應產生氨基葡糖，但要產生滿意的產品通常需要隨后的純化步驟。第一個純化步驟通常包括過濾去除顆粒雜質，產生基本上澄清的濾液。通常此濾液中包含氨基葡糖，也包含少量的葡萄糖和其它糖。隨后用蒸發步驟來濃縮氨基葡糖和可能去除一些酸，這可以再循環和再利用。通過蒸發濃縮混合物，通過往濃縮混合物中加入乙醇或繼續蒸發到其溶解度的極限，氨基葡糖能以純化的固體沉淀出來。
氨基葡糖可以通過過濾或離心回收，然后干燥。干燥的氨基葡糖可選擇進一步純化以去除任何殘余的糖。去除這些多余糖的一種方法是通過在水中溶解氨基葡糖或加入乙醇，這樣可在更大的純度沉淀氨基葡糖。另外，溶液可以通過電滲析、層析、膜濾等來純化。氨基葡糖可選擇用乙醇、碳或其它適合的材料和方法來脫色。
除了上面描述的步驟，可以一開始處理生物質以去除一些雜質或改進氨基葡糖產量。這些處理包括加熱生物質、加入消化酶、與酸或堿混合、機械攪拌或加壓脫水。一個特別適合的處理是在氫氧化鈉存在時預處理生物質。在某些實施例中把濃度小于10％的氫氧化鈉加入真菌生物質中，加熱到升高的溫度持續一段時間，足以去除絕大部分不含幾丁質的材料。這個階段通常小于2小時。該預處理方法的一個具體的例子需要在2-8％的氫氧化鈉溶液中，加熱真菌生物質到100到125℃持續20到60分鐘。這個步驟水解了生物質中的一些蛋白和葡聚糖，其副產品通過過濾可選擇性地去除。過濾步驟后去除可溶蛋白質、氨基酸等。在本發明具體的實施例中，洗過的和預處理的生物質包含超過50％的水，甚至超過70-80％的水。通常預洗過的真菌生物質中水的水平為大約80％到95％。
D.實施例通過下面非限制性說明性實施例進一步說明本發明。除非另外指明，各部分中所有的數量都是重量。
實施例1用4％的氫氧化鈉(NaOH)水溶液120℃高壓滅菌1小時預處理檸檬酸生物質，這一步驟去除過量的蛋白質和其它不希望的材料。然后用去離子水徹底洗生物質直到pH值為大約7.0。該洗過的材料與濃鹽酸(HCl)和水混合形成含10-15％鹽酸和5-6％生物質的混合物(按照生物質的干重)。該混合物加熱回流。時常取出樣品，用DionexHPLC高壓液相色譜(商標名稱DX-500)分析反應。
結果顯示在圖1中，其為氨基葡糖產量指示圖，并且顯示在8小時反應內，氨基葡糖產生不斷增加，但是葡萄糖的量在4小時后減少。8小時后氨基葡糖的產率是14％。該產品的層析圖譜如圖2所示。
反應后，過濾混合物，用RotaVap制造的旋轉蒸發器使濾液蒸發以增加溶液中氨基葡糖的濃度。終體積減少到大約10到20毫升。在此溶液中加入20毫升乙醇并使溶液渦漩以加速氨基葡糖的沉淀并增加產量。通過過濾得到氨基葡糖沉淀并進一步用酒精洗滌直到顏色變白。圖3顯示了該產品的層析圖譜，顯示超過97％的氨基葡糖。
實施例2重復實施例1，但是要使預處理生物質維持在回流條件下13小時。產生的氨基葡糖的純度超過98％。
前述的詳述和實施例僅是為了清楚理解。不應將說明書和實施例理解為對本發明的限制。本發明不限于顯示的和描述的確切細節，因為權利要求書所限定的本發明里包括各種變化。
權利要求
1.適合人或動物用的包含氨基葡糖的材料，氨基葡糖來源于發酵的微生物質。
2.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖的灰分含量小于2％。
3.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中氨基葡糖的重金屬含量小于每百萬20份。
4.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中通過發酵的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
5.權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用酸處理微生物質超過4小時的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
6.權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用酸處理生物質超過8小時的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
7.權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用5-25％的強酸溶液處理生物質的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
8.權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用5-25％的強酸溶液處理生物質超過4小時的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
9.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中當氨基葡糖為鹽酸鹽形式時，氨基葡糖有正69-74度的比旋光。
10.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的微生物質的產率為生物質原材料的全部幾丁質含量的50％以上。
11.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的包含氨基葡糖的材料包含少于5％的葡萄糖。
12.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中包含氨基葡糖的材料根據干重大于98％的純度。
13.權利要求12的包含氨基葡糖的材料，其中所述的包含氨基葡糖的材料僅包含氨基葡糖，或者氨基葡糖中混合有其他成分。
14.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖20％重量比的水溶液具有小于50的美國公共健康協會的顏色。
15.權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖來源于基本相同的微生物真菌源。
16.權利要求15的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖來源于曲霉屬、青霉屬、毛霉屬和它們的組合。
17.權利要求15的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖來源于絲狀真菌的品種，其具有全部細胞重量的10％以上的幾丁質。
18.從微生物質得到氨基葡糖的方法，本方法包括以下步驟(a)提供含幾丁質的生物質；(b)在酸濃度大于5％的酸溶液中，反應溫度高于80℃，使含幾丁質的生物質反應，反應時間至少4小時，將生物質中的幾丁質轉化成氨基葡糖；并且(c)從酸性溶液中分離氨基葡糖。
19.權利要求18的方法，其中分離氨基葡糖的步驟包含從酸性溶液中結晶氨基葡糖。
20.權利要求18的方法，其中酸溶液的酸濃度是5-25％。
21.權利要求18的方法，其中酸溶液的酸濃度是5-50％。
22.權利要求18的方法，其中反應溫度高于80℃。
23.權利要求18的方法，其中反應時間為4-25小時。
24.權利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料具有含幾丁質的生物質的全部幾丁質含量的50％以上的產率并且含有小于5％的葡萄糖。
25.權利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料含有小于5％的可溶性糖。
26.權利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料根據干重為大于98％的氨基葡糖。
27.權利要求18的方法，其中所述的氨基葡糖來源于曲霉屬、青霉屬、毛霉屬和它們的組合。
全文摘要
本發明公開了適合人和動物用的氨基葡糖。所述的氨基葡糖來源于含有幾丁質的微生物質。適合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如來源于曲霉屬(Aspergillussp.)、青霉屬(Penicilliun sp.)、毛霉屬(Mucor sp.)或它們的組合的真菌源。本發明也公開了通過酸水解發酵的真菌生物質生產氨基葡糖的方法。
文檔編號A23L1/30GK1496408SQ02806321
公開日2004年5月12日 申請日期2002年2月15日 優先權日2001年2月16日
發明者范煒宇, J·A·鮑爾曼, J·R·特林科勒, J·D·斯坦科, 黃基五, J·P·海寧, 斯坦科, 海寧, 特林科勒, 鮑爾曼 申請人:卡吉爾公司