專利名稱：將植物甾醇發酵制備雄二烯二酮的方法
技術領域：
本發明一般地涉及發酵方法，特別是從植物甾醇組合物到雄烯二酮和/或雄二烯二酮的生物轉化。
背景技術：
現在甾類藥物的制備存在兩條主要的途徑，其一是薯蕷皂甙元途徑，其二是微生物轉化途徑。薯蕷皂甙元是分離自菊科植物(薯蕷屬種)的螺酮縮醇類甾體甙元。在二十世紀四十年代的末期和五十年代的初期，主要利用化學反應發展該途徑用于制備甾類化合物的薯蕷皂甙元途徑
盡管該途徑對于甾類的商業化制備仍然重要，在二十世紀七十年代還是考慮了替代的方法。特別是由墨西哥政府提供的薯蕷皂甙元的價格顯著增長，而其原因部分歸咎于干植物量中薯蕷皂甙元含量的減少和勞動力成本的增加等等。因此，替代的方法對于將來AD的制備是必需的。
根據二十世紀六十年代和七十年代制藥工業的廣泛研究可知，很多微生物(如節桿菌屬，短桿菌屬，微桿菌屬，精朊桿菌屬，芽孢桿菌屬，諾卡氏菌屬，鏈霉菌屬和特別是分枝桿菌屬的那些)具有將3β-羥基-Δ5-甾醇(如膽甾醇，β-谷甾醇或α-谷甾醇)或甾醇的混合物(如下所述)自然降解為二氧化碳和水的固有能力，在降解中作為中間產物形成4-雄烯-3，17-二酮(雄烯二酮)和1，4-雄二烯-3，17-二酮(雄二烯二酮)。
作為底物用于微生物生物轉化的植物甾醇化合物。
β-谷甾醇菜油甾醇 豆甾烷醇菜油甾烷醇 菜子甾醇 α-谷甾醇植物甾醇現有的商業來源之一是植物來源的油類。從這些可用的甾醇到AD和ADD的微生物轉化為甾類藥物工業提供了非常重要的途徑。
ADD在各種合成甾類的生產中是一種基本的原料，所述合成甾類包括抗炎藥，口服避孕藥，合成腎上腺素甾類藥，促蛋白合成類藥(生長刺激)和其它合成的甾類。
一般而言，已知的發酵方法包括在適當的營養培養基中增殖分枝桿菌屬突變體，將培養物轉入含植物甾醇的生物反應器中，隨后經過大約120小時生物轉化為AD和/或ADD。收獲發酵肉湯，用有機溶劑對后者進行提取，隨后在有機溶劑中結晶，通常得到白色的結晶粉末狀產物AD和/或ADD。涉及討論已知方法和概述早先研究的參考如下S.Kraychy，和R.D.Muir，美國專利3,684,657(1972).
W.J.Marsheck，S.Kraychy和R.D.Muir，Appl.Microbiol.，23，72(1972).
A.H.Conner，M.Nagaoka，J.W.Rowe和D.Perlman，Appl.和Environ.Microbiol.，32，310(1976)。
K.Kieslich，J.Basic Microbiol.，25，461(1985)。
已知植物甾醇生物轉化方法中所存在的問題之一(該問題困擾了整個甾類工業)涉及在含水營養培養基中底物(在這里是植物甾醇組合物)的不充分溶解度。不充分的溶解度是指在營養培養基中底物僅以相對低的濃度存在，從而導致與微生物的接觸不充分并通常會導致最終產物的低收率。典型地需要長時間的發酵以達到任何令人滿意的生物轉化度。為提供一種得到AD和ADD并致力于解決底物溶解度問題的其它途徑，本申請人證明了來自林業可以以多公噸量獲得的″皂″的植物甾醇(-谷甾醇，菜油甾醇和豆甾烷醇)，能溶解和被分枝桿菌屬突變體定量地生物轉化為ADD(PCT/CA99/00267)。
已知植物甾醇生物轉化方法的另外一個問題是植物甾醇(或植物甾醇組合物)生物轉化的最終產物典型地含有顯著的AD和ADD。由于AD和ADD具有相似的化學結構，將這兩種甾類產物進行隨后的相互分離是困難和昂貴的。
因此，為了制備ADD，起始的發酵產物(AD)必須被提取，純化，隨后再進行第二次生物轉化以制備ADD。自然地，該方法由于涉及AD發酵的中斷，第二生物轉化之前AD的移取和純化，因而是昂貴并且費時的。
本發明的一個目的就是避免或減輕上述缺陷。
發明概述本發明的一個方面，提供了一種將植物甾醇組合物發酵以制備雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮或″AD″)和隨后的雄二烯二酮(androstadienedione)(雄-1，4-二烯，3，17-二酮或″ADD″)的方法，該方法包括在第一營養培養基中增殖分枝桿菌屬(Mycobacterium)的微生物培養物；將微生物培養物和植物甾醇組合物在生物反應器中放置足夠的時間以將組合物基本上轉化為雄烯二酮(″AD溶液″)；在第二營養培養基中增殖鐮孢屬(Fusarium)的真菌培養物；隨后將1)鐮孢屬物種；或2)含有鐮孢屬物種的真菌培養物培養基中的一種或多種注入生物反應器中足夠的時間以將AD溶液轉化為雄二烯二酮。
本發明進一步包括用雄烯二酮制備雄二烯二酮的方法，該方法包括在1)鐮孢屬物種；或2)鐮孢屬物種真菌培養物培養基存在的情況下，在生物反應器中將AD發酵足夠的時間，從而將AD轉化為ADD。
本發明進一步包括通過上述提及的方法制備的ADD組合物。
本發明所述方法的重要和顯著的優點是，使用鐮孢屬物種的AD到ADD的生物轉化與先前的細菌轉化在相同的生物反應器中發生，即與從植物甾醇組合物制備AD所用的為同一個生物反應器。換言之，起始發酵步驟中所制得的AD不需要從生物反應器中移出(作為本領域中已知和常規的手段)，反而，為了將AD溶液轉化為ADD，將1)真菌培養物，或2)真菌培養物培養基接種入生物反應器中(詳細描述如下)。令人驚訝的是，現已發現盡管有殘留細菌培養物的存在，鐮孢屬物種和特別是如下文所述的優選的菌株仍然保持將AD轉化為ADD的能力。因此，本發明的方法不涉及起始AD發酵的中斷，或第二生物轉化之前AD的移出和純化。顯著地節約了時間，能量和材料。
本發明還提供了一種鐮孢屬的新微生物，下文中以PTA-3947或FMI 33表示，其在2001年12月21日以茄病鐮孢(Fusarium solani)FMI33保藏在ATCC。
本發明通過以下非限制性附圖進行解釋附圖1圖示了根據本發明從植物甾醇到ADD的微生物轉化；和附圖2是一個流程圖，顯示了根據本發明使用茄病鐮孢從AD到ADD的生物轉化的優選程序。
發明詳述以下的詳細說明幫助本領域技術人員實施本發明。然而，此詳細說明并不解釋為對本發明范圍的過度限制。本領域普通技術人員可以對在此討論的實施例進行修飾和變化而不背離本發明范圍的精神。
在本發明的第一步，在營養培養基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養物。本領域中有許多已知和可用的適宜培養基和條件，本發明并不限制于其中的任何一個。但是，在優選方式中，分枝桿菌種在含有精制廠的糖蜜(refiner’s molasses)，硝酸鈉，磷酸銨和葡萄糖的種子培養基中生長。在Kutney等的美國專利6,071,714一文中描述了適當的培養基，在此被引入作為參考。
一般地，用于分枝桿菌屬種和鐮孢屬物種培養的營養培養基中應該含有可同化的氮和碳，并在其中維持足夠補給量的無菌空氣，例如通過將培養基的大表面暴露于空氣中或使充足量的空氣通過培養基以支持深層生長。
適宜氮源是通常用于此目的的那些，包括大豆粉，棉籽粉，酪蛋白的胰酶消化物，魚粉，玉米漿，肉膏，蛋白質，帶有奶固形物的自溶啤酒酵母，蛋白胨，酵母膏，水解酪蛋白，硝酸鹽和/或銨類化合物。其中的大部分也能被用作碳源。其它含有碳的物質包括碳水化合物如甘油，葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，肌醇，糊精，糖蜜，淀粉和乳清。可以有利的使用這些碳源和氮源的結合。
如果需要，可以加入磷酸鹽，鎂和/或亞鐵離子作為促生長因子；還可加入緩沖液以確保生長在基本中性的pH開始。消泡劑可能是有益的。當用于誘導發酵的是分離的細胞或酶而不是完整和生長的微生物時，不需要營養物質的存在；但是無論是何種情形，培養基通常主要為含水的。
在本發明的第二步，將溶解于適宜溶劑中的或乳化形式的底物(植物甾醇組合物)和微生物培養物一起加入生物反應器中。進行發酵直到達到最大底物轉化(植物甾醇轉化為AD溶液)。
只要能促進植物甾醇底物在溶劑中混合，從而最優化微生物培養物對底物的利用率，可以使用任何乳化劑。例子包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商業可得的名為TeginTM，TweenTM和SpanTM的那些。
或者，可以使用增溶劑溶解植物甾醇組合物以形成澄清溶液，從而提供與在生物轉化中所用微生物良好的接觸。所選的適宜的增溶劑包括二醇(glycol)家族的成員和硅氧烷家族的成員，它們能使高濃度的植物甾醇被溶解于營養培養基中。這將使得與微生物良好接觸，減少發酵時間，并得到最終產物的相對高收率。優選先前已知的增溶劑例如向日葵油。
在本發明的第三步，在第二營養培養基中增殖鐮孢屬的真菌培養物。如上所述，本領域中有許多已知和可用的適宜培養基和條件，本發明并不限制于其中的任何一個。但是，在優選方式中，鐮孢屬物種在含有玉米漿和葡萄糖的種子培養基中生長。
在本發明的第四步，將1)鐮孢或2)真菌培養物培養基(包含真菌酶)中的一種或多種注入含有AD溶液的生物反應器中，以將AD溶液轉化為ADD。在優選的實施方案中，在注入之前對生物反應器進行滅菌以殺滅細菌(例如在120℃左右加熱)。
進行″注入″步驟最簡單和經濟的方法是將真菌培養物培養基中的一些接種到已滅菌的生物反應器中。或者，在另一方面，從培養基中分離真菌細胞(例如通過離心分離)并且僅僅注射這些細胞也是可能的。而且，為了促進存在的酶的接近，這些細胞能被超聲或以其它方式破裂，再通過過濾分離或用溶劑如丙酮和水提取酶，隨后取代培養基或真菌細胞被注入生物反應器中。
兩個″階段″(植物甾醇到AD；AD到ADD)中各自的最佳底物濃度，底物添加時間和發酵期依賴于所用微生物的類型和確切的發酵條件。確切的條件對于本領域技術人員而言，不需要過度的實驗就能容易地確定。
在本發明最優選的方式中，通過使用分枝桿菌屬MB 3683完成從植物甾醇組合物到AD的生物轉化。本發明最優選的方式中，通過使用茄病鐮孢或尖孢鐮孢(Fusarium oxysporium)中的一個完成從AD到ADD的生物轉化。
本發明的一個實施方案中，使用亞硝基胍對茄病鐮孢進行突變制得新的突變體，所述新突變體對于在甾類轉化為AD所用的相同反應器中進行AD到ADD的轉化尤其有效，即該轉化不需要從第一發酵步驟中分離AD。所述突變體微生物已經保藏在美國典型培養物保藏中心(″ATCC″)(10801 University Blvd.，Manassas VA，USA，20110-2209)中，專利保藏號為PTA-3947，其以永久保藏的方式保藏。該微生物的傳代培養物在請求時是可獲得的，然而，要了解所述可獲得并不構成許可實施本發明。
附圖1簡略地列出了本發明的一個實施方案中微生物和真菌的發酵步驟，其中植物甾醇使用分枝桿菌種轉化為AD以及隨后AD使用鐮孢屬物種轉化為ADD和勃地酮(boldenone)。
附圖2圖示了本發明進一步的實施方案，其中ADD直接從AD來源制備。增殖鐮孢屬物種培養物，在發酵條件下將接種物加入含有AD的容器中。在此之后，分離和純化ADD。
植物甾醇/植物烷醇在此使用的術語″植物甾醇組合物″包括所有的甾醇并且沒有限制，例如谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇(包括二氫菜籽甾醇)，鏈甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿貝海綿甾醇，麥角甾醇，糞甾醇，科迪甾醇(codisterol)，異巖藻甾醇(isofucosterol)，巖藻甾醇，桐甾醇，神經甾醇(nervisterol)，7-烯膽甾烷醇，星魚甾醇，菠菜甾醇，chondrillasterol，peposterol，燕麥甾醇，異燕麥甾醇，fecosterol，pollinastasterol，膽甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構體。并且包括它們所有的氫化對應物(″植物甾烷醇(phytostanols)″)。植物甾烷醇包括所有飽和或氫化的植物甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構體。當在說明書全文中存在疑問時，需要了解的是術語“植物甾醇組合物”可包含植物甾醇和植物甾烷醇兩者。
用于本發明生物轉化的甾醇和甾烷醇(stanols)可以通過許多種天然來源獲得。例如，它們可以從植物油(包括水生植物)的加工中獲得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麥胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，向日葵油，芝麻油和魚(以及其它水產來源)油。它們也可以衍生自真菌，例如麥角甾醇。因此，本發明并不限于甾醇的任何一個來源。美國專利4,420,427中教導了使用溶劑如甲醇從植物油渣中制備甾醇。或者，植物甾醇和植物甾烷醇可以來自林業加工副產品妥爾油樹脂(tall oil pitch)或制漿皂(pulping soap)，如美國專利5,770,749中所述，在此引入作為參考。
在發酵方法中，優選溫度維持在大約30-37℃的范圍內，更優選25-35℃。發酵期間pH的檢測顯示pH能在起始時大約7.0到收獲時大約4.7的范圍內變化。發酵或轉化過程一旦完成，即用本領域已知和常規的方法回收ADD。
以下的實施例代表實驗室試驗。然而，每個都能使用已知的工業技術擴展用于工業規模的應用以實施本發明。
實施例1使用分枝桿菌種和茄病鐮孢將植物甾醇生物轉化為ADD使用分枝桿菌種進行的生物轉化(第1階段)制備分枝桿菌種的種子培養物在液體培養基中制備用于生物轉化的接種物。從瓊脂斜面(在玻璃試管中培養)接種錐形瓶。對于不超過40L的工作體積，使用每個含200mL種子培養基的1L錐形瓶，而對于50L和更大體積，使用每個含400mL培養基的2L錐形瓶。在無菌條件下進行接種(在防生物危害罩中)。移取無菌水(5mL)到瓊脂斜面上。用移液管末端輕輕刮下細菌培養物。然后移取該混懸培養物并放入錐形瓶中。在旋轉振蕩器上進行細菌增殖(200rpm，1″throw，30℃室溫)。在培養72小時后，此種子培養物即可轉移至生物反應器中。在接種前對種子培養物長期儲存是不可取的。
種子培養方案概述如下培養基種子培養基(每L)54mL Refiners糖蜜(BC糖)5.4g NaNO30.6g NH4H2PO46.0g 葡萄糖調pH至7.0培養基量200mL/燒瓶接種物量每200ml新培養基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000mL錐形瓶攪拌振蕩器(1″throw)，200rpm溫度30℃生長時間72小時培養注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養物生長。
制備用于使用分枝桿菌種的3L實驗的生物轉化培養基該培養基制備過程僅僅用于3L工作體積的實驗。在大規模生產中，過程如下所述。
生物轉化培養基的組成如下培養基生物轉化培養基(以3L培養基計)162mL無菌糖蜜(BC糖)(5.4％v/v)16.2g NaNO3(0.54％)1.8g NH4H2PO4(0.06％)底物30.0g植物甾醇(1.0％)乳化劑480mL向日葵油(16％)在使用前一天，必需量的Refiners糖蜜(162mL)與水(300mL)混合并在錐形瓶中滅菌(121℃持續20分鐘)。
在燒瓶或燒杯中混合水(2.0L)和培養基組分(除植物甾醇和向日葵油以外)。用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)調培養基的pH值至8.1，將培養基轉移至生物反應器中，隨后加熱至60-70℃。
在燒杯中稱重植物甾醇(30g)，加入向日葵油(480mL)，在熱板上邊加熱邊攪拌混合物，直至油變澄清。這時通常在～120℃。將油中澄清的黃色植物甾醇溶液倒入生物反應器中已加熱的液體培養基中(60-70℃)，無需攪拌。
將發酵罐滅菌(121℃持續30分鐘)，然后冷卻至30℃。
上述培養基制備的過程僅僅適用于3L的工作體積。
注解生物轉化培養基具有7％的干燥物質(折射測量)。
制備用于使用分枝桿菌種的大規模實驗的生物轉化培養基該培養基的制備過程用于40L和更大的工作體積。
表1.制造商提供的植物甾醇組合物
培養基組成如下培養基生物轉化培養基(以每升培養基計)54mL無菌糖蜜(BC糖)(5.4％v/v)5.4g NaNO3(0.54％)0.6g NH4H2PO4(0.06％)底物 10.0g植物甾醇 (1.0％)乳化劑160mL向日葵油 (16％)
在使用前一天，必需量的Refiners糖蜜(54mL/L培養基)與水(100mL/L培養基)混合并滅菌。
發酵罐中在攪拌下混合所有組分(包括必需量的水，但不包括植物甾醇和向日葵油)，以獲得一種澄清溶液。水的必需量通過從所需最終體積中減去糖蜜、油和接種物的量而得。用NaOH水溶液(20％)調培養基的pH值至8.L在培養基中加入植物甾醇和向日葵油，并滅菌發酵罐(121℃，30-60分鐘)。
注解生物轉化培養基具有7％的干燥物質(折射測量)。
在發酵罐中使用分枝桿菌進行的生物轉化在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發酵罐中進行生物轉化實驗。所用發酵罐的主要參數列于表2中。將發酵罐中培養基的溫度調至30℃，在無菌條件下加入接種物。整個過程在30℃進行。從此階段開始到最后都監測該過程的pH值和無菌度。40小時以后開始監測底物(植物甾醇)和產物(AD)。詳細的分析過程(HPLC，GC)和結果在下面給出。此過程中生物轉化混合物的pH值通常在1 pH單位內變化并未校正。當泡沫層中的產物(AD)濃度達到最大或當底物(植物甾醇)濃度達其起始濃度的1/20時，被認為已經完成生物轉化。
表2.用分枝桿菌種進行植物甾醇發酵的參數
注意事項為了與微生物最大化接觸，必須伴有高效的攪拌。通常來說，″泡沫牛奶(milk-shake)″外觀表征為良好的乳化。
形態學觀察(使用光學顯微鏡進行的研究)
在每階段(從瓊脂斜面到最終的收獲)，細胞的形態維持不變，也就是說，細胞具有兩極細胞核并且是桿狀的。
使用茄病鐮孢進行的生物轉化(第2階段)制備茄病鐮孢的種子培養物在液體培養基(10g/L玉米漿，10g/L葡萄糖，pH 6.5)中增殖真菌培養物茄病鐮孢。從在燕麥粉瓊脂上在30℃生長了120小時的培養物接種錐形瓶(1L體積，0.2L培養基)。在旋轉振蕩器(26℃，120rpm，1″throw)中增殖液體培養基培養物72小時。
也可以將鐮孢從液體到液體培養基傳代培養，直至4-5代或直到下一個培養物變為粉紅色。
搖瓶接種物在4℃下儲存不超過1個月，其活性不會發生顯著的變化。
使用茄病鐮孢的生物轉化的制備使用從第一階段得到的全部生物轉化肉湯進行生物轉化的第二階段。
在完成植物甾醇到AD的轉化之后(2.3.1.4部分)，將必需的組分(10g/L葡萄糖，10g/L玉米漿)加入第一階段所得的肉湯中，并用HCl水溶液(4％)調pH至6.7。滅菌肉湯(121℃，30min)，隨后將溫度調至30℃。
使用第一階段所得的肉湯和茄病鐮孢將AD生物轉化為ADD生物轉化實驗在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發酵罐中進行。所用發酵罐的主要參數列于表3中。將發酵罐中培養基的溫度調至30℃并在無菌條件下加入接種物。
表3.用茄病鐮孢進行植物甾醇發酵的參數
整個過程在30℃進行。從該階段開始到最后監測過程的pH值和無菌度。15小時以后開始監測底物(AD)和產物(ADD)。詳細的分析過程(HPLC，GC)在4.1部分中給出。過程的監測結果在4.2部分中給出。在此過程中生物轉化混合物的pH值通常在1pH單位內變化并未校正。當泡沫層中的產物(ADD)濃度達到最大或當底物(AD)濃度達其起始濃度的1/20時，被認為已經完成生物轉化。
該過程通過滅菌結束(121℃，30min)。
實施例2使用茄病鐮孢將AD生物轉化為ADD的一階段法制備茄病鐮孢的種子培養物在液體培養基(10g/L玉米漿，10g/L葡萄糖，pH6.5)中增殖真菌培養物茄病鐮孢。從在燕麥粉瓊脂上在30℃生長了120小時的培養物接種錐形瓶(1L體積，0.2L培養基)。在旋轉振蕩器(26℃，120rpm，1″throw)中增殖液體培養基培養物72小時。
鐮孢也可以從液體到液體培養基傳代培養，直至4-5代或直到下一個培養物變為粉紅色。
搖瓶接種物在4℃下儲存不超過1個月，其活性不會發生顯著的變化。
用于茄病鐮孢的生物轉化培養基的制備該方法使用已分離的AD進行。
生物轉化培養基的組成如下
培養基生物轉化培養基(用于3L培養基)30g葡萄糖 (10％)30mL 玉米漿 (10％v/v)底物 30.0g AD(1.0％)乳化劑480mL 向日葵油 (16％)燒瓶或燒杯中混合水(2.5L)和培養基組分(除AD和向日葵油以外)。用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)調培養基的pH值至6.5，將培養基轉移至生物反應器中，隨后加熱至60-70℃。
燒杯中稱重AD(30g)，加入向日葵油(480mL)，在熱板上邊加熱邊攪拌混合物，直至油變澄清。將油中澄清的黃色AD溶液倒入生物反應器中已經加熱的液體培養基中(60-70℃)，無需攪拌。
滅菌發酵罐(121℃持續30分鐘)，然后冷卻至30℃。
不銹鋼發酵罐中AD到ADD的生物轉化在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發酵罐中進行生物轉化實驗。所用發酵罐的主要參數列于表4中。將發酵罐中培養基的溫度調至30℃，在無菌條件下加入接種物。整個過程在30℃進行。從此階段開始到最后監測過程的pH值和無菌度。15小時以后開始監測底物(AD)和產物(ADD)。詳細的分析過程(HPLC，GC)和結果在下面給出。此過程中生物轉化混合物的pH值通常在1pH單位內變化并未校正。當泡沫層中的產物(ADD)濃度達到最大或當底物(AD)濃度達其起始濃度的1/20時，被認為已經完成生物轉化。
該過程通過滅菌結束(121℃，30min)。
表4.用茄病鐮孢進行植物甾醇發酵的參數
實施例3發酵肉湯的提取收獲發酵肉湯到分液漏斗中。在肉湯中加入乙酸乙酯(6.0L)并振蕩2-3分鐘。15分鐘后該混合物分為兩層(乙酸乙酯上層和含水底層)。移去乙酸乙酯層并將其轉入其它的容器中。用第二份乙酸乙酯(4.0L)萃取含水底層，移去上層(乙酸乙酯)并將其與第一份乙酸乙酯萃取物合并。將合并的乙酸乙酯萃取物在旋轉蒸發器上濃縮形成一種紅色粘稠的油(～450ml)，其用于進一步的純化。
每份乙酸乙酯萃取物和含水殘留物通過HPLC進行甾類分析。兩階段法的結果列于表5中，一階段法的結果列于表6中。
從油中分配ADD將己烷(1.25L)與油性殘留物(～450ml)很好的混合。用甲醇(2.0L×2)萃取油-己烷溶液。將這兩份甲醇萃取物進行合并并蒸發直至干燥形成淺褐色油性殘留物。真空干燥殘留物。己烷和甲醇層各個均進行HPLC分析，以控制分配的完成。
A)從植物甾醇發酵為ADD的兩階段發酵物將ADD結晶第一次結晶在一些實驗中甲醇蒸發后的殘留物被真空干燥。如果這樣的話，殘留物(～40-50g，ADD含量17-18g，HPLC測得的純度為30-40％)溶于乙酸乙酯(100ml)中。
如果甲醇蒸發后的殘留物不進行真空干燥，隨后將殘留物溶于乙酸乙酯(250ml)中，用Na2SO4干燥并濃縮至較小體積(100ml)。
加入活性炭(4.0g)并將混合物回流1小時。冷卻后，在燒結玻璃漏斗上過濾混合物，并用乙酸乙酯洗滌過濾物。或者，通過硅藻土墊(Celite pad)過濾溶液并用乙酸乙酯洗滌。將濾液在旋轉蒸發器上濃縮直至干燥。加入己烷(200ml)，混合物回流攪拌20分鐘，冷卻至室溫并放置30分鐘以分離。將上層己烷轉入另一個容器中并放置過夜用于結晶。從己烷溶液過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(0.23g)。將粘性油溶于乙酸乙酯(8ml)中并加熱攪拌10分鐘。將溶液冷卻至室溫并放置過夜。過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(2.51g)。將晶體和母液進行HPLC分析。
第二次結晶將第一次結晶后留下的母液在旋轉蒸發器上濃縮。加入乙酸乙酯(4ml)，混合物回流攪拌10分鐘，冷卻至室溫并放置過夜用以結晶。過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(1.25g)。將產物和母液進行HPLC分析。
表5.來自兩階段法的產物(ADD)的萃取和分配結果
第三次結晶將第二次結晶后留下的母液在旋轉蒸發器上濃縮。乙酸乙酯(2ml)和己烷(1mL)混合物回流攪拌10分鐘，冷卻至室溫并放置過夜用以結晶。過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(0.16g)。將產物和母液進行HPLC分析。
結晶的ADD的總量為4.25g。
B)從AD發酵為ADD的一階段發酵物分離ADD第一次結晶如果將甲醇蒸發后的殘留物真空干燥，殘留物(～40-50g，ADD含量17-18g，HPLC測得的純度為30-40％)溶于乙酸乙酯(150ml)中。
如果甲醇蒸發后的殘留物不真空干燥，隨后將殘留物溶于乙酸乙酯(250ml)中，用Na2SO4干燥并濃縮至較小體積(150ml)。
加入活性炭(4.0g)并將混合物回流1小時。冷卻后，在燒結玻璃漏斗上過濾混合物，并用乙酸乙酯洗滌過濾物。或者，通過硅藻土墊(Celite pad)過濾溶液。將濾液在旋轉蒸發器上濃縮直至干燥，然后邊加熱邊將殘留物溶于乙酸乙酯(6ml)中，并冷卻至室溫用以結晶。在放置過夜后，過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體。將晶體和母液進行HPLC分析。
第二次結晶將第一次結晶后留下的母液在旋轉蒸發器上濃縮。加入己烷(50ml)，混合物回流攪拌1小時，冷卻至室溫并放置30分鐘用以分離。上層己烷被轉入另外一個容器中并放置過夜用以結晶。粘性油與乙酸乙酯(2ml)、己烷(1ml)混合，邊加熱邊攪拌10分鐘。溶液冷卻至室溫并放置過夜。過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體。該己烷層也產生了一部分的ADD晶體。將晶體和母液進行HPLC分析。
第三次結晶將第二次結晶后的母液在旋轉蒸發器上濃縮。粘性油與乙酸乙酯(1ml)、己烷(3ml)混合，邊加熱邊攪拌10分鐘。冷卻后，溶液放置過夜以結晶。過濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成ADD晶體。將晶體和母液進行HPLC分析。
ADD結晶的結果列于表6中表6.來自一階段法的ADD的萃取，分配和結晶結果
實施例5定性(TLC)和定量(HPLC和GC)分析TLC定性分析從發酵罐底部取肉湯樣品(每份大約40mL)。用乙酸乙酯(0.5mL)提取肉湯樣品(0.5mL)。在硅膠預涂布板(60F254，厚0.2mm)上對0.050mL乙酸乙酯萃取物進行TLC分析。所用流動相為己烷/乙酸乙酯＝3∶1；氯仿/丙酮＝3∶1，或二氯甲烷/丙酮＝9∶1。板展開后，使用下列噴霧(或浸漬)試劑之一。
Cerrium試劑含有(以100mL計)水(94mL)，硫酸鈰(IV)(1.0g)，磷鉬酸水合物(2.5g)，硫酸(6ml)。這些組分以所列順序溶解。該試劑能保存一年以上。
鉬酸鹽試劑含有(以100mL計)水(90mL)，鉬酸銨(ammoniummolibdate)(10.85g)，硫酸(6ml))。這些組分以所列順序溶解。該試劑能保存一年以上。
隨后將板在150℃加熱3分鐘。最終的藍斑表明了下述化合物的存在(己烷/乙酸乙酯＝3/1)Rf＝0.75-向日葵油；Rf＝0.53-植物甾醇；Rf＝0.47-雄烯二酮(AD)；和Rf＝0.02-雄二烯二酮(ADD)。
AD，ADD和副產物的HPLC監測樣品(2g泡沫或2mL液體或10mg晶體)用甲醇稀釋至50.0mL，很好的混合并放置10分鐘以沉淀蛋白和植物甾醇。過濾溶液的等分試樣(Millipore過濾器HV型0.45μm)。使用徑向填充柱(固定相C185μm，4×100mm，Waters)進行HPLC分析。
流動相水/甲醇＝4∶6(恒溶劑的)，流速1ml/min，在280nm檢測。
AD的標準曲線(mg)＝(8.39×面積+2033)×10-5；其中面積范圍為0到30000。
ADD的標準曲線(mg)＝(7.43×面積+72.22)×10-4；其中面積范圍為0到100000。
標準曲線根據雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)純樣品測定結果繪制。產物的保留時間如下化合物 保留時間(min)AD 8.73ADD 13.20底物和產物的GC監測在容量瓶中，將樣品(50mg晶體)溶于乙酸乙酯中并稀釋至50.0mL。或者，用50mL乙酸乙酯萃取2mL生物轉化混合物。然后乙酸乙酯溶液用于植物甾醇、AD和ADD的GC分析。
條件SAC-5柱，烘箱溫度278℃，注射溫度300℃，檢測器FID。
產物的保留時間如下化合物 保留時間(min)AD8.06ADD 9.21菜籽甾醇 20.53菜油甾醇 23.20菜油甾烷醇(campestanol) 23.66豆甾醇24.70β-谷甾醇 27.71谷甾烷醇(豆甾烷醇)28.27植物甾醇和AD生物轉化為ADD的結果表7.兩階段生物轉化法的監測概述
表8.兩階段生物轉化法的監測概述
實施例6新突變體茄病鐮孢FMI33的鑒定采用方法產生大亞基(LSU)rRNA基因序列數據。從分離自FMI33真菌菌落的基因組DNA，PCR擴增始于3344位的LSU rRNA基因的大約300個堿基對。使用Microcon100分子量濾膜(Amicon)從過量的引物和dNTPs中純化擴增產物，并通過將部分產物在瓊脂糖膠上跑膠來檢測其質量和數量。
使用AmpliTaq FS DNA聚合酶和dRhodamine染料終止劑進行LSU rRNA擴增產物的循環測序。使用Sephadex G-50離心柱除去序列測定反應中過量的染料標記的終止劑。通過離心分離收集產物，真空干燥并冷凍在-20℃直至用于加樣。將樣品再懸浮于甲酰胺/藍葡聚糖/EDTA溶液中，并在加樣前進行變性。樣品在ABI Prism 377 DNA序列測定儀上進行電泳。使用PE/應用生物系統DNA編輯和裝配軟件進行數據分析。
使用微生物分析軟件對樣品FMI 33和MicroSeq數據庫(MicroSeq database)中的其它微生物進行比較。發現FMI 33與下一個最接近的對比物，茄病鐮孢，具有0.94％的遺傳圖距，這表明FMI33是一個獨立的真菌突變體。
FMI 33的序列數據AGACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCTTGGTTGATCATCCGGGGTTCTCCCCGGTGCACTCTTCCGGCCAGGCCAGCATCAGTTCGCCCTGGGGGACAAAGGCATCGGGAACGTGGCTCTCTCCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAATACCCTGCGGCGGACTGAGGTTCGCGCATTCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAG
序列表序列表<110>Forbes Modi-Tech Inc.
<120>將植物甾醇發酵制備雄二烯二酮的方法<130>Forb-ADD-PCT<140>PCT/CA03/00131<141>2003-02-03<150>10/066395<151>2002-02-01<160>1<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>319<212>DNA<213>鐮孢屬<400>1agaccgatag cgaacaagta gagtgatcga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtta 60aacagtacgt gaaattgttg aaagggaaga gcttgtgacc agacttggga ttggttgatc 120atccggggtt ctccccggtg cactcttccg gccaggccag catcagttcg ccctggggga 180caaaggcatc gggaacgtgg ctctctccgg ggagtgttat agcccgttgc gtaataccct 240gcggcggact gaggttcgcg cattcgcaag gatgctggcg taatggtcat cagtgacccg 300tcttgaaaca cggaccaag 319
權利要求
1.將植物甾醇組合物發酵以制備雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮)和隨后制備雄二烯二酮(雄-1，4-二烯，3，17-二酮)的方法，其中包括在第一營養培養基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養物；將微生物培養物和植物甾醇組合物在生物反應器中放置足夠的時間以將該組合物基本上轉化為雄烯二酮(″AD溶液″)；在第二營養培養基中增殖鐮孢屬的真菌培養物；將1)鐮孢屬物種和2)真菌培養物培養基中的一種或多種注入生物反應器中足夠的時間以將AD溶液轉化為雄二烯二酮。
2.權利要求1所述的方法，其中真菌培養物是茄病鐮孢。
3.權利要求1所述的方法，其中真菌培養物是尖孢鐮孢。
4.權利要求1所述的方法，其中的微生物培養物是分枝桿菌MB3683。
5.權利要求1的方法，其中的真菌培養物是茄病鐮孢FMI33，以PTA-3947保藏在ATCC。
6.權利要求1所述的方法，其中植物甾醇組合物來自妥爾油樹脂或制漿皂。
7.權利要求1的所述的方法，其中植物甾醇組合物來自適宜的經選擇的植物油。
8.權利要求7所述的方法，其中植物油選自大豆，菜籽，玉米，棉籽，向日葵，橄欖，亞麻籽或米糠。
9.權利要求1所述的方法，其中植物甾醇組合物包括下述中的一種或多種谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇，鏈甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿貝海綿甾醇，以及它們所有的氫化對應物和所有天然或合成形式和衍生物，包括異構體。
10.權利要求1所述的方法，其中第一營養培養基包含Refiners糖蜜和無機鹽。
11.權利要求1所述的方法，其中第二營養培養基包括葡萄糖和玉米漿。
12.權利要求1所述的方法，其中發酵在有氧條件下進行。
13.權利要求1所述的方法，其中使用增溶劑將植物甾醇組合物溶于溶液中并隨后加至生物反應器中。
14.權利要求13所述的方法，其中增溶劑是二醇家族中的成員。
15.權利要求13所述的方法，其中增溶劑是聚丙二醇。
16.權利要求13所述的方法，其中增溶劑是硅氧烷家族中的成員。
17.權利要求1所述的方法，其中生物反應器在注入1)真菌培養物或2)真菌培養物培養基之前經過滅菌以及隨后的冷卻。
18.一種用雄烯二酮(AD)制備雄二烯二酮(ADD)的方法，包括在1)鐮孢屬物種、2)由此得來的酶或3)鐮孢屬物種真菌培養物培養基存在的情況下，在生物反應器中將AD發酵足夠的時間以將AD轉化為ADD。
19.權利要求18所述的方法，其中鐮孢屬物種是以PTA-3947保藏在ATCC的茄病鐮孢FMI33。
20.以PTA-3947保藏在ATCC的茄病鐮孢FMI33。
21.含有通過權利要求1所述方法制備的ADD的組合物。
22.含有通過權利要求18所述方法制備的ADD的組合物。
全文摘要
將植物甾醇組合物發酵以制備雄烯二酮(雄－4－烯－3，17－二酮)和隨后的雄二烯二酮(雄－1，4－二烯，3，17－二酮)的方法，其包括在第一營養培養基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養物；將微生物培養物和植物甾醇組合物在生物反應器中放置足夠的時間以將組合物基本上轉化為雄烯二酮(“AD溶液”)；在第二營養培養基中增殖鐮孢屬的真菌培養物；將1)鐮孢屬物種或2)真菌培養物培養基中的一種或多種注入生物反應器中，反應足夠的時間以將AD溶液轉化為雄二烯二酮。
文檔編號C12P33/00GK1639354SQ03804973
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月3日 優先權日2002年2月1日
發明者J·P·庫特尼, E·J·赫靈頓, G·斯帕索夫 申請人:阿克佐諾貝爾公司