高度特異性的重組免疫毒素及其制備方法

專利名稱：高度特異性的重組免疫毒素及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種以TH1細胞為靶細胞，特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞的重組免疫毒素及其制備方法。
背景技術：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是由導向分子和毒素分子共同構成的雜合分子，又稱生物導彈。最早的免疫毒素(即第一代免疫毒素)是將載體與毒素分子通過化學偶聯而成，這類免疫毒素分子量大、穩定性及均一性較差，且難以大規模生產，因而限制了其應用。隨著分子生物學的發展，近年來人們通過基因工程的重組技術，將載體基因與毒素基因融合，經表達及純化制備而得重組免疫毒素。這種新工藝產生的免疫毒素能有效克服第一代免疫毒素的缺陷，極大地推動了免疫毒素在相關領域的深入研究。有關免疫毒素在生物醫學的應用，主要都集中于對某些惡性腫瘤及與免疫相關的人類疾病的導向治療。其中，以T細胞為靶細胞的免疫毒素在治療T細胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病(GvHD)取得了良好療效(參見Hu HZ，et al.CellImmunol.1997，17726；BrennerT，et al.Immunol lett.1999，68403)。這些免疫毒素的作用靶點主要是選擇針對T細胞表面抗原或細胞因子受體，如CD3、CD5、IL-2等，在接受這些免疫毒素的治療后，相應的自身免疫性疾病或GvHD病情雖有減退，但毒副作用也較顯著，甚至使臨床治療被迫終止。這些毒副作用的主要原因之一是由于這類免疫毒素所選擇的導向分子特異性欠佳，往往導致無選擇性地殺死所有T細胞。隨著基礎免疫學的研究進展，人們認識到識別各種自身抗原的自身反應性T細胞，實際上是由CD4+TH1細胞所承擔的，而CD4+TH2僅具有一定的調節作用(參見LiblauRS，et al.Immunol.Today.1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。由此提示，如果能利用特異性更高的免疫毒素只將這些活化的自身反應性TH1細胞殺死，則有可能彌補上述缺陷，建立相應的特異性自身免疫耐受，實現治療自身免疫性疾病的目的。自身免疫性疾病(autoimmune disease)是由于各種原因導致免疫系統對自身抗原發起攻擊，造成自身組織損傷和功能障礙的一大類疾病。目前的治療措施主要是采用各種非特異的免疫抑制劑，但往往使患者免疫系統受到普遍性抑制而導致感染、腫瘤的發生及骨髓抑制等，且不能有效地防止疾病的復發。因而促使相關領域的研究者從免疫治療的角度，尋求一種特異、安全、有效的治療方法如MHC阻斷法、CD4分子阻斷法、TCR阻斷法、細胞因子治療、T細胞接種以及口服抗原誘導耐受等等，但這些方法或因特異性不高、療效不穩定，或因技術難度大、難以克服的毒副作用等而不能順利地過渡到臨床(參見Waldor MK，et al.Science.1985，227415；ChenY，et al.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355)，因而自身免疫性疾病的治療至今仍然是困擾臨床的一大難題。

發明內容
本發明針對現有技術存在的不足，提供一種新型的特異攻擊TH1細胞的重組免疫毒素，為臨床急待解決的自身免疫性疾病治療提供一種新方案，為重組免疫毒素的應用開辟一條新途徑。
本發明的技術方案是提供一種制備重組免疫毒素的質粒，此種質粒具有附圖1所述的IL-18cDNA堿基序列(來自gene bank)和附圖2所述的綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38cDNA堿基序列(來自gene bank)連接而成。提供一種高度特異性的重組免疫毒素，此種重組免疫毒素由上述質粒表達、純化形成，以IL-18為導向分子、以綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38為毒素分子，具有特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞的特性。IL-18是近年發現的一種新型細胞因子，在免疫應答的過程中，活化的T細胞將表達多種受體，如細胞因子IL-2、IL-12、IL-18的受體以及多種化學趨化因子CCR-5，CXCR-3等的受體。這些T細胞的膜受體中，現已證實IL-18受體的表達僅限于活化的TH1細胞，而TH2細胞沒有表達，并且這種膜受體的表達是穩定和持續的(參見Okamura H，et al.Nature.1995，37888；Chan WL，et al.J.Immunol.2001，1671238；Nakanishi K，et al.Annu.Rev.Immunol.2001，19423)，因此，IL-18受體不僅可以作為識別TH1細胞和TH2細胞的標志，也為相關的免疫治療提供了一個理想的靶位。本發明選用IL-18為導向分子，綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38為毒素分子，制備IL-18-PE38重組免疫毒素，特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞，誘導自身免疫耐受，從而解決了原有免疫毒素特異性欠佳的問題，實現有效治療自身免疫性疾病的目的。
重組質粒的構建方法依次包括以下步驟1、將動物的IL-18基因用RT-PCR擴增；2、將上述擴增的IL-18基因片段按TA克隆法實現與質粒載體重組，再轉染至感受態細菌中進行擴增，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；3、限制性內切酶酶切圖譜分析重組質粒，并進行DNA序列分析，以保證重組質粒中IL-18插入片段的正確性；4、限制性內切酶分別消化正確序列的IL-18及PE38的質粒DNA，純化DNA片段，將IL-18和PE38片段連入質粒載體中，即構建成重組質粒；5、用TNT體外翻譯試劑盒測定重組質粒的表達活性。
構建重組質粒可選用的質粒載體有pET27、PRKL459K、PGEX-2T。
重組免疫毒素IL-18-PE38的制備方法依次包括以下步驟1、上述重組質粒轉染的工程菌的制備；2、免疫毒素的表達與純化。
上述各步驟的具體操作如下1、制備重組質粒轉染的工程菌(1)制備感受態細菌；(2)將上述重組質粒轉入感受態細菌的細胞中；(3)通過蛋白合成抑制實驗測定工程菌的表達活性。
2、免疫毒素的表達與純化(1)將重組質粒轉染的工程菌接種于培養基中培養；(2)收集高效表達的工程菌菌液并進行破菌處理，獲取免疫毒素IL-18-PE38的粗提物；(3)用Glutahione Sepharose4B或親和層析柱對免疫毒素IL-18-PE38粗提物進行純化處理；
(4)通過蛋白合成抑制實驗測定免疫毒素的表達活性。
制備重組質粒轉染的工程菌可選用的感受態細菌有E.coli.BL21、DH5α、JM109。
本發明所涉及的新型免疫毒素及其制備方法具有以下優點和積極效果1、選擇新型細胞因子IL-18為導向分子，由于IL-18受體只表達在活化的TH1細胞表面，TH2細胞表面沒有表達，因而由IL-18導向的重組免疫毒素只針對TH1細胞，從而使導向攻擊更特異、更有效，減少臨床應用的毒副作用。
2、毒素分子選用的是綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38，從而避免了血液中普遍存在的抗白喉外毒素抗體對免疫毒素生物活性的干擾。
3、PE38為綠膿桿菌外毒素的活性片段，較PE40進一步去除了PE分子的細胞結合區和一個二硫鍵，可進一步減少非特異性結合和降低不良反應。
4、免疫毒素IL-18-PE38是通過DNA重組技術來獲得的重組免疫毒素制劑，它避免了原來化學偶聯免疫毒素復雜的制備工藝和難以標化的缺點，使其更易產業化。
5、免疫毒素IL-18-PE38可通過多途徑給藥。①直接利用IL-18-PE38蛋白制劑；②利用IL-18-PE38 DNA制劑，即采用IL-18-PE38表達質粒轉染活體肌肉細胞的方法，將IL-18-PE38表達質粒直接導入動物肌肉，使IL-18-PE38在骨骼肌內高效表達而起到治療作用。
6、免疫毒素IL-18-PE38亦可用于移植排斥反應及某些腫瘤的防治。
四

圖1是IL-18cDNA的堿基序列；圖2是PE38cDNA的堿基序列。
五具體實施例方式
實施例1構建制備重組免疫毒素IL-18-PE38的原核表達質粒IL-18cDNA的堿基序列如圖1所示，PE38cDNA的堿基序列如圖2所示，載體選用pET27。具體步驟如下1、小鼠IL-18基因用RT-PCR擴增(1)異硫氰酸胍一步法提取激活巨噬細胞的總RNA，取10μg Oligo(dT)混合，行反轉錄。
(2)PCR擴增的引物為上游5′-CGGAATTCATAACTTTGCCGACTTCAGTGTAC下游5′-CGGAATTCACTAACTTTGATGTAAGTTAGTGAGAG(3)PCR反應條件94℃0.5分鐘、56℃0.5分鐘、72℃1分鐘，30個循環后72℃延伸10分鐘。
(4)擴增產物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。
2、將上述擴增的IL-18基因片斷按TA克隆法實現與質粒載體pET27重組，再轉染至感受態細菌中進行擴增，篩選出含有正確插入片段的克隆。
3、限制性內切酶酶切圖譜分析重組質粒，并進行DNA序列分析，以保證重組質粒中IL-18插入片段的正確性。
4、限制性內切酶分別消化正確序列的IL-18及PE38的質粒DNA，純化DNA片段，將IL-18及PE38片段分別連入pET27表達質粒載體中，構成IL-18-PE38的原核表達質粒pET27-IL-18-PE38。
5、IL-18-PE38原核表達質粒的活性測定，用TNT體外翻譯試劑盒，以pET27-IL-18-PE38質粒DNA作模板翻譯出相應的蛋白質，再用ConA刺激小鼠脾臟細胞，活化其中的T細胞，這些活化的T細胞將作為靶細胞檢定IL-18-PE38原核表達質粒的活性。
實施例2制備重組免疫毒素IL-18-PE38工藝步驟依次如下1、制備原核表達質粒pET27-IL-18-PE38轉染的工程菌(1)制備感受態細菌A.將大腸桿菌E.coli BL21在瓊脂培養基平板上劃線接種，37℃培養12-16小時。
B.從平板中取出2-3mm大小的單菌落，移至含3mlLB培養基中，37℃振蕩培養過夜。次日取菌液1ml接種至含有100mlLB培養基的的三角瓶中，37℃300rpm強烈振蕩培養3小時，使細胞濃度達到5×107個細胞/ml，此時，細菌的OD600一般在0.4左右。
C.將培養的細菌在冰上放置10分鐘，然后轉移到無菌處理過的用冰預冷的50ml離心管中。
D.4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清液，回收細胞。
E.用冰預冷的0.1mol CaCl210ml重懸菌體，置冰浴30分鐘。
F.4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清液。再加4ml冰預冷的0.1mol CaCl2重懸菌體，此即感受態細菌。
(2)將實施例1制備的原核表達質粒pET27-IL-18-PE38轉入感受態細菌的細胞中A.無菌狀態下取新鮮感受態細菌100μl置于無菌試管中，加入10ngpET27-IL-18-PE38質粒DNA，輕輕旋轉混勻內容物，在冰上放置30分鐘。
B.42℃熱休克90秒鐘，不要搖動試管，迅速放回冰中，將細胞冷卻1-2分鐘后，加入1000μlSOC培養基，37℃振蕩培養45分鐘。
C.取80μl轉化混合物，用L型玻棒鋪于含適當濃度抗生素的LB瓊脂平板上，室溫下放置20分鐘，待溶液被瓊脂吸收后，倒置37℃培養16-20小時；待菌落長出后，無菌挑取單菌落進行擴大培養。
(3)通過蛋白合成抑制實驗測定工程菌的表達活性將ConA活化的T細胞接種于96孔細胞板培養(約5×104個細胞/孔)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培養基和工程菌培養上清20μl，混勻后共同孵育20小時(37℃，5％CO2)，再加入H3亮氨酸(4.5μci/ml)10μl，4小時后收集細胞，測定并計算蛋白合成抑制百分率，確定工程菌的表達活性。
2、重組免疫毒素IL-18-PE38的表達與純化(1)將帶pET27-IL-18-PE38質粒的工程菌接種于含一定濃度抗生素的LB培養基中，30℃搖床培養至OD600達0.5，轉至42℃繼續培養5小時。
(2)收集培養的高效表達的工程菌菌液，4℃離心5000rpm，15分鐘，棄上清。
(3)每克濕菌加3mlTE緩沖液，高強度超聲(20kHz)進行破菌處理。
(4)離心10000g，30分鐘，收集上清液。
(5)取10μl上清與10μl2×SDS樣品緩沖液混勻，于沸水中煮5分鐘，然后上樣進行10％SDS-PAGE電泳(200V，50-60分鐘)，凝膠用考馬斯亮藍染色。
(6)將IL-18-PE38蛋白粗提物用50％Glutahione Sepharose 4B或親和層析柱進行純化，純化后的重組免疫毒素再通過SDS-PAGE電泳和Western blot做進一步的鑒定分析。
(7)重組免疫毒素IL-18-PE38生物活性的測定重組免疫毒素IL-18-PE38生物活性的測定采用蛋白合成抑制試驗進行，即通過將ConA活化的T細胞接種子96孔細胞板培養(約5×104個細胞/孔)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培養基和系列稀釋的IL-18-PE38重組蛋白樣品10μl(對照組為IL-18受體陰性的無關細胞)，混勻后共同孵育20小時(37℃，5％CO2)，再加入H3亮氨酸(4.5μci/ml)10μl，4小時后收集細胞，于Beckman閃爍計數儀上測定放射活性，計算蛋白合成抑制百分率，以確定IL-18-PE38重組免疫毒素的生物活性。
權利要求
1.一種制備重組免疫毒素的質粒，其特征在于它具有附圖1所述的IL-18cDNA堿基序列和附圖2所述的綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38cDNA堿基序列連接而成。
2.一種高度特異性的重組免疫毒素，其特征在于該重組免疫毒素由權利要求1所述的質粒表達、純化形成，具有特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞的特性。
3.一種權利要求1所述的重組質粒的構建方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)將動物的IL-18基因用RT-PCR擴增，(2)將上述擴增的IL-18基因片段按TA克隆法實現與質粒載體重組，再轉染至感受態細菌中進行擴增，然后篩選出含有正確插入片段的克隆，(3)限制性內切酶酶切圖譜分析重組質粒，并進行DNA序列分析，以保證重組質粒中IL-18插入片段的正確性，(4)限制性內切酶分別消化正確序列的IL-18及PE38的質粒DNA，純化DNA片段，將IL-18和PE38片段連入質粒載體中，即構建成重組質粒，(5)用TNT體外翻譯試劑盒測定重組質粒的表達活性。
4.根據權利要求3所述的重組質粒的構建方法，其特征在于構建重組質粒可選用的質粒載體有pET27、PRKL459K、PGEX-2T。
5.一種權利要求2所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)權利要求1所述的重組質粒轉染的工程菌的制備，(2)免疫毒素的表達與純化。
6.根據權利要求5所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于(1)制備重組質粒轉染的工程菌的具體步驟A.制備感受態細菌，B.將權利要求1所述的重組質粒轉入感受態細菌的細胞中，C.通過蛋白合成抑制實驗測定工程菌的表達活性，(2)免疫毒素表達與純化的具體步驟A.將重組質粒轉染的工程菌接種于培養基中培養，B.收集高效表達的工程菌菌液并進行破菌處理，獲取免疫毒素的粗提物，C.用Glutahione Sepharose4B或親和層析柱對免疫毒素的粗提物進行純化處理，D.通過蛋白合成抑制實驗測定免疫毒素的表達活性。
7.根據權利要求6所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于蛋白合成抑制實驗測定免疫毒素的表達活性是通過將ConA活化的T細胞接種于細胞板培養，加入不含亮氨酸的RPMI1640培養基和系列稀釋的免疫毒素重組蛋白樣品，混勻后在37℃、5％CO2共同孵育16～20小時，再加入3～4.5μci/ml的H3亮氨酸，2～4小時后收集細胞，于Beckman閃爍計數儀上測定放射活性，計算蛋白合成抑制百分率。
8.根據權利要求6或7所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于制備重組質粒轉染的工程菌可選用的感受態細菌有E.coli.BL21、DH5α、JM109。
全文摘要
一種高度特異性的重組免疫毒素，以IL－18為導向分子、以綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38為毒素分子，通過基因重組構建而成。該免疫毒素的制備方法包括重組質粒的構建、重組質粒轉染的工程菌的制備、免疫毒素IL－18－PE38的表達與純化等步驟。該免疫毒素具有嚴格的靶向性，即通過IL－18的導向作用特異攻擊活化的TH1細胞，誘導特異性免疫耐受，從而避免了無選擇性地殺傷所有T細胞，特別適合于自身免疫性疾病和器官移植排斥反應的防治，亦可應用于某些腫瘤的治療。
文檔編號C12N15/31GK1431305SQ03117130
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月10日 優先權日2003年1月10日
發明者張 林, 李虹, 李明遠, 胡懷忠, 蔣忠華 申請人:四川大學