專利名稱：特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的pcr方法
技術領域：
本發明涉及一種大孢指疫霉菌(Sclerophthora macrospora)的檢測方法，具體涉及一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR(聚合酶鏈式反應)技術。
背景技術：
大孢指疫霉菌是指疫霉屬的一種真核菌，屬于卵菌綱，此綱的成員的有性階段產生卵孢子。此菌寄生于多種禾本科植物，易引起霜霉病。水稻受霜霉病危害之后心葉淡黃、 卷曲、不易抽出，下部老葉逐漸枯死，植株矮縮，不能抽穗或花器畸形，在局部地區造成嚴重損失。水稻霜霉病的診斷一般首先從癥狀上初步判斷，再用顯微鏡檢查病組織，如果檢查到病菌卵孢子即確定為陽性。但檢查到卵孢子時用藥防治為時已晚，即便植株可以抽穗， 也不能正常結實。而早期的癥狀不易與除草劑藥害和病毒病相區分。因此有必要建立一種早期檢測技術，對未鏡檢到卵孢子的疑似病株進行診斷。在植物病原物的檢測上，PCR是一種準確、高效、應用最廣的技術，但應用于大孢指疫霉菌的檢測方面，尚未見報道。
發明內容
本發明所要解決技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其依據大孢指疫霉菌已經報告的核糖體大亞基RNA 基因序列來設計特異性PCR引物，建立起PCR診斷技術體系，可檢測到多種禾本科植物如水稻、玉米等上的大孢指疫霉菌，解決水稻霜霉病早期檢測難的問題。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，該方法是以大孢指疫霉菌特異性引物對待測樣品進行PCR 擴增，最后電泳鑒定，該特異性引物為正向引物5，-AGAATGCAGCGCTAAGC-3，(如SEQ ID No 1 所示)(對應于EU擬6II9· 1的第加7-223個堿基)，反向引物5，-ATGCGCATCCACTCAGC-3，(如SEQ ID No 2 所示)(對應于 EU826119. 1 的第 629-613 個堿基)。詳述如下一、引物的設計發明人根據真核生物核糖體RNA基因堿基序列的特異性，從NCBI/GenBank搜索并下載大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖體大亞基RNA基因堿基序列(GenBank :EU826119. 1共 846個堿基)，只得到一條序列。依據此序列用primerBLAST工具設計特異性PCR引物序列如下正向引物5，-AGAATGCAGCGCTAAGC-3，(對應于EU擬6II9· 1的第加7-223個堿基)
反向引物5，-ATGCGCATCCACTCAGC-3，(對應于 EU826119. 1 的第 629-613 個堿基)；上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR產物預期大小為423個堿基。將正向引物和反向引物分別經BLAST檢索，見圖1和圖2。結果表明與正向引物序列和反向引物序列均100%覆蓋且堿基100%相同的只有EU擬6119. 1。二、病菌的PCR過程(以水稻來進行說明)DNA的提取按常規方法對疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株提取基因組DNA。用上述設計的引物對對提取的疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株總DNA進行擴增，預計擴增片段約為42!3bp。PCR 擴增體系 05 μ 1) :DNA 擴增模板 IylUOXPCR Buffer 2·5μ1、 dNTPs (IOmm) 0· 5 μ 1、Taq 酶(2· 5 μ / μ 1) 0· 5 μ 1、Forward Primer (IOmm) 1 μ 1、Reverse Primer(IOmm) 1 μ dd H2O 18. 5 μ 1。擴增條件預變性94°C 5min ；循環參數:94 V 30sec ；56°C 40sec ；72°C 40sec ；共 30個循環；72 °C IOmin延伸。三、PCR擴增產物的鑒定擴增產物經常規電泳并用凝膠成像系統檢查，結果出現的條帶與預期的大小相符，見圖3。PCR產物送由寶生物工程(大連)有限公司測序，測序結果經BLAST，只找到作為引物設計基礎的EU826119. 1，見圖4。本文中提及的PCR技術包含從PCR衍生的所有技術，如實時熒光PCR。與現有技術相比，本發明的優點是本方法使用的一對引物是根據大孢指疫霉菌 HUH 892菌系核糖體大亞基RNA基因設計的，使用此對引物做PCR檢測時，可檢測到禾本科植物上的大孢指疫霉菌，從而在水稻霜霉病和玉米瘋頂病發病早期將大孢指疫霉菌與它種病因區分開來，及早防治水稻霜霉病和玉米瘋頂病，本發明的引物對特異性高。
圖1是本發明正向引物的BLAST結果。圖2是本發明反向引物的BLAST結果。圖3是水稻植株PCR初步檢測電泳結果。從左至右的4條泳道依次是marker，疑似病株，檢測到卵孢子的病株，健康水稻。圖4是水稻霜霉病PCR產物序列BLAST。圖5是不同縣市水稻病株PCR檢測電泳結果。圖中，從左至右各泳道依次為隆回、邵陽、江永、會同、邵東、健康對照、marker、新邵、炎陵、雙峰、安化1、安化2、洪江1、洪江2。圖6是起初未鏡檢到卵孢子但PCR陽性的新邵縣水稻植株，后鏡檢到卵孢子。圖7是玉米PCR檢測電泳結果。圖中，從左至右各泳道分別為第1道為陰性對照1(未加DNA模板)；第2道為陰性對照2(健康玉米)；第3-5道為玉米病株；第6道為陰性對照3(水稻健株)；第7道為陽性對照(水稻病株)；第8道為marker。
圖8是用1個水稻霜霉菌系PCR產物序列做BLAST的結果，顯示了 8個PCR產物堿基序列遞交到GenBank后得到的登錄號。圖中“strain”表示菌系，7個水稻霜霉菌系名最后2個字母是SD，1個玉米瘋頂菌系名最后2個字母是YM。菌系HUH892為德國報告的大孢指疫霉菌菌系。
具體實施例方式實施例一水稻霜霉病株檢測用本發明的引物對對采自隆回、邵陽、江永、會同、邵東、新邵、炎陵、雙峰、安化、洪江的疑似感染水稻霜霉病的水稻植株做PCR檢測。電泳結果見圖5。結果表明病株均呈陽性，而健康對照為陰性。對其中未檢測到卵孢子且栽植成活的新邵縣病株每隔5天鏡檢一次，在病株心葉變黃白色時鏡檢到卵孢子，見圖6。選取上述PCR產物中7個電泳斑點較亮的PCR產物送寶生物工程(大連)有限公司測序，序列遞交 NCBI/GenBank，得到登錄號(HQ641401. 1，HQ641399. 1，HQ641402. 1， HQ641395. 1，HQ641398. 1，HQ641397. 1，HQ641394. 1)。圖 8 顯示用 HQ641401. 1 做 BLAST 得到的結果，證明上述登錄號的存在。實施例二玉米瘋頂病株檢測用本發明的引物對對采自湖南辰溪縣經鏡檢確認感染瘋頂病的玉米植株做了 PCR 檢測。電泳結果見圖7。結果表明，3個玉米病株標本和陽性對照(水稻病株)均呈陽性， 而3個陰性對照均為陰性。其中1個玉米瘋頂PCR產物送寶生物工程(大連)有限公司測序，序列遞交NCBI/GenBank，得到登錄號HQ641400. 1，見圖8。圖8顯示用1個水稻霜霉PCR產物做BLAST得到的序列排在前面的都是找到本專利引物PCR產物的序列和作為模板的德國大孢指疫霉菌序列，證明了 PCR產物與模板序列高度一致，證明實施例一和實施例二的PCR產物全為大孢指疫霉菌。由以上實施例可知，本發明的該對特異性引物對大孢指疫霉菌是特異的，采用該引物對大孢指疫霉菌引起的病害作PCR，可得到準確可靠的結果。
權利要求
1.一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其特征在于該方法是以大孢指疫霉菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定，該特異性引物為正向引物5 ’ -AGAATGCAGCGCTAAGC-3 ’， 反向引物5’ -ATGCGCATCCACTCAGC-3，。
2.如權利要求1所述的特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其特征在于所述特異性引物是根據大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖體大亞基RNA基因(GenBank EU826119. 1共846個堿基)的核苷酸序列設計的，PCR產物大小為423個堿基。
全文摘要
一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌(Sclerophthora macrospora)的PCR方法，是根據大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖體大亞基RNA基因(GenBankEU826119.1共846個堿基)的核苷酸序列設計的一對引物，BLAST結果表明這對引物的特異性非常好。用這對引物做PCR檢測時可準確地將禾本科植物上的大孢指疫霉菌檢測出來，從而及早防治水稻霜霉病。
文檔編號C12Q1/68GK102559900SQ20121001500
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者夏花, 高必達 申請人:湖南農業大學