產生靈長類動物滋養層的方法

專利名稱：產生靈長類動物滋養層的方法
相關申請的參照此專利申請要求提交于2002年3月15日的美國臨時專利申請號60/365,136的權利。
關于聯邦政府贊助研究或發展的聲明無。
背景技術：
現代細胞生物包括多種體外操作不同活生物體細胞的技術。特別感興趣的是一類稱為干細胞的細胞。干細胞是未分化或僅部分分化的細胞，能分化成一些祖細胞和成熟細胞系和類型。術語“干細胞”可用于指一種細胞類型，它是較大生物體中分化細胞系的祖細胞如造血干細胞，或可指完全未分化干細胞，它們至少在理論上能分化成任何身體組織。干細胞最少是多能性的，意味著它們有分化成許多不同組織細胞的潛能，且可以是全能性的，意味著有分化成任何成熟生物種類的細胞類型的潛能。干細胞培養物發展自多種組織類型和一些不同動物。
近來，能產生、培養和維持靈長類動物胚胎干細胞的培養物，包括人和恒河猴胚胎干細胞。參見例如Thomson的美國專利號5,843,780、6,200,806。靈長類動物胚胎干細胞是產生自胚胎的干培養物，在培養中存活不確定且證明能分化成靈長類動物身體的主要組織類型。靈長類動物胚胎干細胞可在培養中以未分化狀態不確定維持，或可開始分化過程，通過此過程不同細胞定向成為一種或多種發育譜系(developmental lineage)。通常，干細胞分化成不同組織類型是以胚狀體產生為開始，這使胚胎體中的干細胞開始分化成不同細胞類型。
具有科學和研究興趣的更加分化的人細胞類型是人滋養層。滋養層是一種細胞，它是參與人胎盤形成的細胞前體。當胚胎開始分化時，在胚泡階段，內細胞群中的細胞定向形成變為胚胎的細胞，而胚泡的外部細胞定向參與胎盤發育。以前分離過滋養層細胞，但它們難以分離且不能大量用于研究。小鼠滋養層細胞系產生自胚泡和移植后滋養層。人滋養層細胞系產生自轉化的胎盤細胞，但還未報導從胚細胞或干細胞系生成靈長類動物滋養層培養物的技術。人胚胎干細胞會同時分化成一些分化細胞類型，包括一些滋養層細胞，此現象不導致有用的滋養層細胞培養物產生。事實上，小鼠胚胎干細胞似乎缺乏分化成滋養層的能力，因此，滋養層供應總是很有限。恒定滋養層細胞的可補充供應對許多藥物研究很有用。針對胚胎移植的避孕藥物研究和防止胎盤相關出生缺陷的治療仍是科學研究的主題，如果有靈長類動物滋養層來源，能更容易研究。
發明概述本發明概括了誘導靈長類動物干細胞主要分化成人滋養層的方法，包括在蛋白滋養層誘導因子存在時培養靈長類動物干細胞的步驟。
本發明也涉及由本文所教授方法產生的靈長類動物滋養層細胞統一培養物。
本發明同樣涉及在胎盤細胞上測試試劑的方法，其中試劑暴露于本文所述滋養層培養物。
本發明的一個目標是以一致和可重復方式產生幾乎純的滋養層培養物。
本發明的一個特征是教授了第一種已知引起培養的靈長類動物干細胞重復、直接、單獨和同步分化成定向細胞系的方法。
本發明的其它目標、特征和優勢從下列說明中顯然。
附圖簡述

圖1闡述了按照本發明培養的滋養層細胞的激素分泌。
發明詳述本發明以觀察為前提。發明者發現一些蛋白因子會引起靈長類動物胚胎干細胞分化成滋養層細胞。滋養層細胞穩定并表現出胎盤前體細胞的所有細胞特征。由于產生和培養靈長類動物和人胚胎干細胞被標準化且易重復，此觀察可第一次直接從人或其它靈長類動物干細胞來源生成單細胞類型的主要種類(滋養層細胞)，而不干擾胚狀體產生。這里發現引起靈長類動物胚胎干細胞直接分化成滋養層細胞的蛋白因子包括骨形成蛋白4(BMP4)以及相關蛋白因子如BMP2、BMP7及生長-分化因子5(GDF5)。這種因子在本文稱為滋養層誘導因子。
存在可再生量的人和其它靈長類動物滋養層細胞能對胎盤細胞性質進行許多調查研究。現在能具有可再生和無窮盡的胎盤前體細胞供應。特定認為滋養層細胞培養物可用于化學反應研究以模擬藥物測試中使用的胎盤細胞性質，用于一般毒物學以及對胎盤細胞的特定作用。例如，研究抑制子宮中受精胚胎移植的試劑即節育劑可通過觀察推定試劑對滋養層細胞培養物的作用。
此描述包括證明人和其它靈長類動物干細胞能通過單蛋白因子處理直接轉入滋養層細胞的數據。如本文所用，靈長類動物干細胞指人或其它靈長類動物未分化的細胞，它們至少是多能的。下面例子中所用干細胞來源自人和恒河猴胚胎，從而稱為靈長類動物胚胎干細胞。胚胎干細胞來自處于一定發育階段人的干細胞。然而，本文所述方法同樣可應用于獲自其它來源的人干細胞，包括胚生殖系細胞和分離自成熟靈長類動物體的干細胞。注意到在小鼠干細胞經驗基礎上不預期人干細胞會分化成滋養層細胞。通過控制外部培養環境從小鼠干細胞獲得滋養外胚層組織的努力迄今還未成功，當與完整預移植胚形成嵌合體時，小鼠干細胞很少對滋養層有貢獻。小鼠胚胎干細胞不能形成滋養層細胞與小鼠胚胎干細胞發育類似原始外胚層的理論一致，小鼠胚胎干細胞在原始外胚層與內細胞群分離后形成且不再對滋養層譜系有貢獻。人胚胎干細胞形成滋養層細胞的能力暗示小鼠和人胚胎干細胞間發育潛能的基本差異。
注意到本文的方法包括直接應用滋養層誘導因子于培養的干細胞，而沒有通常與干細胞分化相關的任何干擾過程。特別注意到沒有轉變成胚狀體的階段與此方法相關。由其它方法培養的干細胞分化過程一般不均一，這通常是許多不同細胞譜系或細胞類型導致的。相反，本文所述方法使干細胞大量分化成定向分化的細胞類型即滋養層。
為證明干細胞定向分化成滋養層細胞是由于滋養層誘導因子的影響，可能抑制滋養層誘導因子的作用并觀察結果。如果BMP4是滋養層誘導因子，此蛋白能被可溶性BMP4受體或拮抗蛋白頭蛋白抑制。如果僅用BMP4培養靈長類動物干細胞，干細胞培養物會大規模定向分化成滋養層細胞類型。然而，如果用BMP4和抑制劑如可溶性BMP4受體或頭蛋白培養類似的靈長類動物干細胞培養物，不發生成為滋養層細胞的分化。
培養的人胚胎干細胞有很獨特的形態。細胞小、緊密且均一，有獨特的細胞膜和成組的簇。干細胞分化成其它細胞類型是明顯的過程，因為干細胞變得更大和更擴散。有經驗的技術人員能通過分化細胞的細胞外形識別許多細胞類型。在滋養層細胞的情況中，細胞確實變得更大和扁平，細胞膜從擴散變為不可見。然而，為補充滋養層細胞狀況，采用不同細胞特征研究。進行使用DNA微陣列的基因表達研究以檢測細胞的基因表達模式。也檢測細胞的胎盤激素分泌。結果與這些分化細胞被鑒定為滋養層細胞一致。這確認了形態鑒定這些細胞是正確的。
實施例人胚胎干細胞系H1在MatrigelTM-包被塑料平板的培養基中培養，以小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)為條件且添加4mg/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。人骨形成蛋白4(BMP4)(R&D Systems，Minneapolis，MN，也是本文所列其它重組蛋白來源)以1、10和100ng/ml培養基濃度應用于干細胞。干細胞是單層細胞且不在胚狀體中聚集。隨后H1細胞經歷了劑量和時間依賴的形態變化，變得展開、扁平、薄和擴大或延長，它們的核變得更小。這些變化與滋養層細胞形態一致。形態變化開始于各菌落邊緣并由此向內展開。形態變化在用100ng/ml BMP4處理培養的第2天、10ng/ml BMP4處理培養的第3或4天和1ng/ml BMP4處理培養的第4到5天明顯。
用BMP4蛋白信號家族其它成員進行類似實驗。證明引起相似作用、導致干細胞變為滋養層細胞的蛋白包括BMP2、BMP7及生長-分化因子5(GDF5)。沒有發現其它蛋白在干細胞中引起這種相同的形態變化，包括TGF超家族成員如TGFβ1和活化素。類似形態變化在用BMP4、BMP2、BMP7和GDF5處理的恒河猴胚胎干細胞系中觀察到。
用滋養層誘導因子處理干細胞的形態變化與胚胎發育中發生的形態變化一致，其中一些細胞定向變為產生胎盤的譜系。除了形態變化，細胞開始表達轉錄因子GATA2和GATA3和慢性促性腺激素α和β基因，它們都在由其它方法生成的滋養層中表達。細胞產生大量胎盤激素，包括慢性促性腺激素、雌二醇和孕酮。細胞繼續不確定分泌這些激素。細胞的流式細胞儀證明細胞至少主要是CGβ陽性。
也進行實驗，其中BMP家族因子的拮抗物與蛋白因子同時加入培養物。發現如果可溶性BMP受體(100ng/ml)或BMP拮抗蛋白頭蛋白(300ng/ml)與BMP4同時加入培養物，完全防止了干細胞中的形態變化。這證明活化蛋白因子的作用特異性。
對名為H9的另外細胞系進行類似實驗，產生滋養層細胞生成的相似結果。此外，對缺乏bFGF時培養的H1細胞進行類似實驗，暗示此作用對來自不同供體的人干細胞是普遍的且不取決于bFGF的存在。
為進一步研究滋養層特征，cDNA微陣列用于分析BMP4處理細胞和未處理未分化H1細胞中差異表達的基因。在陣列上檢測的43,000個cDNA基因中，僅代表14個基因的19個克隆簇在所有檢測時間點強烈上調。14個基因中的11在前面確定特征為與滋養層或胎盤發育相關。許多這些基因編碼轉錄因子，如轉錄因子AP-2(TFAP-2)、mah同源盒同系物2(MSX2)、細胞因子信號3的抑制物(SSI3)、GATA結合蛋白2和3(GATA2和GATA3)及與YPRW基序1相關的多毛/spli增強子(HEY1)。用BMP4處理的第7天也觀察到許多已知在滋養層或胎盤表達的基因mRNA表達顯著增加，如編碼CG-α和CG-β亞基、促黃體素-α和胎盤生長因子的基因。我們也使用RT-PCR以觀察滋養層標記表達增高，所述標記包括CG-β、神經膠質細胞缺失-1(GCM1)、非典型HLA I類分子HLA-G1和CD9。微陣列分析中，代表8個基因的所有10個上調最高克隆除了一個以外，都編碼前面與滋養層細胞表達基因相關的蛋白或肽。相反，用BMP4處理7天后，多能細胞中一些高度表達基因的轉錄本降低，如編碼POU結構域、5類、轉錄因子1(POU5F1，也稱為OCT4)以及端粒酶反轉錄因子(TERT)的基因。
為進一步確定細胞特征，檢測細胞分泌到培養基的胎盤激素CG、雌二醇和孕酮量。用BMP4處理的H1細胞相較未分化細胞或無條件培養基中分化的細胞，表現出顯著更高的各激素濃度。圖1闡述與無BMP4的細胞(CM)和可在無條件培養基中分化的細胞(UM)相比，暴露于BMP4的細胞(CM+BMP4)中這些激素增加的時程。
權利要求
1.一種誘導靈長類動物干細胞分化成人滋養層細胞的方法，其特征在于，所述方法包括在蛋白滋養層誘導因子存在時培養靈長類動物干細胞的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白滋養層誘導因子選自骨形成蛋白4(BMP4)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)及生長-分化因子5(GDF5)。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白滋養層誘導因子以每毫升培養基1-100納克的濃度應用于干細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述干細胞是人胚胎干細胞。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述干細胞是非人的靈長類動物胚胎干細胞。
6.一種體外培養的靈長類動物滋養層細胞培養物，其特征在于，所述滋養層細胞來自暴露于滋養層誘導因子的靈長類動物干細胞。
7.如權利要求6所述的培養物，其特征在于，所述滋養層誘導因子選自骨形成蛋白4(BMP4)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)及生長-分化因子5(GDF5)。
8.如權利要求6所述的培養物，其特征在于，所述滋養層細胞是人細胞。
9.如權利要求6所述的培養物，其特征在于，所述滋養層細胞是非人的靈長類動物細胞。
10.一種測試試劑對胎盤細胞的作用的方法，其特征在于，所述方法包括通過在滋養層誘導因子存在時培養靈長類動物干細胞來產生滋養層細胞；使滋養層細胞暴露于試劑；以及觀察試劑對滋養層細胞的作用。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述滋養層誘導因子選白骨形成蛋白4(BMP4)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)及生長-分化因子5(GDF5)。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述滋養層誘導因子以每毫升培養基1-100納克的濃度應用于干細胞。
13.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述干細胞是人胚胎干細胞。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述干細胞是非人的靈長類動物胚胎干細胞。
全文摘要
揭示了第一種引起人和其它靈長類動物干細胞培養物直接和統一分化成定向細胞系的方法。用單蛋白滋養層誘導因子處理靈長類動物干細胞導致細胞轉換成人滋養層細胞即胎盤前體細胞。一些蛋白因子包括骨形成蛋白4(BMP4)、BMP2、BMP7及生長－分化因子5，能作為滋養層誘導因子。
文檔編號C12Q1/02GK1643159SQ03805960
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月14日 優先權日2002年3月15日
發明者R·-H·許, J·A·湯姆森 申請人:威塞爾研究所股份有限公司