可擴大的靈長類動物多能干細胞聚集體懸浮培養物及其分化的制作方法

可擴大的靈長類動物多能干細胞聚集體懸浮培養物及其分化的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種可擴大的靈長類動物多能干細胞聚集體懸浮培養物及其分化。本發明涉及從未分化的或分化的胚胎干細胞單細胞懸浮液制備未分化的或分化的胚胎干細胞聚集體懸浮培養物的方法，以及其分化的方法。
【專利說明】可擴大的靈長類動物多能干細胞聚集體懸浮培養物及其分
化
[0001 ] 關于聯邦政府贊助的研究或開發的聲明
[0002]本發明研發期間所進行的部分工作利用了來自國立衛生研究院批準號為5R24RR021313-05的美國政府基金。美國政府享有本發明的某些權利。
發明領域
[0003]本發明涉及實質上無血清和飼養層的懸浮細胞聚集體組合物，以及用于分化該細胞聚集體懸浮液的方法。
[0004]發明背景
[0005]迄今為止,對于哺乳動物多能細胞(pluripotent cell)如本文所描述的人胚胎干細胞(hESC)，還沒有提供大規模生產方法(“擴大的”)的有效系統。為了體外維持hESC處于未分化狀態，一般將hESC維持在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層上，并且通過人工機械解離(例如，顯微解離)和轉移單獨的克隆碎片(pieces)來傳代。這些方法對于不需要大規模生產未分化的hESC或分化的hESC的探討性研究是足夠的，基因靶向、藥物開發、體外毒理學、將來的臨床應用需要改進的方法以用于穩定地大規模擴增hESC，包括酶促傳代。
[0006]可以實施hESC的酶促擴增，但這些方法具有技術缺陷，因為hESC的存活依賴于細胞-細胞相互作用以及 旁分泌信號和自分泌信號。因此，與以單細胞存在相比，hESC更喜歡這種細胞微環境。此外，據報道，hESC的酶促解離可以導致異常核型以及導致基因和基因外改變。因此，在長期培養周期中提供高度支持性培養環境，同時允許未分化的hESC或分化的hESC穩健地大規模擴增(即，生產過程),而不危害多能性(pluripotency)、專能性(multipotency)或遺傳穩定性是必需的。
[0007]人多能細胞為研究人發育早期以及在諸如糖尿病和帕金森病的若干疾病狀態中的治療干預提供了獨特的機會。例如，衍生自hESC的產胰島素細胞的使用相對于目前利用供體胰腺細胞的細胞治療方案將提供巨大的改進。目前糖尿病的細胞療法治療利用來自供體胰腺的細胞，受限于移植所需的高質量胰島細胞的不足。一例I型糖尿病患者的細胞療法需要移植約8χ108個胰腺胰島細胞(Shapiro et al.，2000，NEngl J Med343:230-238;Shapiro et al., 2001a, Best Pract Res Clin EndocrinolMetabl5:241-264; Shapiro et al., 2001, British Medical Journal322:861)。這樣,一次成功的移植需要至少兩例健康供體器官以獲得足夠的胰島細胞。
[0008]因此，hESC代表研究早期胚胎內多能細胞生物學和分化的機制的強大模型系統，以及為哺乳動物的基因操縱和由此帶來的商業、醫學和農業應用提供了機會。此外，hESC的適當增殖和分化能夠潛在地用于生成無限制的適于移植的細胞來源，以用于治療由細胞受損或功能失調導致的疾病。其他多能細胞和細胞系，包括國際專利申請W099/53021所述的早期原始外胚層樣(EPL)細胞、體內或體外衍生的ICM/上胚層、體內或體外衍生的原始外胚層、原始生殖細胞(EG細胞)、畸胎癌細胞(EC細胞)以及通過去分化或通過核轉移衍生的多能細胞，會共享這些特性和應用的部分或全部。國際專利申請W097/32033和美國專利第5，453，357號描述了包括來自除嚙齒動物以外物種細胞的多能細胞。人ES細胞描述于國際專利申請W000/27995和美國專利第6，200, 806號中，以及人EG細胞描述于國際專利申請 TO98/43679 中。
[0009]人們對調節ES細胞多能性和分化的生化機制了解很少。然而，可以得到的有限的經驗數據(和大量軼事證據)表明，在體外培養條件下持續維持多能ES細胞依賴于細胞外環境中細胞因子和生長因子的存在。
[0010]盡管人ESC提供了起始材料的來源，從其發展大量高質量的分化細胞用于人細胞療法，這些細胞必須在以下條件中獲得和/或培養:符合管理臨床安全性和功效的預期法規性指導方針。這些指導方針可能需要利用所有組分均符合cGMP來源的培養基。這種化學限定/GMP標準條件的開發對于促進使用hESC和衍生自hESC的細胞以用于人治療目的是必需的。
[0011]此外，基于hESC的細胞替代療法的最終應用，需要開發使符合法規性指導方針的大規模培養和分化條件成為可能的方法。盡管幾個研究組已經報道了簡化的hESC生長條件，這些研究仍有顯著的局限性。然而迄今為止，多能細胞的成功分離、長期克隆維持、遺傳操縱和種系傳遞是普遍困難的。
[0012]大多數用于干細胞的細胞培養條件仍在培養基中包含血清替代物(KSR) (Xu etal., 2005Stem Cells, 23:315-323;Xu et al., 2005Nature Methods, 2:185-189;Beattieet al., 2005Stem Cells, 23:489-495;Amit et al., 2004Biol.Reprod., 70:837-845;Jameset al.，2005Development, 132:1279-1282)。KSR 包含牛血清白蛋白(BSA)的粗制組分，而不是高純來源。其他研究組僅進行了短期研究，因此并不清楚它們的條件是否能夠維持長期的多能性(Sato et al., 2004, Nature Med.，10:55-63;U.S.Patent PublicationNos.2006/0030042和2005/0233446)。其他研究組已經表明在含有FGF2、活化素A和胰島素的化學限定培養基中多能性的長期維持，但細胞生長在包被有人血清的平板上，這些血清在細胞平板接種前被“沖 洗掉”(Vallier et al., 2005J Cell Sc1.，118 (Ptl9):4495-509)。盡管FGF2是所有這些培養基中的組分，但并不清楚其是否提供了初級或次級自我更新信號(Bendall et al.2007Nature448:1015-1027);特別是如在一些制劑中是否必需使用高濃度的 FGF2 (高達 100ng/mL, Xu et al., 2005Nature Methods, 2:185-189)。
[0013]此外，所有這些研究組在培養基中都添加了 μ g/mL水平的胰島素，或者由于使用KSR引入胰島素。胰島素通常被認為在葡萄糖代謝和“細胞存活”信號轉導中通過結合胰島素受體發揮作用。然而在高于生理濃度的水平，胰島素還能夠以較低效率結合IGFl受體，并通過PI3激酶/AKT途徑提供經典的生長因子活性。KSR或這些其他培養基條件中這種高水平胰島素(yg/mL水平)的存在/需要表明，主要活性是通過結合到由hESC表達的 IGFl 受體來引發(Sperger et al.，2003PNAS, 100 (23): 13350-13355)。其他研究組已經注意到IGFlR的完全互補物以及細胞內信號轉導途徑成員在hESC中的表達，其可能預示著該途徑的功能活性(Miura et al., 2004Aging Cell, 3:333-343) ?胰島素或IGFl可以引發hESC自我更新所需的主要信號，如通過以下事實所提示的:所有目前開發的用于培養hESC的條件都包含胰島素、KSR提供的胰島素或者血清提供的IGFl。為了支持這一概念，已經表明如果PI3激酶在hESC培養物中被抑制，細胞則分化(D’ Amour et al.，2005Nat.Biotechnol., 23:1534-41;McLean et al., 2007Stem Cells25:29-38)。[0014]最近的出版物概括了 hESC的人源化限定培養基(Ludwig et al.，NatureBiotechnology, 2006 年 I 月 I 日在線公布，do1: 10.1038/nbtll77)。然而，這一最新制劑包括幾種被認為影響hESC增殖的因子，包括FGF2、TGFi3、LiCl、Y -氨基丁酸和吡啶酸。注意，這一最新限定的細胞培養基也包含胰島素。
[0015] 申請人:此前報道了基于胰島素/IGFUheregulin、活化素A信號轉導的組合的hESC的自我更新信號轉導示例。參見Wang et al.2007，Bloodll0:4111 - 4119。在該文章中我們發現，外源FGF2信號是多余的且不是必需的(Schulz&Robins2009，同上)Schulz&Robins2009, (In:Lakshmipathy et al.eds., Emerging Technology Platforms for StemCells.John ffiley&Sons., Hoboken, NJ, pp.251-274) ；Heregulin 是 EGF 生長因子家族的成員。該家族有至少14個成員，包括但不限于EGF、TGF^、肝素結合-EGF(hb-EGF)、神經調節蛋白-β (還稱為heregulin-β (HRG-β )、神經膠質生長因子以及其他)、HRG-α、雙調蛋白、乙胞素(betacellulin)和外調蛋白。所有這些生長因子包含EGF結構域，并且通常首先表達為跨膜蛋白，其通過金屬蛋白酶(特別是ADAM)蛋白加工生成可溶性胞外域生長因子。EGF家族成員以不同親和力與ErbBl、2、3和4細胞表面受體的同源-或異源-二聚體相互作用(Jones et al., FEBS Lett, 1999，447:227-231)。EGF、TGFa 和 hbEGF 以高親和力(1-1OOnM范圍)結合ErbBl/1 (EGFR)同源二聚體和ErbBl/2異源二聚體，而HRG-β以極高親和力(<1ηΜ范圍)結合ErbB3和ErbB4。活化的ErbB受體通過PI3激酶/AKT途徑以及還通過MAPK途徑轉導信號。ErbB2和ErbB3是hESC中最高度表達的生長因子之一 (Sperger et al.，2003PNAS，100:13350-13355)，先前已表明 HRG-β 支持小鼠原始生殖細胞的擴增(Toyoda-Ohno et al.，1999Dev.Biol.，215 (2): 399-406)。此外，ErbB2 的超表達和隨后不適當的活化與腫瘤發生有關(Neve et al., 2001Ann.0ncol., 12 (Suppll):S9-13;Zhou&Hung, 2003Semin.0ncol., 30(5Suppll6):38-48;Yarden, 20010ncology, 61Supp12:1-13)。人ErbB2 (染色體17q)和ErbB3 (染色體12q)存在于據觀察在一些hESC中作為三體聚集的染色體上(Draper et al., 2004Nat.Biotechnol., 22:53-4; Cowan et al., 2004NEngl.J.Med.,350 (13):1353-6`;Brimble et al., 2004Stem Cells Dev, 13:585-97;Maitraet a I.，2005Nat.Genet.37:1 099-1 03;Mita Iipova et al., 2005Nat.Biotechnol.23:19-20;Draper et al., 2004Stem Cells Dev., 13:325-36;Ludwig etal., Nature Biotech, 2006 年 I 月 I 日在線公布，do1: 10.1038/nbtll77)。
[0016]ErbB2 和 ErbB3(Brown et al., 2004Biol.Reprod., 71:2003-11;Salas-Vidal&Lomeli,2004, Dev Biol., 265:75-89)表達在小鼠胚泡中，盡管并不特異性局限于內細胞團(ICM),而 ErbBl、EGF 和 TGF β 表達在人胚泡中(Chia et al., 1995Development, 1221 (2):299-307)。HB-EGF 在人 IVF 胚泡培養中具有增殖效應(Martin et al.，1998Hum.Reprod., 13:1645-52;Sargent et al., 1998Hum.Reprod.13(Suppl4):239-48),對生長在15%血清中的小鼠ES細胞具有適度的額外效應(Heo et al.，2006, Am.J.Phy.Cell Physiol.，290: C123-33，Epub2005Augl7)。移植前和移植后早期的發育看起來在 ErbB2-/-，ErbB3-/-，神經調節蛋白 1-/-(Britsch et al., 1998Genes Dev.，12:1825-36)，ADAM17-/-(Peschon, et al.，1998Science,282:1281-1284)和ADAM19-/-(Horiuchi, 2005Dev.Biol., 283 (2):459-71)無效胚胎中不受影響。因此，hESC中通過ErbB受體家族轉導信號的重要性至今并不清楚。[0017]神經調節蛋白-1(NRGl)是展示多重剪接和蛋白加工變體的大基因。這產生了大量的蛋白同種型，其在本文統稱為神經調節蛋白。神經調節蛋白主要表達為細胞表面跨膜蛋白。細胞外區域包含免疫球蛋白樣結構域、糖類修飾區域和EGF結構域。以前已經對NRGl表達同種型做過綜述(Falls, 2003Exp.Cell Res.，284:14-30)。已表明，細胞膜金屬蛋白酶ADAM17和ADAM19將神經調節蛋白-1的跨膜形式加工為可溶性神經調節蛋白/heregulin。HRG-α和-β是神經調節蛋白切割的胞外結構域，包含EGF和其他結構域。因為EGF結構域負責ErbB受體的結合和活化，因此僅包含該結構域的重組分子就能夠展示該蛋白基本上全部的可溶性生長因子效應(Jones et al., 1999FEBS Lett.，447:227-31)。此外，存在神經調節蛋白的經加工的跨膜同種型，其被認為在鄰近細胞中通過EGF結構域與ErbB受體的相互作用觸發近分泌(juxtacrine)信號轉導。
[0018]在hESC研究進展中在培養物中維持多能性方面的重要發展還將闡明符合預期的管理臨床安全和功效的法治性指導方針的培養基和細胞培養條件。盡管最好的結果是化學限定的hESC培養基的可利用性，但如果其生產符合GMP標準，化學上未限定的組分是可接受的。因此，需要鑒定用于培養和穩定能夠用于治療目的的多能干細胞群的方法和組合物，其中所述培養組合物的限定和/或生產符合GMP標準。
[0019]生產能夠在移植后起作用的定向祖細胞或分化細胞類型，是基于hESC的治療研究潛力的主要前景。使用分步方案，尤其與本文、 申請人:此前的專利和非專利出版物中所述的基本上相似的4-階段分步方案，本文中也稱為靈長類動物的多能干細胞(pPSC)例如，hESC或iPSC是可分化細胞，其可在第4階段結束時定向分化為混合的胰腺型細胞群。所述細胞混合物至少包含通常稱為“胰腺祖細胞”，或“胰腺內胚層”或“胰腺上皮細胞”的細胞，二者也稱為“PE”或“PDX1-陽性胰腺內胚層”或“胰腺內胚層細胞”或“PEC”或其等同物。
[0020]PEC細胞組合物已經得以充分的表征，如 申請人:此前的專利和非專利申請所描述，包括但不限于，Kroon et al.2008Nature Biotechnology26:443_52,美國專利第7，534，608號、第7，695，965號和第7，993，920號(名稱:體內制備胰島素的方法(METHODSFOR MAKING INSULIN IN VIVO))，以及第8，278，106號(名稱:源自人多功能干細胞的胰腺細胞的封裝(ENCAPSULATI ON OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENTSTEM CELLS))，這些都以引用的方式全部并入本文。使用流式細胞儀，從PEC的多于10個不同發育組(lots)定量20多個樣品，顯示了如下的細胞類型。細胞混合物約50%(范圍33-60%)由表達NKX6-1而非嗜鉻粒蛋白(CHGA)的細胞組成。約44%(范圍33-62%)的聚合-激素內分泌細胞表達CHGA。已表明CHGA陽性細胞在體內移植或植入后發育并成熟為表達胰高血糖素的細胞。約7%(范圍1.3-13%)表達I3DXl的同時不表達CHGA或NKX6-1(僅為I3DXl群)。混合物或群體中非常少量的細胞，約1%(范圍0.27-6.9%)不表達上述任何標志物:既非roxi，也非NKX6-1或CHGA(或三陰性細胞)。因此，PEC或其等同物是指這類細胞的混合物或群體。PEC組合物或群體還更詳細地描述于實施例27和表12。Kroon etal.2008,(同上)；Schulz et al.2012，(同上);其內容通過引用的方式全部并入本文。
[0021]植入的PEC (包封或未包封的)通過一種機制在體內產生功能性的胰島樣結構，該機制看上去主要涉及胰腺祖細胞重新定向為內分泌譜系，然后進一步成熟為響應葡萄糖的β -細胞。因此，在小鼠中這樣的移植能夠感知血糖，對加工后的人胰島素的計量釋放產生響應，并預防鏈脲霉素(STZ)-誘導的高血糖癥。參見Kroon et al.2008，(同上)。[0022]盡管已從hESC衍生出其他候選的胰腺譜系，它們都沒有在體內顯示出實質上的移植后功能，如同長期響應葡萄糖的人C-肽分泌和預防STZ-誘導的高血糖癥所限定的。沒有在動物模型中顯示出功能，就很難估計這些替代方案的可擴大性或臨床潛力。參見 Cai J.et al.2009J Mol Cell Biol2:50-60; Johannesson et al.2009PLoS0ne4:e4794;Mfopou et al.2010Gastroenterologyl38:2233-2245;Ungrin etal.201IBiotechnol Bioeng.Dec2.do1:10.1002/bit.24375;Clark et al.2007BiochemBiophys Res Commun356:587-593; Jiang et al.2007Cell Resl7:333-344;以及 Shim etal.2007Diabetologia50:1228-1238，其通過引用全部并入本文。
[0023]本文所描述的發明是繼 申請人:此前所證明的之后進行的，即使用限定培養基的無飼養層條件能夠支持單細胞傳代和hESC的大量培養。參見Schulz&Robins2009，
(同上)；和美國專利第8，278，106號(名稱:源自人多功能干細胞的胰腺細胞的封裝，ENCAPSULATION OFPANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS)，它們均通過引用的方式全部并入本文。基于hESC的技術進展到臨床試驗的關鍵是相當的可擴大性的證明。提高擴增效率的改善也將節省時間并節約生產費用，以及使隨培養時間發生群漂移的可能性最小化。參見Maitra et al.2005Nat Genet37:1099-1103，其通過引用的方式全部并入本文。重要的是，使用本文所述的滾瓶按比例縮放，例如與hESC的低溫儲藏一起提供了確定和一致的用于產品生產的材料，以用于近期和長期的研究和開發戰略。
[0024]發明概述
[0025]本發明涉及包含基礎鹽營養液和ErbB3配體的組合物，該組合物實質上無血清。
[0026]本發明還涉及包含基礎鹽營養液的組合物以及用于在可分化的細胞中刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶活性的手段。
`[0027]本發明涉及培養可分化細胞的方法，該方法包括將可分化的細胞接種于細胞培養表面，給可分化的細胞提供基礎鹽營養液以及提供特異結合ErbB3的配體。
[0028]本發明涉及培養可分化的細胞的方法和用于在可分化的細胞中刺激ErbB2_定向的酪氨酸激酶活性的手段，該方法包括將可分化的細胞接種于細胞培養表面，并給可分化的細胞提供基礎鹽營養液。
[0029]本發明還涉及培養可分化細胞的方法，該方法包括給在消化前包含在培養室中的可分化細胞層提供消化液，其中消化將細胞層分散為單個細胞。消化后，將單個細胞置于含有可分化細胞培養液的新組織培養室中，其中可分化細胞培養液包含基礎鹽營養液和ErbB3配體。一旦培養，將單個可分化的細胞置于允許單個細胞生長和分裂的條件下。
[0030]本發明涉及用于通過以下方式從多能hES貼壁培養物生成hES細胞懸浮聚集體的方法:在允許以未分化狀態擴增的貼壁生長培養條件下培養hES ;將貼壁hES培養物解離為單細胞懸浮培養物；使單細胞懸浮培養物與允許通過攪動單細胞懸浮培養物形成hES衍生細胞懸浮聚集體的第一分化培養條件接觸，直至單細胞懸浮培養物形成hES衍生細胞懸浮聚集體的這一時間段，由此生成hES衍生細胞懸浮聚集體。在優選的實施方案中，單細胞懸浮培養物的攪動通過以約80rpm至160rpm的旋轉來實施。
[0031 ] 本發明還涉及用于通過以下方式從hES衍生單細胞懸浮液生成hES衍生細胞懸浮聚集體的方法:在允許以未分化狀態擴增的貼壁生長培養條件下培養hES細胞；使未分化的hES與適于分化hES細胞并導致貼壁hES衍生細胞形成的第一分化培養條件接觸；將貼壁hES衍生細胞解離為單細胞懸浮培養物；使單細胞懸浮培養物與允許通過攪動單細胞懸浮培養物形成hES衍生細胞懸浮聚集體的第二分化培養條件接觸，直至單細胞懸浮培養物形成hES衍生細胞懸浮聚集體的這一時間段，以及由此生成hES衍生細胞懸浮聚集體。在優選的實施方案中，單細胞懸浮培養物的攪動通過以約80rpm至160rpm的旋轉來實施。
[0032]本發明涉及包含靈長類多能干細胞(pPSC)懸浮聚集體的滾瓶。在本發明的某些方面，所述PPSC聚集體為選自人胚胎干細胞(hESC)、誘導的多能干細胞(iPSC)和/或其他人多能干細胞的細胞。在一個實施方案中，所述滾瓶是不透氣的，但根據培養箱或烘箱的能力可以是透氣的。
[0033]本發明還涉及產生包含pPSC聚集體的滾瓶的方法，其通過將pPSC與多能干細胞培養條件接觸，并攪動培養物直至形成PPSC聚集體，從而在滾瓶中產生PPSC聚集體。在某些實施方案中，所述pPSC培養物的攪動通過以約3rpm、約4rpm、約5rpm、約6rpm、約7rpm、約 8rpm、約 9rpm、約 1 Orpm、約 1Irpm、約 12rpm、約 13rpm、約 14rpm、約 15rpm、約 16rpm、約17rpm、約 18rpm、約 19rpm、約 20rpm、約 21rpm、約 22rpm、約 23rpm、約 24rpm、約 25rpm、約26rpm、約27rpm、約28rpm、約29rpm和約30rpm的旋轉來實施。通常,所述pPSC培養物的攬動以約5rpm、約6rpm、約7rpm、約8rpm、約9rpm、約lOrpm、約Ilrpm和約12rpm的旋轉來實施。
[0034]本發明的另一方面涉及在滾瓶中使pPSC聚集體分化的方法，其通過將可分化的或未分化的PPSC聚集體與使PPSC聚集體分化的培養條件接觸，并攪動所述PPSC聚集體培養物直至形成PPSC衍生聚集體，從而在滾瓶中產生pPSC衍生懸浮聚集體。在一些實施方案中，所述pPSC衍生聚集體懸浮培養物的攪動以約3rpm、約4rpm、約5rpm、約6rpm、約7rpm、約 8rpm、約 9rpm、約 I Orpm、約 I Irpm、約 12rpm、約 13rpm、約 14rpm、約 15rpm、約 16rpm、約17rpm、約 18rpm、約 19rpm、約 20rpm、約 21rpm、約 22rpm、約 23rpm、約 24rpm、約 25rpm、約26rpm、約27rpm、約28rpm、約29rpm和約30rpm的旋轉來實施。通常所述pPSC培養物的攪動以約5rpm、約6rpm、約7rpm、約8rpm、約9rpm、約lOrpm、約IIrpm和約12rpm的旋轉來實施。
[0035]本發明又一個實施方案涉及方法，其中滾瓶型容器中的液流涉及無需旋轉或滾動瓶子的滾動。在一個實施方案中，在沒有使用滾動容器的情況下，滾動型運動被基本上重建。在一個實施方案中，例如，通過泵送或使流體以小或無湍流的有序方式平穩流動，賦予靈長類動物多能干細胞培養物流體運動。在這類實施方案中，任何子流通常以與相鄰子流并行的方式流動。這種運動方式也被表征為層流(通常用于驅動粘性流體，尤其是那些以低流速流動的流體)或流線流(流體運動的穩定運動)。在又一個實施方案中，流體運動涉及一個或多個擋板，其分配腔室內的液流以產生連續的、均勻的細胞懸浮液。在又一個實施方案中，流體運動涉及導流板(deflector plate)、分配通道和/或流動通道之一或組合。在每個實施方案中，培養容器上包括至少一個或多個密封物(seal)以確保在細胞聚集、生長和分化期間容器內的無菌環境。
[0036]本發明還涉及通過優化多能細胞培養物的細胞密度或改變多種生長因子的濃度來富集或改變得到的hES衍生細胞聚集懸浮液的細胞培養物和/或細胞群的方法，所述多種生長因子例如FGF10、EGF、KGF、頭蛋白和視黃酸、凋亡抑制劑、Rho-激酶抑制劑等。
[0037]據此，本申請還涉及以下方面或保護的主題。[0038]主題1.滾瓶，包含懸浮于生理上可接受的培養基中的靈長類動物多能干細胞(pPSC)聚集體培養物。
[0039]主題2.根據主題I所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體的直徑為約100-300微米。
[0040]主題3.根據主題I所述的滾瓶，其中所述培養物中基本上無直徑大于300μΜ的pPSC 塊。
[0041]主題4.根據主題I所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體表達至少一種選自0CT4、NANOG, SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-80 和 Tra-1-60 的標志物。
[0042]主題5.根據主題I所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體為人細胞。
[0043]主題6.根據主題5所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體選自人胚胎干細胞(hESC)和誘導的多能干細胞(iPSC)。
[0044]主題7.根據主題I所述的滾瓶，其中所述靈長類動物多能干細胞衍生的懸浮細胞聚集體通過包括以下的方法產生:
[0045]a.提供未分化的pPSC的培養物；
[0046]b.將所述未分化的pPSC接種到滾瓶的能支持所述pPSC的未分化生長的培養基中；以及
[0047]c.低轉速攪動所述pPSC以形成pPSC聚集體。 [0048]主題8.根據主題7所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體的直徑為約100-300微米。
[0049]主題9.根據主題7所述的滾瓶，其中所述培養物中基本上無直徑大于300微米的pPSC 塊。
[0050]主題10.根據主題7所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體表達至少一種選自0CT4、NANOG, SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-80 和 Tra-1-60 的標志物。
[0051]主題11.根據主題7所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體為人細胞。
[0052]主題12.根據主題11所述的滾瓶，其中所述pPSC聚集體選自人胚胎干細胞(hESC)和誘導的多能干細胞(iPSC)。
[0053]主題13.根據主題7所述的滾瓶，其中所述轉速為約3至約20rpm。
[0054]主題14.根據主題7所述的滾瓶，其中所述轉速為約5至約12rpm。
[0055]主題15.根據主題7所述的滾瓶，其中步驟a中的未分化的pPSC培養物為單細胞pPSC的懸浮液。
[0056]主題16.制備主題I所述的滾瓶的方法，所述方法包括:
[0057]a.提供未分化的pPSC的培養物；
[0058]b.將所述未分化的pPSC接種到滾瓶的能支持所述pPSC的未分化生長的培養基中；以及
[0059]c.低轉速攪動滾瓶中的單細胞懸浮液以形成pPSC細胞聚集體，
[0060]從而制備包含懸浮于生理上可接受的培養基中的pPSC聚集體培養物的滾瓶。
[0061]主題17.根據主題16所述的方法，其中所述未分化的pPSC培養物為單細胞pPSC的懸浮液。
[0062]主題18.根據主題16所述的方法，其中所述未分化的pPSC培養物為懸浮于培養基中的解凍pPSC的懸浮液。
[0063]主題19.根據主題16所述的方法，其中所述轉速為約3至約20rpm。[0064]主題20.根據主題16所述的方法，其中所述轉速為約5至約20rpm。
[0065]主題21.根據主題16所述的方法，其中所述轉速為約5至約12rpm。
[0066]主題22.根據主題16所述的方法，其中所述pPSC為人細胞。
[0067]主題23.根據主題22所述的方法，其中所述pPSC選自hESC和iPSC。
[0068]主題24.使滾瓶中的靈長類動物多能干細胞(pPSC)分化的方法，所述方法包括:
[0069]a.提供未分化的pPSC的培養物；
[0070]b.低轉速攪動滾瓶的生理上可接受的培養基中的所述pPSC，以形成pPSC聚集體，以及
[0071]c.使滾瓶中的所述pPSC聚集體與能使所述pPSC分化形成分化的細胞聚集體的培
養基接觸，
[0072]從而使滾瓶中的pPSC分化。
[0073]主題25.根據主題24所述的方法，其中所述pPSC在無飼養層、無基質和無貼壁生長培養物的環境中分化。
[0074]主題26.根據主題24所述的方法，其中所述轉速為約3至約20rpm。
[0075]主題27.根據主題24所述的方法，其中所述轉速為約5至約20rpm。
`[0076]主題28.根據主題24所述的方法，其中所述轉速為約5至約12rpm。
[0077]主題29.根據主題24所述的方法，其中所述pPSC為人細胞。
[0078]主題30.根據主題29所述的方法，其中所述pPSC選自hESC和iPSC。
[0079]附圖簡述
[0080]圖1 描繪了生長于限定條件(8ng/mL FGF2、100ng/mL LR-1GFl Ung/mL 活化素 A)下的BGOlv中的ADAM19、神經調節蛋白I和ErbBl_3的實時RT-PCR表達分析。顯示了 GAPDH和0CT4對照反應。
[0081]圖2描繪了利用AG879對BGOlv細胞增殖的抑制。BGOlv細胞接種于6_孔盤中，并在平板接種后 24 小時暴露于 DMSO(A)、50ηΜ-20 μ M AG1478 (B)或 100mM-20 μ M AG879 (C)。培養5天后，將培養物固定并進行堿性磷酸酶活性染色。AG1478在這些濃度(B中顯示的20 μ Μ)下看起來不影響增殖，但AG879在5μΜ(0顯著減慢細胞生長。
[0082]圖3描繪了培養在DC-HAIF中和限定培養基(DC)中的BGOlv細胞的形態學，DC-HAIF 是含有 10ng/mL HRG-β UOng/mL 活化素 A、200ng/mL LR-1GFl 和 8ng/mL FGF2 的限定培養基(A和B)，限定培養基(DC)含有10ng/mL HRG-β、10ng/mL活化素A和200ng/mL 的 LR-1GFl (C 和 D)。
[0083]圖4描繪了 ADAM19、神經調節蛋白I和ErbBl_4通過RT-PCR在小鼠ES細胞(A)和MEFs⑶中的表達.[0084]圖5描繪了 ErbBl和ErbB2信號轉導在小鼠ES細胞中的抑制。將2xl05個小鼠RlES 細胞在 10%FBS, 10%KSR 與 1000U/mL 小鼠 LIF(ESGRO)中接種于 1:1000MATRIGEL? 上。第二天，DMSO (載體對照)、1-50 μ M AG1478或1_50 μ M AG879隨新鮮培養基加入。第8天固定培養物，并進行堿性磷酸酶活性染色。DMSO(A)和1-50 μ MAG1478 (B和C)沒有明顯抑制增殖。AG879在50 μ M顯著抑制細胞生長(比較D和F)，以及在20 μ M (E)可能已減緩增殖。
[0085]圖6描繪了生長在條件培養基(CM)中的BG02細胞增殖的抑制。(A) 50 μ M AG825抑制生長在CM中的BG02hESC的增殖。(B)AG825抑制hESC中ErbB2Y1248磷酸化。(C)CyT49hESC在生長因子不同組合中連續傳代的集落計數。(D)利用BG02細胞(左側)，IGFl和HRG在hESC增殖中的作用的細胞計數分析。(E)兩次重復實驗的0CT4/DAPI免疫染色表明，IGFl和HRG相比于ActA/FGF2條件顯著增加0CT4+細胞的比例。(F)顯示了無生長因子過夜、饑餓然后用DC-HAIF脈沖15分鐘或者穩定狀態培養物的BGOIDC-HAIF hESC的RTK免疫印跡分析(左側)。對標準化的相對強度的均值和范圍作圖(右側)。
[0086]圖7描繪了生長于含有不同生長因子組合的限定條件中的小鼠ES細胞。㈧顯示了 2xl05個細胞生長在不同的生長因子組合8天后AP+集落的得分。(B-G)顯示了生長在不同生長因子組合的AP+集落的4x放大圖像。
[0087]圖8描繪了維持在DC-HAIF培養基中的人ES細胞的特征。(A)來自BG02DC-HAIFP25細胞的畸胎瘤分析，證實了向外胚層、中胚層和內胚層的多能分化潛力。(B)培養于15%FCS/5%KSR的已分化的BG02細胞的免疫染色。(C)利用含有47296個轉錄探針的高密度Illumina Sentrix Human_6Expression Beadchips 在 BG02 細胞中檢測到的轉錄物分布的維恩圖，BG02細胞維持在CM (64代)或DC-HAIF (在限定培養基中的10或32代)中。(D)證實BG02DC-HAIF p32細胞的轉錄圖譜的散點圖分析與維持在CM (上側)中的BG02細胞的散點圖高度相似，并且在DC-HAIF早期和后期傳代培養物中沒有顯著變化(下側)。(E)利用Beadstudio軟件生成的在不同群中相對基因表達的分級群聚(Hierarchical clustering)系統樹圖。
[0088]圖9描繪了在DC-HAIF培養基中培養在人源化細胞外基質(ECMs)上的細胞的形態。(A)生長在生長因子簡化的MATRIGEL?(以1:200稀釋)上的CyT49細胞(以1:200稀釋)。CyT49細胞還能夠生長在包被有(B)全人血清、(C)人纖連蛋白和(D)VITR0GR0?的
組織培養皿中。
[0089]圖10描繪了人ES細胞的單細胞傳代。(A-D)用ACCUTASE?傳代并以約5x105細胞接種于60mm培養皿后，BG 02細胞的分期成像。(A)初次平板接種后1.5小時，顯示粘附于培養皿的活細胞。(B)在平板接種后20小時，大多數細胞聚集形成小集落。這些集落到平板接種后第4天通過增殖擴增(C)，以及5-6天的過程形成覆蓋整個培養皿的上皮樣單層(D)。(E)在DC-HAIF中用ACCUTASE?傳代19次的BG02培養物顯示的正常雄性核型。
[0090]圖11 描繪了利用(A) ACCUTASE?、(B)0.25% 胰酶 /EDTA、(C) TrypLE 或(D)維爾烯(Versene)的人ES細胞的單細胞傳代后的細胞形態。
[0091]圖12描繪了培養在DC-HAIF中的人ES細胞的大規模生長。(A)擴增至>1010細胞后的BG02細胞的流式細胞術分析。>85%的細胞表達0CT4、CD9、SSEA-4、TRA-1-81。(B)多能性 0CT4、NANOG、REXl、S0X2、UTFl、CRIPTO、F0XD3、TERT 和 DPPA5 的標志物表達的 RT-PCR分析。沒有檢測到分化的譜系的標志物α-甲胎蛋白(AFP)、MSX1和HANDl。(C)利用人染色體特異性重復的熒光原位雜交(FISH)證實了 hChrl2、17、X和Y正常拷貝數的維持。
[0092]圖13描繪了生長在包含HRG-和IGFl但缺乏FGF2的限定培養基中達7代或者大于2個月的hESC BG02細胞的形態(A)和正常核型(B)。
[0093]圖14描繪了來自維持在DC-HAIF (32代)或DC-HAI(l(Hf)中的hESC(BG02)的轉錄物的散點圖分析。在兩種樣品中都檢測到了大比例的表達的轉錄物，轉錄并沒有通過在缺乏外源性FGF2下培養hESC而顯著改變。利用所有表達水平>0的檢測到的轉錄物(所有點)，或者利用顯示檢測置信度水平>0.99 (R2選擇，由虛橢圓形顯示的點)的轉錄物生成相關系數(R2)。成角度的線顯示了 2-倍差異的均值和極限。
[0094]圖15描繪了在不同群的維持在DC-HAIF中的早代和晚代BG02細胞中的相對基因表達的分級群聚系統樹圖。細胞緊密聚集(~0.0075)，并與維持在條件培養基(CM)(~
0.037)的BG02和BG03細胞保持接近相似。維持在DC-HAI中的BG02細胞還與其他檢測的hESC群緊密聚集。作為圖15的解釋，CM是條件培養基；DC是限定培養基，DC-HAIF如上文定義；ap是ACXUTASE?單細胞傳代；DC_HAI與本文定義的DC-HAIF相同，除了沒有FGF2外。
[0095]圖16描繪了培養在96孔和384孔板中的DC-HAIF中的BG02細胞的形態和堿性磷酸酶染色。生長在96孔板的一孔中的BG02細胞(104細胞/孔)的(A)相襯成像(phasecontrast imaging)和(B)堿性磷酸酶染色。生長在384孔板的一孔中的BG02細胞(103細胞/孔)的(C)相襯成像和(D)堿性磷酸酶染色。
[0096]圖17描繪了生長于DC-HAIF懸浮培養中的BG02的暗場圖像。顯示了第2天和第6天的培養物。利用4x放大捕獲圖像。
[0097]圖18描繪了在DC-HAIF中的貼壁和懸浮培養物的生長率。將1x106BG02細胞接種于貼壁和懸浮培養的平行孔中，在第1-6天進行細胞計數。
[0098]圖19描繪了懸浮和貼壁hESC的qPCR分析。懸浮(S.hESC)和貼壁(hESC)培養生長的BG02細胞顯示了可比較水平的0CT4，并且缺乏S0X17表達。分化為定形內胚層(DE)的貼壁細胞以及分化為 懸浮的定形內胚層(S.DE d3)的懸浮hESC兩者均展示了預期的0CT4的顯著下調和S0X17表達的上調。
[0099]圖20描繪了在Y27632存在下、在懸浮培養中hESC聚集的增強。將2x106個BG02細胞在6孔托盤中接種在3mL DC-HAIF或DC-HAIF+Y27632中，托盤置于在IOOrpm旋轉平臺上的孵育器內。在第I和第3天捕獲聚集體的圖像。
[0100]圖21描繪了懸浮聚集體在Y27632存在下的RT-PCR分析。對擴增的培養物實施RT-PCR 以評價多能性標志物的表達。檢測到 0CT4、NAN0G、REX1、S0X2、UTF1、CRIPT0、F0XD3、TERT和DPPA5的表達，而分化的譜系AFP、MSXl和HANDl的標志物沒有檢測到。
[0101]圖22A-N是條形圖，顯示了標志物基因0CT4(圖面A),BRACH (圖面B)、S0X17(圖面C)、F0XA2 或 HNF3 β (圖面 D) ,HNFl β (圖面 E) ,PDXl (圖面 F)、ΝΚΧ6.I (圖面 G)、ΝΚΧ2.2 (圖面 H)、INS (圖面 I)、GCG (圖面 J)、SST (圖面 K)、S0X7 (圖面 L)、ZICl (圖面 Μ)、AFP (圖面N)、HNF4A(圖面O)和PTFlA(圖面P)的表達模式，這不是窮盡的列舉，僅是可以用于鑒定多能人胚胎干(hES)細胞(階段0，d0(0天))、定形內胚層細胞(階段I ;d2(第2天))、PDXl-陰性前腸內胚層細胞(階段2 ；d5) ,PDXl-陽性內胚層細胞(階段3，d8)、胰腺內胚層細胞(階段4 ；dll)、胰腺內分泌前體細胞和/或激素分泌細胞(階段5;dl5)的標志物。
[0102]圖23為顯示細胞懸浮聚集體相對于培養時培養基總體積(mL)的直徑范圍(微米)的圖。
[0103]圖24A-D是條形圖，顯示了 hES衍生細胞中的標志物基因I3DXl (圖面A)、NKX6.1 (圖面B)、NGN3 (圖面C)和NKX2.2 (圖面D)的表達模式，該表達模式與衍生它們的hES細胞培養物的細胞密度有關。
[0104]圖25顯示了多能細胞的細胞聚集體在第O天(d0)時和分化細胞聚集體在第2天、第5天、第8天和第12天(分別為d2、d5、d8和dl2)時的直徑。對細胞聚集體大小進行了測量并繪圖，顯示了最小值、最大值、第二和第三四分位數以及中值。在每一天都顯示了由IxlO6細胞/mL (左邊)和2xl06細胞/mL (右邊)形成的細胞聚集體的圖。
[0105]圖26A-D是條形圖，顯示了滾瓶式容器中多種指出的標志物基因的表達模式。每張圖的左邊樣品表示6孔盤中形成的第O天(d0)細胞聚集體(多能細胞標志物對照)。由棒標示的樣品表示(從左至右)--第O天時的未分化的聚集體以及第2天、第5天、第8天和第12天時的分化聚集體。黑線，IxlO6細胞/mL的滾瓶；黑色虛線，2xl06細胞/mL密度的滾瓶；灰線，6孔盤。
[0106]圖27A-D是條形圖，顯示了如實施例27的表11和表12中所述的較大滾瓶式容器中的多種指出的標志物基因的表達模式。左邊樣品表示6孔盤hESC聚集和分化(對照；圖27A);顯示了第O天、第2天、第5天、第8天和第12天時透氣(V)或不透氣的(NV)490cm2滾瓶(約1.2L容積)中的分化。由于培養物損失，沒有收集最后的490V樣品的第2天的樣品(最右欄)。每個滾瓶分化都使用了相同的d0對照(標有星號)。
[0107]發明詳述
[0108]與先前已知的基于將單獨的細胞接種在多聚物支架、基質和/或凝膠的組織工程學方法相比，本文描述的方法使用從多能hES單細胞懸浮液或hES衍生的(分化的)單細胞懸浮液形成的細胞聚集體懸浮液作為組織形成的基礎材料。細胞聚集體經常包含成百上千個單獨的細胞，其通過共同促成最終分化產物的連接粘附和細胞外基質而連接。在這方面，細胞聚集體可以定義為，相對于更傳統的工程化組織提供了許多性能優勢的一種組織類型。
[0109]在本發明的一個實施方案中，提供了用于從多能干細胞培養物或hES衍生細胞培養物的單細胞懸浮液產生hES聚集體懸浮液的方法。多能干細胞可以最初培養在成纖維細胞飼養層上，或者它們可以是`無飼養層的。解離hESC以及在人飼養層細胞上培養hESC的方法描述于題目為 “METHODS FOR THE CULTURE OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS ON HUMANFEEDER CELLS (在人飼養層細胞上培養人胚胎干細胞的方法)”的美國第7，432，104號專利中，該專利通過引用的方式以其整體并入本文。直接制備的或從培養于飼養層上的hESC啟動的多能ES細胞聚集體懸浮培養物避免了對制備hESC單層的需求，例如，如在貼壁培養物中。這些方法詳細描述于實施例17和18中。
[0110]本發明的其他實施方案提供了直接在分化培養基內產生細胞聚集體懸浮液的方法，分化培養基例如含有試劑的分化培養基，所述試劑優選TGF β家族成員，其能夠活化TGF^受體家族。這種試劑包括但不限于活化素.(Activin) Α、活化素B、⑶F-8、⑶F-1l和Nodal。在分化培養基中產生細胞聚集體懸浮液的方法不同于本文描述的其他方法，其提供了在多能干細胞培養基，例如StemPro中產生細胞聚集體懸浮培養物。
[0111]本法明的其他實施方案提供了產生細胞聚集體懸浮液的方法，該懸浮液從分化的hES細胞培養物(也被稱為“hES衍生的細胞培養物”或“hES衍生的細胞”)形成，例如，在前面 D’ Amour et al.2005,(同上)和 D’ Amour et al.2006 (NatureBiotech262006:1392-1401)中描述的來自階段1、2、3、4和5的細胞。因此，制備本文描述的細胞聚集體的方法并不限于hES或hES衍生細胞的任一多能或專能階段，而是使用方式和對細胞類型優化的需要會決定哪種方法是優選的。這些方法詳細描述于實施例19-22中。[0112]在本發明的另一實施方案中，提供了用于調控得到的細胞組合物的方法，如通過改變不同生長因子的濃度，調控胰腺內胚層細胞、胰腺內分泌細胞和/或rox1-內胚層細胞的比例。這些方法詳細描述于實施例21中。
[0113]除非另外指出，本文使用的術語應該按照本領域技術人員的常規用法來理解。除了以下提供的術語的定義，分子生物學中的常用術語的定義還可以在 Rieger et al., 1991Glossary of genetics: classical and molecular,5thEd.，Berlin:Springer-Verlag;以及在 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., Eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.和John ffiley&Sons, Inc.間的聯合企業(1998Supplement)中找到。應理解,如本說明書和權利要求書中所用的，“a(—個)”或“an(—個)”可以意指一個或多個，取決于它使用的語境。因此，例如，提及“細胞(a cell)”可以指可以利用至少一個細胞。
[0114]此外，出于本說明書和隨附的權利要求書的目的，除非另外指明，本說明書和權利要求書使用的所有表示成分的量、材料的百分比或比例、反應條件的數字以及其他數值都應該理解為在所有情形下通過術語“約”可被改變。因此，除非被相反地指出，以下說明書和所附的權利要求書列出的數值參數是近似值，可以根據本發明尋求的期望特性而變化。至少，不是試圖將等同值教義的應用局限于權利要求書的范圍，每一數值參數應該至少結合報道的有意義的位數以及通過應用平常的四舍五入技術來理解。
[0115]如本文所用，“約”是指一個作為“約”提及的數字包括所列舉的數字加上或減去所列舉數字的1-10%。例如，“約” 100個細胞根據情況可指95-105個細胞或少至99-101個細胞。無論本文中何時出現，數值范圍如“1-20”是指在該給定范圍內的每個整數；例如，“1-20個細胞”是指I個細胞、2個細胞、3個細胞等直至并包括20個細胞。當“約”修飾一個用非整數表示的范圍時，其指所列舉的數字加上或減去所表示的相同程度的有效數字的1-10%。例如，約1.50-2.50mM可指少至1.35mM或多至2.75mM或在0.01增量之間的任何量。
[0116]本發明提供了用于 從hES衍生的單細胞懸浮液產生hES衍生細胞聚集體的方法。因為多種機械和非生理因素影響培養的細胞的運動和聚集，流體機械微環境與最佳的細胞聚集體活力和性能相關，以及提供可以用于擴大的標準化變量，需要表征在多種培養容器、平皿、錐形瓶、生物反應器、瓶子等中生長或分化的細胞的運動，以及表征多種培養基條件對細胞的影響，如果有的話。這些因素中的一些包括但不限于剪切速率和剪切應力、細胞密度和多種生長因子在任一細胞培養基中的濃度。
[0117]剪切速率和剪切應力是定義系統內流體剪切的機械特征。剪切速率被定義為給定距離內流體的速率，并被表示為sec'剪切速率與剪切應力成比例，其中剪切速率(Y) =剪切應力(t)/粘度(μ)。剪切應力被定義為切向作用于細胞表面的流體剪切力，并被表示為每單位面積的力(達因/cm2或N/m2)。能夠通過攪動的液體流過靜態細胞、攪動的細胞流經靜態液體或者通過細胞移入攪動的、動態的流體環境來產生剪切應力。流體粘度通常以泊(poise)測量,其中I泊=1達因sec/cm2=100厘泊(cp)。水是已知的粘性最小的流體之一，其粘度為0.01cp。培養基中的真核細胞典型懸浮液的粘度在25°C溫度下為1.0至
1.1cp。密度和溫度都能影響流體的粘度。
[0118]流體速率還決定流動是否是層流或湍流。當粘滯力占優勢時，發生層流，其特征為平滑的，在低粘度時甚至成流線型。相反，在湍流時高速率和慣性力占優勢，湍流的特征為在跨越時空的流動中出現潤流、鏇潤和混亂的波動。稱為雷諾數(Reynold’s number) (Re)的無因次值通常用于定量層流或湍流的存在。雷諾數是慣性力與粘性力的比率，并被定量為(密度*粘度*長度值)/(粘度)。Re〈2300時層流占優勢，而當ReMOOO時，湍流占優勢。基于與流體速率的這種關系，雷諾數以及由此流體流動是層流或湍流的程度與懸浮液中細胞經歷的剪切速率和剪切應力成正比例。然而，能夠在層流和湍流環境中都產生高剪切應力條件。最初，液體傾向于抵制運動，最接近固體表面的流體經歷了吸引力，該吸引力在直接鄰近表面產生了無流動的邊界層或區。這產生了從表面到流體流中心的流體速率梯度。速率梯度的陡度是液體移動的速度和邊界層到最高流體速率區的距離的函數。當經過容器或容器周圍的液體流動率增加時，流動的速率克服了液體的粘度，并且平滑、層式梯度破壞，產生了湍流。Thomas等證明，湍流條件下的細胞裂解最經常發生在局部高剪切應力和高能量損耗率的區域。參見，Thomas et al.(1994)Cytotechnologyl5:329-335。這些區域隨機出現，但經常發現于速率梯度最高的邊界層。這些流體速率隨機的波動能夠產生非常高的剪切應力區域，其最終能夠對基于細胞培養的生產系統的擴大具有負面影響。因此，需要能夠通過調控在哺乳動物細胞培養生產擴大系統中的剪切力的主要來源來維持這種系統中細胞密度和活力的方法。
[0119]按照 Henzler (HenzIer, 2000，Particle stress in bioreactors, In Advancesin Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T.Ed.Springer-Verlag, Berlin)和 Colomer et al.(Colomer, J.et al.2005.Experimental analysis of coagulation ofparticles under low-shear flow.Water Res.39:2994)提供的方法,計算了旋轉 6 孔平皿中大體積流體的流體機械特性。無因次應力(Dimensionless Stress)等于瑞流常數*(聚集體直徑/Kolmogorov’s Microscale)"瑞流指數。剪切應力等于無因次應力*流體密度*(運動粘度*功率輸入)~0.5。剪切速率等于剪切應力/運動粘度。為了功率輸入和Kolmogorov’ s Microscale的計算，需要每一旋轉率下的雷諾數,其等于(旋轉率*瓶徑)~2/粘度。因為功率輸入和Kolmogorov’s Microscale都是雷諾數的函數，所有剪切應力和剪切速率計算隨旋轉率變化。
[0120]而且，剪切應力和剪切速率是無因次應力的函數，其取決于形成的聚集體的直徑，因此預期聚集體經歷的剪切應力和剪切速率隨著旋轉時間增加。對于100-200 μ m的聚集體直徑，以及60-140rpm的旋轉速度，實施例17顯示了實例計算。這些方法用于提供大體積流體隨時間的平均剪切的估值。然而，預期血管壁的剪切應力由于邊界效應會是最高的。為了評估壁剪切應力，Ley等提出6孔平皿中的壁剪切應力等于旋轉半徑*(密度*動態粘度* (2*pi*旋轉率)~3)~0.5。利用這種方法，計算旋轉速度為60rpm至140rpm的壁剪切應力，并顯示在實施例18中。注意，與大體積流體中的聚集體經歷的時均剪切應力不同，發生在壁的剪切應力獨立于聚集體直徑。
[0121]培養細胞密度對于組織功能也是關鍵的因素，并且在傳統的2-維組織(例如，粘附的工程構建體)中難于實現和/或優化。實施例20更為詳細地描述了細胞密度對分化的影響。細胞聚集體通過呈現更準確地反映體內細胞密度和構象的有組織的3維(3D)架構可以克服這一局限性。因此，細胞實現它們預期結構的時間周期可以顯著減少和/或變得更為一致和有效。而且，3D聚集體形式的細胞可以分化以及更好地發揮作用，因為該架構比貼壁培養更類似于正常的生理。此外，與該生產過程有關的機械困難與例如貼壁培養中的機械困難相比較不易破壞懸浮培養物中自由浮動的細胞聚集體。
[0122]典型生產規模的懸浮培養還利用培養基的連續灌注作為維持細胞活力同時最大化細胞密度的方法。因此，培養基更換提供給培養物流體剪切，其對貼壁細胞和懸浮的聚集體的影響不同。當培養基切線流過細胞表面時，固定的貼壁細胞經受流體剪切應力。與之相比，懸浮的聚集體在聚集體表面經歷顯著減小的剪切應力，因為聚集體自由滾動以響應施加的剪切力。預期延長的剪切應力對粘附的ES細胞是有害的，懸浮的聚集體形式對于最佳的存活和功能是優選的。因此，基于對產生多能干細胞和/或衍生自多能干細胞的專能祖細胞的有效生產過程的需要，以及上述觀測到的有關剪切速率和剪切應力的力學，本發明第一次提供了用于產生懸浮形式的、特別是細胞聚集體懸浮形式的多能干細胞和/或多能干細胞衍生的專能祖細胞的生產方法。[0123]如本文所用的，“單細胞懸浮液”或其等同物指通過任一機械的或化學手段的hES單細胞懸浮液或hES衍生的單細胞懸浮液。存在幾種用于解離細胞簇以從原代組織、粘附的培養細胞和聚集體形成單細胞懸浮液的方法，例如物理力(機械解離，諸如細胞刮擦器、通過針孔移液管研磨、細針穿刺、渦旋解聚和通過精細尼龍和不銹鋼網篩的強制過濾)、酶(酶促解離諸如胰蛋白酶、膠原酶、蘄蛇酶(Acutase)等)或者兩者的組合。此外，能夠支持hESC的單細胞解離的方法和培養基用于擴增、細胞分選和多孔板測定的限定接種，以及能夠使培養程序和克隆擴增自動化。因此，本發明的一個實施方案提供了用于生成穩定的單細胞酶促解離hES或hES衍生細胞培養系統的方法，所述hES或hES衍生細胞培養系統能夠支持未分化的多能hES或分化的hESC的長期維持和有效擴增。
[0124]如本文所用滾瓶(roller bottle/rolling bottle) ”或其等同物是指適于圍繞其軸線旋轉的圓柱形容器。這些容器包括但不限于，通過Corning、Fisher Scientific和其他生產商銷售的滾瓶，以及例如能夠在其側壁上旋轉的鼓形、桶形和其他瓶形容器。本文所述的滾瓶不必一定是圓柱形或具有圓形橫截面。例如它們可為寬度恒定的非圓形封閉曲線。在一個實施方案中，所述曲線可為魯洛三角形或具有圓形角的魯洛三角形，如美國專利第5，866，419號所述，其通過引用全部并入本文。圓形橫截面的滾瓶并非是提供平穩旋轉的唯一形狀或幾何體，因為存在無數種這類曲線，它們均在本發明考慮的范圍。然而，工業上并不經常遇到這類曲線，因為用于旋轉瓶子的大部分機器要求垂直于該曲線運行的水平軸保持在固定位置，其不用于非圓形旋轉器因旋轉時其軸有前后轉換運動。相比圓形橫截面型滾瓶，除了如其他圓柱形滾瓶通常的圓形運動，該額外的運動或旋轉可增強氣體交換。
[0125]典型的圓柱形滾瓶包括底壁、頂壁和在底壁與頂壁之間延伸的圓柱形側壁。頂壁包括開口以提供進入該滾瓶內部的入口。此類滾瓶的內表面提供了用于細胞相互作用和/或貼附的活性表面。因此，牛津生化詞典提供的解釋是，滾瓶為用于培養單層貼壁細胞的圓柱形容器。的確，滾瓶適于大量細胞如貼壁細胞的生長，或適于生產細胞副產品如細胞分泌的藥用物質。滾瓶的圓柱形側壁可為平滑的或定制圖案的，而圖案基本上從底壁延伸至頂壁以增加細胞生長的表面積，并且當瓶子圍繞側壁的軸轉動時有助于液體流至瓶子的所有內表面。
[0126]無論滾瓶的橫截面為何(圓形或非圓形的)，都將液體生長培養基引入并容納于滾瓶中。瓶子的旋轉運動使得內表面被液體培養基潤濕，從而促進細胞的生長。使用合適設備的旋轉儀來旋轉本發明的滾瓶。
[0127]通常將滾瓶構造為玻璃的、不銹鋼的或透明塑料的如聚苯乙烯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴如聚丙烯、具有乙二醇添加劑的聚對苯二甲酸乙二酯、乙二醇-1，4-環己烷二甲醇對苯二酸共聚酯等。優選透明材料，因為能夠通過將瓶子置于倒置顯微鏡下監控細胞生長。
[0128]在醫藥、生化和醫學鄰域用于一些處理過程(如細胞生長和感染、異源糖蛋白生產、疫苗制備和高密度植物細胞培養)的人工和自動化滾瓶系統已經應用了 40多年。參見 Tanaka et al.1983, Biotechnol.Bioeng.25:2359; Tanakal987, ProcessBiochem.Aug., 106;Hong, et al.1989,Biotechnol.Prog.5:137;Elliotl990, Bioprocess Tech.10:207;Tsao1992，Annals N.Y.Acad.Sc1.665:127;PenneIl&MiI stein1992, J.0f Tmmun.Meth.146:43;01ivas et al., 1995, Tmmun.Meth.182, 73(1995);Singhvi etal.1996, Cytotechnology22:79;以及Kunitake et al.1997，Biotechnology52:3289,其通過引用全部并入本文。此外，對于工業規模生產細胞培養產物(即疫苗)，即使當使用基于單元操作的系統時，在將細胞轉移至用于最終生長期的微載體培養之前，滾瓶中的細胞被頻繁傳代。參見Edy, 1984, Adv.Exp.Med.Biol.172:169，其通過引用全部并入本文。
[0129]到目前為止，滾瓶廣泛用于培養貼壁細胞可歸因于幾個因素。該方法基于:(i)水平的圓柱形容器裝有足夠體積的培養基或流體且軸向地旋轉；由于滾瓶的擴大是長度的函數，無需擴大研發或發明，這導致縮短了工業化的研發時間線并較快地將新產品推向市場；
(ii)滾瓶系統使得能有恒定的流體-氣體接觸，即由于軸向的旋轉，任何時候均有至少一薄層的流體或培養基隨著旋轉而覆蓋瓶子的內表面；該層允許增加流體-氣體交換，并且隨著瓶子旋轉氣體返回位于滾瓶底部的培養基池中的細胞；(iii)在大規模培養中維持無菌條件持續延長的時間是可能的，因為一個或多個滾瓶的污染不會導致整個批次的污染；(iv)精確控制營養物和廢物產物水平是可能的；以及(V)直接監測細胞是相對簡單的，例如，確定某些細胞標志物以確保例如在1-4階段后細胞的有效分化和適當的特化。
[0130]然而不想局限于使用滾瓶或滾子式容器培養三維細胞聚集體，意圖還有其它用于制備本發明細胞聚集體的手段，但不使用通過滾瓶或在例如鼓上旋轉的圓柱形容器產生的運動。用于聚集PPSC的運動類型通常可通過例如霧化容器或腔室以產生更多的層流來產生。該運動也可通過具有一個入口和出口來產生，以幫助流體培養基或甚至細胞本身的流入和流出，并產生類似于本文描述的滾瓶所實現的運動。該運動還可通過使用一個或多個流量分配器或其組合來實現。例如，這樣的流量分配器可包括擋板以在所述腔室內分配流體或培養基的流動，從而產生三維細胞聚集體的連續均勻的混合物。在另一個實例中，流量分配器可為一個或多個導流板、分配通道和/或流動通道的組合，其產生類似于滾瓶中所見的流體運動而不必發生于滾瓶型圓柱形容器或腔室中。因此，以無湍流方式產生流體運動的替代性手段，也產生足夠低的剪切力以促進細胞碰觸，并使得細胞能彼此粘附而形成本文所述的細胞聚集體。
[0131]滾瓶中生長的粘附或貼壁細胞的某些特性也具有缺點。例如，自然的貼壁細胞生長需要大量表面積供細胞貼附，而滾瓶可用于生長的表面積有限。為所有目的，例如細胞種植或接種、細胞生長和/或病毒繁殖和擴增，在滾瓶中進行混合的常規方法是以均勻的速率朝一個方向旋轉。大多數用于培養粘附或貼壁細胞的滾瓶處理過程的標準旋轉頻率為約0.125-5rmPo對于這些培養，重要的是所述細胞盡快與滾瓶的側面接觸，因為只有附著于容器壁后細胞隨后才能增殖并形成細胞片層。細胞緩慢附著于容器內壁導致細胞低活力和/或種植不均，因而導致在滾瓶的表面上的不均勻生長。而且，低效的混合限制了細胞的生長，因為細胞無法隨著瓶子旋轉而獲得充足的養分(例如，氧氣)或從浸沒的表面貼附的細胞片層中充分移除毒素(例如，二氧化碳)。令人感興趣的是，這些缺點對于使用滾瓶來聚集、生長、擴增和分化可分化的懸浮多能細胞并不關鍵。
[0132]鑒于上述特性以及 申請人:自己公開的用于在6-孔盤等當中制備hES細胞聚集體的方法，本領域技術人員還不會轉而使用滾瓶來制備多能干細胞聚集體。參見Schulz etal.2012，Stem Cells7:l_17, e37004 以及美國專利第 8，153，429 號和第 8，008，075 號，其通過引用全部并入本文。例如，Schulz et al.2012,(同上)，教導了通過使用圓形或徑向運動、移動或旋轉，多能干細胞可有效地聚集，所述圓形或徑向運動、移動或旋轉被施加于主渦流上，并基于旋轉形式將細胞拖入培養容器中心更高的局部密度處，例如將細胞拖入6-孔盤的孔的中心或錐形瓶中心或生物反應器中心。該徑向渦流在滾瓶中無法實現，因為其性質，滾瓶以其側壁而非底座旋轉，因此，將方法從包括中心渦流運動的系統轉變至不包括中心渦流運動的系統如本文所述的滾瓶，這并不直觀。
[0133] 申請人:使用其他類型運動研究了靜態培養，包括研究搖晃、攪拌和離心hES細胞，而這些運動形式無法形成hES細胞聚集體或可分化的細胞聚集體。而且，確實在這些條件下形成的這些hES或hES細胞-衍生的聚集體無法在體內產生功能性的葡萄糖響應的細胞類型，這為任何成功生產PEC的方法的最終檢測。參見至少Kroon et al.2008，(同上)和Schulz et al.(2012)，(同上)。因此，不能夠說僅運動或移動就足以形成多能干細胞或hES細胞懸浮聚集體或可分化的細胞聚集體，因為并非如此。這些研究(數據未顯示)表明，不僅僅是流體運動和該運動產生的力促進了細胞聚集體形成所需的粘附接觸，其導致單細胞多能干細胞轉變為穩定的細胞-細胞聚集體。
[0134]如上所簡述，滾瓶的旋轉與6-孔盤、錐形瓶等圍繞中心渦流發生的旋轉極為不同。在滾瓶中，當瓶子以其側壁旋轉時大多數培養物體積保留在瓶底，且隨著瓶子旋轉一薄層流體或培養基覆蓋于瓶子的內表面。該薄的流體層隨瓶子的旋轉而增加了氣體交換，從而全面增加了培養基的氧氣水平；即一旦該薄層培養基返回大多數培養基所在的瓶底，其攜帶了增加量的氧氣。然而并不直觀的是該運動，尤其是當以本領域標準的用于粘附細胞的很低的速度(例如，0.125-5rpm)旋轉時，將允許充足的細胞-細胞接觸或碰觸，同時維持足以使得靈長類動物多能干細胞(PPSC)聚集體形成(更不用說可分化細胞聚集體的分化)的低剪切力。
[0135]由于兩種方式之間的轉速不同，使用滾瓶來聚集、培養、傳代、擴增和分化細胞也與6-孔盤、錐形瓶、生物反應器不同。6-孔盤、錐形瓶、生物反應等例如使用約80、85、90、95、100、105、110、115和120rpm的更高轉速，這是至少為了在培養中防止細胞聚集體結塊或形成簇或更大的細胞團塊所要求的。注意，結塊的細胞簇(例如，300 μ m或更大的大聚集體)不應該與大體上為球形、尺寸更小(約100-200 μ m)且均勻的細胞聚集體混同。相反，滾瓶中PPSC的聚集、生長、傳代、擴增和分化是在約3、4、5、6、7、8、9和IOrpm的相對低的轉速下進行的。這些較低的轉速并不產生與6-孔盤、錐形瓶、生物反應器等當中發生的相同程度的剪切力，且鑒于 申請人:此前的經驗(參見Schulz et al.2012，同上)，預期在這些條件下會成功形成細胞聚集體。
[0136]使用滾瓶進行多能干細胞聚集、培養、傳代、擴增和分化相比其他細胞培養容器的優點為，一旦在最小的滾瓶中得到優化，其方法將與在更大的滾瓶中非常相似地起作用而無需其他實質性發明。例如，通過使用具有相同標準橫截面但實質上更大容積的更長瓶子，或使用成組的瓶子，用同樣的瓶子直徑、直徑/體積比率和旋轉速度可以按比例擴大總培養物質。滾瓶長度(按比例)的增加并不影響細胞聚集或分化過程。因此，按比例擴大細胞處理過程或生產，從490cm2滾瓶(直徑11.12cm ;長17.30cm，包括蓋)至850cm2滾瓶(直徑11.63cm;長27.36cm，包括蓋)至1750cm2滾瓶(直徑11.73cm ;長53.16cm，包括蓋)或更大，除了本文的描述并不涉及實質上或大的修改。
[0137]由于至少以上理由，滾瓶中細胞生產的可擴大性，不同于在6-孔盤、錐形瓶、生物反應器等的旋轉平臺系統。例如，為了獲得IxlO6細胞/mL的IL多能干細胞培養物，需要約30個6-孔盤。用另一種方式表述，不是使用80個6-孔盤(共480個孔)，本領域技術人員僅需要4，850cm2的滾瓶。本領域技術人員應理解，滾瓶需要更少的操作和勞動是生產的改善。此外，當在不同規模下使用旋轉平臺時，為了實現聚集必須調整容積、速度和旋轉半徑。例如，在錐形瓶中可實現靈長類動物PSC聚集，但在約150rpm的相對高的轉速下發生得最好，這會引起太多湍流和剪切力而導致細胞死亡增加(數據未顯示)。僅將瓶子或罐置于搖動的平臺不產生本文描述的細胞懸浮聚集體(數據未顯示)。搖動沒有產生合適的流體運動來支持恰當的細胞-細胞接觸和粘附，且可能產生了太多湍流和剪切力而導致細胞死亡增加。類似地，方形瓶和15cm玻璃罐由于類似原因而不是按比例擴大pPSC聚集體形成的合適培養容器(數據未顯示)。而且，僅細胞-細胞接觸不會導致PPSC聚集體形成，因為當將hES細胞的單細胞懸浮液離心后回收細胞團時，沒有觀察到細胞聚集體(數據未顯示)。因此，發現真正具有可支持高效和一致的細胞聚集(包括一致的聚集體直徑)的合適流體運動的可擴大系統并非是顯然或常規的，其困難明顯超過本領域技術人員的期望或預期。事實上，出人意 料的是，常規用于大規模培養粘附和貼壁細胞類型的滾瓶，配合速度高達30倍的降低，就將提供生產本文所描述的pPSC聚集體和分化的合適條件。
[0138]如本文所用的，術語“接觸”(即，使細胞，例如可分化的細胞與化合物接觸)意在包括在體外共同孵育化合物和細胞(例如，將化合物添加至培養的細胞)。術語“接觸”并不意在包括細胞向限定的細胞培養基的體內暴露，所述限定的細胞培養基包含ErbB3配體，以及任選地TGF-β家族的成員，這可以在個體內天然發生(即，暴露可以作為天然生理過程的結果發生)。使細胞與包含ErbB3配體以及任選的TGF-β家族成員的限定的細胞培養基接觸的步驟可以以任何合適的方式進行。例如，可以在貼壁培養或在懸浮培養中處理細胞。應當理解，與限定培養基接觸的細胞還可以用細胞分化環境進一步處理以穩定細胞或分化細胞。
[0139]如本文所用的，術語“分化”指比其來源的細胞類型更為分化的細胞類型的產生。因此該術語包括部分分化和終末分化的細胞類型。衍生自hESC的分化的細胞通常稱為hES衍生細胞，或hES衍生細胞聚集體培養物，或hES衍生的單細胞懸浮液，或hES衍生細胞貼
壁培養物等。
[0140]如本文所用的，術語“基本上(substantially) ”指大范圍或程度，例如，上下文中的“基本上相似”用于描述一種方法與另一種方法大范圍或程度相似或不同。然而，如本文所用的，術語“基本上無”，例如“基本上無”或“基本上無污染物”，或者“基本上無血清”或“基本上無胰島素或胰島素樣生長因子”或其等同物，意指溶液、培養基、補加劑、賦形劑等至少98%、或至少98.5%、或至少99%、或至少99.5%、或至少100%無血清、污染物或其等同物。在一個實施方案中，提供了不含血清，或者100%無血清的，或者基本上無血清的限定培養基。相反，如本文所用的，術語“基本上相似的”或其等同物意指組合物、處理過程、方法、溶液、培養基、補加劑、賦形劑等與在本文說明書先前描述的或在以其整體并入本文的以前描述的處理過程或方法中的那些有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相似。
[0141 ] 在本發明的某些實施方案中，術語“富集的”指包含超過約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的期望的細胞譜系的細胞培養物。
[0142]如本文所用的，術語化合物的“有效量”或其等同物指化合物的濃度在限定培養基的其余組分存在下足以使培養物中的可分化細胞在缺乏飼養層細胞以及缺乏血清或血清替代物的情況下穩定超過一個月。本領域技術人員可以容易地確定該濃度。
[0143]如本文所用的，術語“表達”指細胞中多核苷酸的轉錄或多肽的翻譯，使得該分子在表達該分子的細胞中的水平比在不表達該分子的細胞的水平顯著地高。測量分子表達的方法是本領域技術人員公知的，以及包括但不限于Northern印跡(RNA印跡)、RT-PCR、原位雜交、Western印跡(蛋白質印跡)和免疫染色。
[0144]如本文所用的，當指細胞、細胞系、細胞培養物或細胞群時，術語“分離的”指基本上與細胞的天然來源分開，使得細胞、細胞系、細胞培養物或細胞群能夠在體外培養。此外，術語“分離”用于指從兩種或更多種細胞組中物理選擇一種或多種細胞，其中基于細胞形態和/或不同標志物的表達來選擇細胞。
[0145]通過參考以下本發明優選實施方案的詳細描述和其中包括的實施例，可以更容易地理解本發明。然而，應理`解，在本發明的組合物和方法被公開和描述前，本發明并不局限于特定的核酸、特定的多肽、特定的細胞類型、特定的宿主細胞、特定的條件或特定的方法等，因為，這些當然可以變化，并且其中眾多的改進和變型對本領域技術人員是顯而易見的。
[0146]用于克隆、DNA分離、擴增和純化、用于涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切核酸酶等的酶反應的標準技術以及多種分離技術是本領域技術人員已知和經常應用的。大量標準技術描述于 Sambrook et al.，1989“Molecular Cloning”(分子克隆)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, Plainview, New York;Maniatis et al.,1982 “MolecularCloning，，(分子克隆),Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NewYork;Wu(ed.) 1993Meth.Enzymo1.218, Part I;Wu(ed.) 1979Meth.Enzymo1.68;Wu etal., (ed.) 1983Meth.Enzymo1.1OOandlOl;Grossman and Moldave(eds.) 1980Meth.Enzymol.65;Miller(ed.) 1972 “Experiments in Molecular Genetics”(分子遺傳學實驗)，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York;Old andPrimrose, 1981 “Principles of Gene Manipulation”(基因操作原理)，University ofCalifornia Press, Berkeley;Schleif&Wensink, 1982 “Practical Methods in MolecularBiology”(分子生物學實踐方法)；Glover(ed.) 1985 “DNA Cloning” Vol.1 and II，IRLPress, Oxford, UK;Hames and Higgins (eds.) 1985 “Nucleic Acid Hybridization，，(核酸雜交)，IRL Press, Oxford,UK;以及 Setlow and Hollaenderl979 “GeneticEngineering !Principles and Methods”(基因工程:原理和方法)，Vols.1-4, PlenumPress, New York。其中使用的縮略詞和術語被視為本領域的標準，并常用于專業學術期刊中，諸如本文引用的那些。
[0147]本發明涉及包括基礎鹽營養液和有效量的ErbB3配體的組合物和方法，該組合物實質上不含血清。本發明的組合物和方法用于培養細胞，特別是可分化的細胞。應當理解，在培養可分化細胞的不同點，可以將多種組分添加至細胞培養物，以使培養基能夠包含除本文描述的組分外的組分。然而，考慮在制備培養物期間或培養可分化細胞期間的至少一個點，限定培養基包含基礎鹽營養液和用于活化ErbB2-定向的酪氨酸激酶的手段。
[0148]盡管本文描述的基礎鹽營養液被應用于維持hESC的細胞生長和活力，在本發明的其他實施方案中，維持多能細胞的多能性或用于多能細胞分化的可選的干細胞培養基以基本上相似的方式發揮作用，這些培養基包括但不限于KSR(Invitrogen)、或無異種成分 KSR(xeno-free KSR, Invitrogen)、StemPro? (Invitrogen), mTeSR?l (StemCellTechnologies)和 HEScGRO(Millipore)、基于 DMEM 的培養基等。
[0149]在另一實施方案中，在細胞外基質蛋白(ECM)，例如MATRIGEL不存在和/或存在的情況下，將hESC培養在本文描述的限定培養基中。無ECM下培養的人ES細胞包含約0.5至10%人血清(hS)或來自300K和/或IOOK截止離心柱(Microcon)的hS滯留部分。可以通過以下方式制備hES細胞聚集體懸浮液:直接將hESC孵育在含有hS或hS滯留部分的培養基中；或者將培養容器與hS或hS滯留部分在37°C孵育約30分、I小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時和24小時后。在含有hS或hS滯留部分的培養基中的hESC的接種效率與培養在PCT/US2007/062755描述的DC-HAIF中的或者培養在利用MATRIGELTM作為ECM的DC-HAIF培養基或者其他類似基質中的hESC所觀察的接種效率是可比較的。用于在基本上無血清的限定培養基中培養hESC的方法描述于2007年10月19日提交的題目為 “METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIACONTAINING HUMAN SERUM(用于含人血清的無飼養層多能干細胞的方法和組合物)”的序列號為11/8875,057的美國專利 申請中，該美國申請通過引用的方式以其整體并入本文。
[0150]仍在另一實施方案中，將hES細胞聚集體懸浮液培養在基本上無血清且還無外源添加的成纖維細胞生長因子(FGF)的培養基中。這與美國專利7，005，252 (Thomson)不同，該美國專利需要在無血清但含有外源添加的生長因子包括FGF的培養集中培養hESC。
[0151]能夠通過細胞外信號跨膜轉導來實施細胞調節，所述細胞外信號跨膜轉導進一步調節細胞內的生物化學途徑。蛋白磷酸化代表細胞內信號從分子到分子傳播的一個過程，最終引起細胞反應。這些信號轉導級聯受到高度調節，并且經常重疊，如通過許多蛋白激酶以及磷酸酶的存在所證實的。據報道，在人類，蛋白酪氨酸激酶已知在包括糖尿病、癌癥的多種疾病狀態的發展中都具有重要作用，并且也與種類多樣的先天性綜合征有關。絲氨酸蘇氨酸激酶，例如，Rho激酶，是一類如果受到抑制，能夠與人疾病包括糖尿病、癌癥和多種炎癥性心血管病癥和AIDS有關聯的酶。迄今為止，鑒定/設計的大多數抑制劑在ATP結合位點起作用。這種ATP競爭性抑制劑通過它們靶向ATP結合位點更不保守區已經顯示出選擇性。
[0152]小GTP結合蛋白的Rho激酶家族包含至少10個成員，包括RhoA-E和G、Racl和2、Cdc42以及TC10。抑制劑通常稱為ROK或ROCK抑制劑，并且它們在本文可互換使用。RhoA、RhoB和RhoC的效應器結構域具有相同的氨基酸序列，并且看起來具有相似的細胞內靶標。Rho激酶作為Rho的主要下游媒介起作用，并以兩種同種型存在:a (R0CK2)和β (ROCKl)。Rho激酶家族蛋白在其N-末端結構域具有催化(激酶)結構域、在其中間部分具有卷曲螺旋結構域以及在其C-末端結構域具有推定的pleckstrin同源(PH)結構域。ROCK的Rho-結合結構域位于卷曲螺旋結構域的C-末端部分，且Rho的GTP結合形式的結合導致激酶活性的增加。Rho/Rho-激酶-介導的途徑在多種激動劑起始的信號轉導中發揮重要作用，所述多種激動劑包括血管緊張素I1、血清素、凝血酶、內皮素-1、去甲腎上腺素、血小板衍生的生長因子、ATP/ADP和細胞外核苷酸以及尾加壓素II。通過它的靶標效應器/底物的調節，Rho激酶在包括平滑肌收縮、肌動蛋白細胞骨架組織、細胞粘附和運動性以及基因表達的多種細胞功能中發揮重要作用。通過Rho激酶蛋白在介導被認為與動脈硬化發病有關的多種細胞功能中所起的作用，該激酶的抑制劑還可以用于治療或預防多種動脈硬化心血管疾病，并與被認為促進動脈硬化的內皮收縮和內皮滲透性增加有關。因此，在本發明的一些實施方案中，將促進和/或支持細胞存活的試劑添加至多種細胞培養基中，例如，Rho-激酶抑制劑Y-27632、法舒地爾(Fasudil)以及H-1152P和ITS (胰島素/轉鐵蛋白/硒；Gibco)。這些細胞存活試劑部分通過促進解離的hES細胞或hES衍生培養物，例如前腸內胚層、胰腺內胚層、胰腺上皮、胰腺祖細胞群等，特別是解離的胰腺內胚層和胰腺祖細胞群的重新聯接發揮作用。hES或hES衍生細胞的存活增加的實現不依賴于這些細胞是否從細胞懸浮聚集體產生或從貼壁平板培養物(有或無細胞外基質、有或無血清、有或無飼養層)產生。增加這些細胞群的存活促進和改善了利用細胞分選儀的純化系統，因此使細胞的回收得以改善。利用諸如Y27632的Rho激酶抑制劑可以允許hES衍生細胞類型的擴增以及促進它們在連續傳代解離的單細胞的存活或從冷凍保存物的存活。盡管已經在hES和hES衍生細胞培養物上檢測了諸如Y27632的Rho激酶抑制劑，但Rho激酶抑制劑可以應用于其他細胞類型，一般地例如，上皮細胞，包括但不限于腸、肺、胸腺、腎以及如神經細胞類型的著色的視網膜上皮。
[0153]如本文所用的，術語“`可分化細胞”用于描述能夠分化為至少部分成熟的細胞或者能夠參與細胞分化例如與能夠至少分化為部分成熟細胞的其他細胞融合的細胞或細胞群。如本文所用的，“部分成熟的細胞”、“祖細胞”、“不成熟細胞”、“前體細胞”、“專能細胞(multipotent cell) ”或其等同物還包括終末分化的那些細胞,例如,定形內胚層細胞、PDXl-陰性前腸內胚層細胞、PDXl-陽性胰腺內胚層細胞，PDXl-陽性胰腺內胚層細胞還包括rox1-陽性前胰腺內胚層細胞和rox1-陽性胰腺內胚層尖細胞。所有上述細胞都是這樣的細胞，其展示來自相同器官或組織的成熟細胞的諸如形態學或蛋白表達的至少一種表型特征，但還能夠分化為至少一種其他細胞類型。例如，正常的成熟肝細胞通常表達諸如白蛋白、纖維蛋白原、α-1-抗胰蛋白酶、凝血酶原凝血因子、轉鐵蛋白和諸如細胞色素P-450S的解毒酶等。因此，如本發明定義的，“部分成熟的肝細胞”可以表達白蛋白或另一種或多種蛋白，或者開始呈現正常的成熟肝細胞的外觀或功能。
[0154]與通過以前已知方法制備的大小和形狀都可以變化的細胞聚集體相比，本文描述的細胞聚集體和方法具有窄的大小和形狀分布，即，細胞聚集體在大小和/或形狀方面基本上是均一的。細胞聚集體的大小均一性對于分化性能和培養物同質性是關鍵的。將基本的傳質分析應用到聚集體，預期氧氣和營養素向大聚集體中心的擴散與向較小聚集體的擴增會減緩，假定滲透性相等。由于聚集的ES細胞向胰腺譜系細胞的分化依賴于特定生長因子的暫時應用，與細胞聚集體的均一(體積和形狀)培養物相比，具有不同直徑聚集體混合物的培養物可能是去同步的。這種細胞聚集體的混合物產生異質類型，并且可以導致差的分化性能以及最終不適合生產、擴大和制備。本文使用的細胞聚集體能夠具有多種形狀，諸如，例如球形、圓柱形(優選具有相同的高度和直徑)或者棒狀等。盡管可以使用其他形狀的聚集體，但在本發明的一個實施方案中，細胞聚集體是球形或圓柱形通常是優選的。在另一實施方案中，細胞聚集體是球形并且在大小和形狀方面基本是均一的。例如，如果細胞聚集體的大小不同或不是均一的，可靠地生產和進行大規模細胞處理會是困難的。因此，如本文所用的，短語“基本上均一的”或“大小和形狀基本上均一的”或其等同物指聚集體均一性的散布不超過約20%。在另一實施方案中，聚集體均一性的散布不超過約15%、10%或5%。
[0155]盡管每一聚集體中細胞的確切數目不是關鍵的，但本領域技術人員應當認識到，每一聚集體(和因此的每一聚集體的細胞數目)的大小受限于氧氣和營養素擴散到中心細胞的能力，以及該數目還可以取決于細胞類型和該細胞類型的營養需求而變化。細胞聚集體可以在每一聚集體包含最小數目的細胞(例如，兩個或三個細胞)，或者可以在每一聚集體包含成百上千個細胞。通常，細胞聚集體在每一聚集體包含幾百到幾千個細胞。出于本發明的目的，盡管細胞聚集體的大小取決于細胞類型通常為約50微米至約600微米，但該大小可以小于或大于這一范圍。在一個實施方案中，細胞聚集體的大小為約50微米至約250微米，或者為約75微米至約200微米，以及優選地，它們的大小約為100微米至150微米。與之相比，懸浮存在的圓柱形或非球形細胞聚集體是基于短軸和長軸(例如，X、Y和Z)的直徑不相等的那些聚集體。這些非球形細胞聚集體的大小傾向于更大，直徑和高度為約500微米至600微米。然而，在本文描述的方法中，這些非球形hES細胞聚集體一旦開始分化(如果它們尚沒有分化)就變為球形。非球形細胞聚集體包括但不限于圓柱形和立方形細胞聚集體，但大小和 形狀仍是均一的。
[0156]許多細胞類型可以用于形成本文描述的細胞聚集體。通常，取決于待工程化的三維構建體的類型(例如，包括胰腺、肝臟、肺臟、腎臟、心臟、膀胱、血管等的多種器官結構)，細胞類型的選擇會變化。例如，如果三維結構是胰腺，則細胞聚集體會有利地包含通常在胰腺中發現的一種或多種細胞類型(例如，諸如胰島素、胰高血糖素、胃饑餓素(ghrelin)、生長抑素類型細胞的內分泌細胞，以及內皮細胞、平滑肌細胞等)。基于期望的三維組織或器官的類型，本領域技術人員能夠選擇適當的細胞聚集體的細胞類型。合適的細胞類型的非限定性實例包括干細胞(例如，成體干細胞和胚胎干細胞)、收縮性或肌細胞(例如，橫紋肌細胞和平滑肌細胞)、神經細胞(例如，神經膠質細胞、樹突狀細胞和神經元)、結締組織(包括骨、軟骨、分化為骨形成細胞和軟骨細胞的細胞以及淋巴組織)、薄壁組織細胞、上皮細胞(包括形成腔和血管或通道的襯里的內皮細胞、外分泌性分泌上皮細胞、上皮吸收細胞、角化上皮細胞(例如，角質細胞和角膜上皮細胞)、細胞外基質分泌細胞、粘膜上皮細胞、腎上皮細胞、肺上皮細胞、乳腺上皮細胞等，以及未分化的細胞(諸如胚胎細胞、干細胞和其他前體細胞)等。
[0157]本文描述的細胞聚集體可以是同質細胞的聚集體或異質細胞的聚集體。如本文所用的，“同質細胞的”、“單一細胞的”細胞聚集體或其等同物指多個細胞懸浮聚集體，其中每一細胞聚集體包含基本上為單一細胞類型的多個活細胞，例如，用于制備本文描述的hES細胞聚集體的方法可以基本上是同質細胞的，基本上由多能hESC組成、基本上由定形內胚層細胞、前腸內胚層細胞組成、基本上由胰腺內胚層細胞組成，其還可以包括rox1-陽性前胰腺內胚層細胞、PDXl-陽性胰腺內胚層細胞、PDXl-陽性胰腺內胚層尖細胞、胰腺內分泌前體細胞、胰腺內分泌細胞等。
[0158]如本文所用的，術語“實質上(essentially) ”或“基本上(substantially) ”指存在于任一細胞聚集體懸浮類型中的組分或細胞最低允許(de minimus)量或量減少,例如，本文描述的細胞懸浮聚集體是“實質上或基本上同源的”、“實質上或基本上同質細胞的”或由“實質上hESC”、“實質上或基本上定形內胚層細胞”、“實質上或基本上前腸內胚層細胞”、“實質上或基本上PDXl-陰性前腸內胚層細胞”、“實質上或基本上PDXl-陽性前胰腺內胚層細胞”、“實質上或基本上PDXl-陽性胰腺內胚層或祖細胞”、“實質上或基本上PDXl-陽性胰腺內胚層尖細胞”、“實質上或基本上胰腺內分泌前體細胞”、“實質上或基本上胰腺內分泌細胞”等組成。
[0159]基本上同質細胞的細胞聚集體懸浮培養物中的一些是例如hES衍生細胞聚集體懸浮培養物，其包含培養的總hES衍生細胞的少于約50%的hESCs、少于約45%的hESCs、少于約40%的hESCs、少于約35%的hESCs、少于約30%的hESCs、少于約25%的hESCs、少于約20%的hESCs、少于約15%的hESCs、少于約10%的hESCs、少于約5%的hESCs、少于約4%的hESCs、少于約3%的hESCs、少于約2%的hESCs或少于約1%的hESCs。以另一方式陳述，hES衍生細胞聚集體懸浮培養物，例如rox1-陰性前腸內胚層、PDX-陽性前胰腺內胚層細胞、PDXl-陽性胰腺內胚層或祖細胞、PDXl-陽性胰腺尖細胞、胰腺內分泌祖細胞和胰腺內分泌細胞，包含至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
[0160]如本文所用的，“異質細胞的”、“多細胞的”或其等同物指細胞聚集體，由此，每一單獨細胞聚集體包含至少為兩個、三個、四個、五個、六個或更多細胞類型的多個細胞，或者至少一種細胞類型和非細胞組分，例如細胞外基質(ECM)物質(例如，膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白和/或蛋白聚糖)。這種ECM組分可以由細胞天然分泌，或可選地，細胞可以通過任何本領域已知的方法進行遺傳操縱以改變諸如選擇素、整合素、免疫球蛋白和鈣粘素等的ECM物質和/或細胞粘附分子的表達水平。在另一實施方案中，天然的ECM物質或模擬ECM物質的任一合成組分可以在聚集體形成過程中并入聚集體。例如，制備本文描述的hES衍生細胞聚集體諸如胰腺上皮或胰腺內胚層細胞聚集體(或4期細胞聚集體)的方法基本上由胰腺上皮或內胚層細胞組成，但還可以存在小細胞數目的其他非胰腺上皮類型細胞，或者其他內胚層祖細胞，以及甚至胰腺內分泌性分泌細胞(例如胰島素分泌細胞)。
[0161]為了清楚起見，本文描述的以及通過本文描述的懸浮方法制備的同質-或異質-細胞的聚集體不是本領域和其他人描述的稱為胚狀體(EBs)的細胞聚集體。胚狀體與本文描述的細胞聚集體是明 顯不同的，因為EBs是分化的和未分化細胞的細胞聚集體，其出現在ES細胞在單層培養中生長過度時，或維持在非限定培養基的懸浮培養物中或通過非定向方案(即隨機分化)向多生殖層組織分化時。相反，實施例17和20詳細討論的本發明酶促解離貼壁平板培養的hESC以制備單細胞懸浮液，然后將這些細胞聚在一起形成細胞聚集體；然后利用這些細胞聚集懸浮培養物用于分化，基本上如在前面D’ Amour etal.2005，(同上)，&D’Amour et al.2006，(同上)中描述的。EBs和本發明的細胞聚集體間的其他差異在下文進一步討論。
[0162]仍有其他方法描述了制備胚狀體(EBs)。如本文使用的，術語“胚狀體”、“聚集體”或其等同物指分化的和未分化的細胞的聚集體，其出現在當ES細胞在單層培養中生長過度時，或維持在非限定培養基的懸浮培養物中或通過非定向方案向多胚層組織分化時。換句話說，EBs不是從本文描述的多能干細胞的單細胞懸浮液形成的，也不是從hES衍生的專能細胞的貼壁培養物形成的。這些特征本身使本發明清楚地區別于胚狀體。
[0163]胚狀體是不同細胞類型的混合物，通常來自通過形態學標準可以區分的幾個胚層。胚狀體通常指由細胞群組成的形態學結構，其大部分衍生自經歷非定向分化的胚胎干(ES)細胞，即如當未分化的細胞在無限定生長因子下暴露于高濃度的血清時出現的那些。在適合EB形成的培養條件下(例如，從小鼠ES細胞移除白血病抑制因子，或者其他的類似阻斷因子)，ES細胞增殖并形成開始分化的小細胞團。首先，對應于人ES細胞分化的約1-4天，小細胞團在外層形成內胚層細胞層，并被視為“簡單的胚狀體”。其次，對應于人ES細胞分化后的約3-20天，形成“復雜的胚狀體”，其特征在于外胚層和中胚層以及衍生組織的廣泛分化。如本文所用的，EBs包括簡單和復雜的EBs，除非上下文另外要求。胚狀體何時在ES細胞培養中形成常規由本領域技術人員通過例如肉眼檢測形態學來確定。取決于培養條件，約20個細胞或更多的細胞的漂浮團被認為是EBs。參見，例如，Schmitt et al.(1991)Genes Dev.5, 728-740;Doetschman et al.1985J.Embryol.Exp.Morph.87:27-45。該術語還指衍生自原始生殖細胞的等同結構，其為從胚胎性腺區提取的原始細胞；參見，例如Shamblott, et al.1998Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:13726。原始生殖細胞，本領域中有時還稱為EG細胞或胚胎生殖細胞，當用適當的因子處理時，形成多能ES細胞，胚狀體可以衍生自所述多能ES細胞；參見，例如美國專利第5，670，372號和Shamblott, et al.，(同上)。 [0164]存在多種制備EBs的方法,例如，Ng et al.2008Nature Protocols3:468-776 描述的旋轉胚狀體(spin embryo id bodies)和從接種在微圖案細胞外基質島上的單細胞懸浮液制備的 EBs,描述于 Bauwens et al2008, Stem Cells26:2300-10，Epub2008Jun26。然而，這些方法對于hESC和hES衍生細胞的大規模制備(生產)而言成本過高且效率較低，因為它們在擴大制備實際啟動前需要過多步驟。例如，Bauwens et al.，在能夠選擇細胞以開始懸浮培養之前，首先必須將hESC接種在生長因子降低的MATRIGELTM上。該方法的時間和成本使它繁雜，因為需要定制的微圖案組織培養板。此外，Ng等應用的方法對于大規模生產hESC和hES衍生細胞而言也沒有成本效益，因為使用離心機以便生成更均一的EB。這些方法受到表面積約束的限制，這也影響到它們的可擴大性。最后，在所有這些方法學中，細胞聚集體不是如本發明這樣從多能干細胞的單細胞懸浮液中制備。
[0165]不像本發明描述的細胞聚集體，胚狀體是如下的細胞聚集體:其由來自三個胚層的眾多細胞類型組成，并通常通過將未分化的ES細胞的聚集體暴露于諸如20%胎牛血清的非定向的分化信號而建立的。該定向方法得到的是細胞類型的混合物，其用來在體外模擬正常的胚胎發育。盡管該方法在用于檢測胚胎發育的基礎研究水平是有用的，但它不適于任何大規模的細胞治療生產過程,其中細胞產量、群體同一性、群體純度、批次同一性、安全性、細胞功能和商品成本主要的考慮因素。而且，不管用于從胚狀體純化給定細胞類型的任何富集策略，分化方案都沒有提供會產生大群單細胞類型的定向方法。隨后，污染物群體會一直占據優勢，并且會阻礙純化特定群體的任何努力。以前所有建立和分化ES細胞聚集體的工作在它們的方法學中具有以下組成部分的一個或多個:1)利用小鼠而不是人ES細胞，2)依賴離心聚集細胞的的強迫聚集方案而不是正常的細胞粘附過程，3)細胞大塊在靜態條件下的聚集，4)非單細胞解離或將細胞從表面刮擦下來以生成聚集體，5)利用15-20%的胎牛血清的細胞聚集體的非直接分化，從而形成胚狀體和全胚層的細胞類型，6)在“懸滴”條件下形成，其僅能在小規模下進行。據我們所知，不利用15-20%FCS分化胚狀體的唯一研究描述了這樣一個方案:其中細胞聚集體通過強迫聚集形成，然后利用適于中胚層的培養基立即分化聚集體(Ng et al.，2005，Blood.106:1601)。然而，在本工作中，研究者們在靜態聚集培養10-12天后將胚狀體轉移到非聚集貼壁培養，使與本申請的比較不相關。與所有以前的工作相比，本申請提出的方法I)將人ES細胞解離為單細胞，然后通過在最優化聚集體直徑和細胞存活的改善調控的剪切速率下的旋轉培養生成聚集體，2)直接將ES細胞聚集體分化為定形內胚層，然后前腸內胚層，然后前胰腺前腸內胚層，然后胰腺內胚層，以及最后胰腺內分泌細胞。該分化方案高效產生定形內胚層和胰腺譜系群，同時污染群體最小化。而且，與所有其他發表的研究完全相反，該ES細胞聚集和分化的方案不產生胚狀體。
[0166]胚狀體是分化的和未分化細胞的混合物，通常由來自幾個胚層的細胞組成，并且經歷隨機分化，與之相反，本文描述的細胞聚集體實質上或基本上是同質細胞的，作為例如胚胎細胞、定形內胚層、前腸內胚層、PDXl陽性胰腺內胚層、胰腺內分泌細胞等的多能、專能、雙能或單能類型細胞的聚集體存在。
[0167]本發明通過提供能夠再現地制備大小和形狀基本上均一的細胞聚集體的有成本效益的生產過程或方法解決了上述問題，所述生產過程或方法利用容易地應用于大規模生產的過程。在一個具體實施方案中，利用本發明的細胞培養基，在懸浮培養中擴增可分化細胞。在另一具體實施方案中，可分化細胞可以以懸浮的形式維持和擴增，即，它們保持未分化或被阻止進一步分化。在細胞培養的上下文中，術語“擴增”用其本領域所使用的含義，指細胞增殖，以及增加細胞的數目，優選增加存活細胞的數目。在具體的實施方案中，通過培養超過約I天，即約24小時在細胞懸浮液中擴增細胞。在更具體的實施方案中，通過培養至少1、2、3、4、5、6、7 天或至少2、3、4、5、6、7、8周在懸浮培養中擴增細胞。
[0168]本文描述的分化培養條件和hES衍生的細胞類型與前面D’ Amour et al.2006中描述的那些基本類似。D’ Amour et al.2006描述了 5步分化方案；階段I (基本上導致定形內胚層產生)，階段2(基本上導致rox1-陰性前腸內胚層產生)，階段3(基本上導致PDXl-陽性前腸內胚層產生)，階段4 (基本上導致胰腺內胚層或上皮或胰腺內分泌祖細胞產生)以及階段5 (基本上導致激素表達內分泌細胞產生)。重要地，所有這些細胞第一次能夠通過本文描述的懸浮方法產生。
[0169]如本文所用的，“定形內胚層(DE) ”指能夠分化為腸管細胞或衍生自腸管的器官的專能內胚層譜系細胞。根據某些實施方案中，定形內胚層細胞是哺乳動物細胞，以及在優選的實施方案中，定形內胚層細胞是人細胞。在本發明的一些實施方案中，定形內胚層細胞表達或不能顯著表達某些標志物。在一些實施方案中，選自S0X17、CXCR4、MIXLU GATA4、HNF3beta、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQl、CMKORl、CRIPl 和 CER 的一種或多種標志物表達在定形內胚層細胞中。在其他實施方案中，選自0CT4、α-甲胎蛋白(AFP)、凝血調節蛋白(TM)、SPARC、S0X7和HNF4 α的一種或多種標志物沒有顯著表達在定形內胚層細胞中。定形內胚層細胞群和其制備方法還描述于2004年12月13日提交的、題目為“DEFINITIVEENDODERM(定形內胚層)”、申請號為11/021，618的美國專利申請中，該申請整體并入本文。
[0170]本發明的其他實施方案涉及稱為“PDX1-陰性前腸內胚層細胞”、“前腸內胚層細胞”或其等同物的細胞培養物和細胞聚集體。PDXl-陰性前腸內胚層細胞也是專能的，并且能夠產生多種細胞和組織，包括但不限于胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、肺/支氣管、肝、咽、咽囊、十二指腸和咽鼓管的部分。在一些實施方案中，與非前腸內胚層細胞相比，例如不明顯表達這些標志物的定形內胚層或rox陽性內胚層，前腸內胚層細胞表達的S0X17、HNF1B、HNFl a ,FOXAl水平增加。PDXl-陰性前腸內胚層細胞還表達低至零水平的H)X1、AFP、S0X7和SOXl。PDXl-陰性前腸內胚層細胞群以及其制備方法還描述于2006年10月27日提交的、題目為 “PDXl-expressing dorsal and ventral foregut endoderm(F1DXl 表達的背和腹部前腸內胚層)”的、申請號為11/588，693的美國專利申請中，該申請通過引用的方式以其整體并入本文。
[0171]本發明其他的實施方案涉及“rox1-陽性胰腺前腸內胚層細胞”、“PDX1-陽性前胰腺內胚層”或其等同物的細胞培養物。PDXl-陽性前胰腺內胚層細胞是專能的，并且能夠產生多種細胞和/或組織，包括但不限于胃、小腸和胰腺。在一些實施方案中，與不明顯表達這些標志物的非前胰腺內胚層細胞相比，PDXl-陽性前胰腺內胚層細胞表達的H)X1、HNF6、S0X9和PROXl的水平增加。PDXl-陽性前胰腺內胚層細胞還表達低至零水平的NKX6.1、PTF1A、CPA 和 cMYC。
[0172]本發明的其他實施方案涉及“PDX1-陽性胰腺內胚層細胞”、“PDX1-陽性胰腺祖細胞”、“胰腺上皮”、“PE”或其等同物的細胞培養物。PDXl-陽性胰腺祖細胞是專能的，并且能夠在胰腺中產生多種細胞，包括但不限于腺泡細胞、導管細胞和內分泌細胞。在一些實施方案中，與不明顯表達roxi和NKX6.1的非前胰腺內胚層細胞相比，PDXl-陽性胰腺祖細胞表達的這些標志物的的水平增加。PDXl-陽性胰腺祖細胞還表達低至零水平的PTF1A、CPA、cMYC、NGN3、PAX4、ARX `和 NKX2.2、INS、GCG、GHRL, SST 以及 PP。
[0173]可選擇地，本發明的其他實施方案涉及“rox1-陽性胰腺內胚層尖細胞”或其等同物的細胞培養物。在一些實施方案中，PDX1-陽性胰腺內胚層尖細胞表達的roxi和NKX6.1的水平增加，這與rox1-陽性胰腺祖細胞相似，但與rox1-陽性胰腺祖細胞不同，pdx1-陽性胰腺內胚層尖細胞額外表達的PTF1A、CPA和cMYC的水平增加。PDXl-陽性胰腺內胚層尖細胞還表達低至零水平的NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2、INS、GCG、GHRL, SST以及PP。
[0174]仍然，本發明的其他實施方案涉及“胰腺內分泌前體細胞”、“胰腺內分泌祖細胞”或其等同物的細胞培養物。胰腺內分泌祖細胞是專能的，并且產生成熟內分泌細胞，包括α、β、δ和PP細胞。在一些實施方案中，與其他非分泌祖細胞類型相比，胰腺內分泌祖細胞表達的NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2的水平增加。胰腺祖細胞還表達低至零水平的INS、GCG、GHRL、SST 和 PP。
[0175]仍然，本發明的其他實施方案涉及“胰腺內分泌細胞”、“胰腺激素分泌細胞”、“胰島激素表達細胞”或其等同物的細胞培養物，指從多能細胞如α、β、δ和/或PP細胞或其組合體外衍生的細胞。內分泌細胞可以是多激素或單激素的，例如表達胰島素、胰高血糖素、胃饑餓素、生長抑素和胰腺多肽或其組合。因此，內分泌細胞能夠表達一種或多種胰腺激素，其至少具有人胰島細胞的一些功能。胰島激素表達細胞可以是成熟的或不成熟的。基于某些標志物的差異表達或者基于它們的作用能力，例如體外和體內的葡萄糖反應，能夠將不成熟的胰島激素表達細胞與成熟胰腺胰島表達細胞區分開。胰腺內分泌細胞還表達低至零水平的 NGN3、PAX4、ARX 和 NKX2.2。
[0176]與間質定形內胚層細胞相比，上數細胞類型的大多數是上皮型的。在一些實施方案中，胰腺內胚層細胞表達選自2006年10月27日提交、題目為“PDX1EXPRESSING DOSALAND VENTRAL FORE⑶T ENDODERM(PDX1表達的背和腹部前腸內胚層)”的相關美國專利申請第11/588，693號的表3的一種或多種標志物,和/或一種或多種選自該申請中表4的標志物，以及還有2005年4月26日提交、題目為“PDXl-expressing endoderm (PDX1-表達內胚層)”、申請號為11/115，868的美國專利申請，這兩篇美國專利申請通過引用的方式整體并入本文。
[0177]本發明考慮用于可分化細胞的組合物和方法，不管它們的來源或它們的可塑性。細胞的“可塑性”用于本文大致如同本領域所使用的。也就是說，細胞的可塑性指細胞分化為特定細胞類型的能力，所述特定細胞類型存在于來自胚胎、胎兒或發育的有機體的組織或器官中。細胞“越可塑”，則細胞能夠分化為的組織越多。“多能細胞”包括細胞及其子代，其可以能夠分化為或產生多能、專能、寡能和單能細胞，和/或存在于胚胎、胎兒或發育的生物體的成熟或部分成熟細胞類型中的幾種，如果不是全部的話。“專能細胞”包括細胞和其子代，其可以能夠分化為或生成專能、寡能和單能組細胞，和/或一種或多種成熟或部分成熟的細胞類型，除了衍生自專能細胞的成熟或部分成熟的細胞類型局限于特定組織、器官或器官系統的細胞。例如，專能造血組細胞和/或其子代具有分化為或生成一種或多種類型的寡能細胞，諸如骨髓祖細胞和淋巴祖細胞的能力，并且還生成通常在血液中存在的其他成熟的細胞組分。“寡能細胞”包括細胞和其子代，其分化為成熟或部分成熟的細胞的能力比專能細胞更為局限。然而，寡能細胞仍可以具有分化為寡能和單能細胞和/或給定組織、器官或器官系統的一種或多種成熟或部分成熟的細胞類型的能力。寡能細胞的一個實例是骨髓祖細胞，其能夠最終產生成熟的或部分成熟的紅細胞、血小板、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞。“單能細胞”包括具有分化為或產生其他單能細胞和/或一種類型的成熟或部分成熟細胞類型的能力的細胞和其子代。
[0178]如本文使用的，可分化細胞可以是多能的、專能的、寡能的甚或單能的。在本發明的某些實施方案中，可分化細胞是多能可分化細胞。在更具體的實施方案中，多能可分化細胞選自胚胎干細胞、ICM/上胚層細胞、原始外胚層細胞、原始生殖細胞和畸胎癌細胞。在一個具體實施方案中，可分化細胞是哺乳動物胚胎干細胞。在更具體的實施方案中，可分化細胞是人胚胎干細胞。
[0179]本發明還考慮來自動物內任何來源的可分化細胞，只要該細胞是如本文所定義的可分化的。例如，可分化細胞可以獲自胚胎或其中的任一原始胚層，獲自胎盤或絨毛膜組織，或者獲自更成熟的組織諸如成體干細胞，包括但不限于脂肪、骨髓、神經組織、乳腺組織、肝組織、胰腺、上皮、呼吸組織、性腺和肌肉組織。在具體實施方案中，可分化的細胞是胚胎干細胞。在其他具體實施方案中，可分化的細胞是成體干細胞。仍在其他具體實施方案中，干細胞是胎盤-或絨毛膜衍生的干細胞。
[0180]當然，本發明考慮使用來自任何能夠產生可分化細胞的動物的可分化細胞。獲得可分化細胞的動物可以是脊椎動物或是無脊椎動物、哺乳動物或是非哺乳動物、人類或非人類。動物來源的實例包括但不限于靈長類、嚙齒類、犬、貓科、馬、牛和豬。
[0181]可以利用本領域技術人員已知的任一方法衍生本發明的可分化細胞。例如，人多能細胞可以利用去分化和核轉移方法來制備。另外地，用于本發明的人ICM/上胚層細胞或原始外胚層細胞可以在體內或體外衍生。原始外胚層細胞可以在貼壁培養中產生或在懸浮培養中作為細胞聚集體產生，如W099/53021中所描述的。此外，能夠利用本領域已知的任何方法傳代人多能細胞，這些方法包括人工傳代方法和諸如酶促或非酶促傳代的大體積傳代方法。
[0182]在某些實施方案中，當利用ES細胞時，胚胎干細胞具有正常的核型，而在其他實施方案中，胚胎干細胞具有異常的核型。在一個實施方案中，大多數胚胎干細胞具有正常核型。預期大于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或大于95%的經檢測的細胞分裂中期的細胞會顯示正常核型。
[0183]在另一實施方案中，大多數胚胎干細胞具有異常核型。預期大于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或者大于95%的經檢測的細胞分裂中期的細胞會顯示異常核型。在某些實施方案中，細胞被培養超過5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20代后，異常核型是明顯的。在一個具體實施方案中，異常核型包括至少一個常染色體的三體性，其中常染色體選自染色體1、7、8、12、14和17。在另一實施方案中，異常核型包括多于一個常染色體的三體性，其中多個常染色體的至少一個選自染色體1、7、8、12、14和17。在一個實施方案中，常染色體是染色體12或17。在另一實施方案中，異常核型包括另外的性染色體。在一個實施方案中，核型包括兩個X染色體和一個Y染色體。還預期，染色體的易位可以發生，以及這種易位包括在術語“異常核型”中。前述染色體異常和其他染色體異常的組合也包括在本發明內。
[0184]組合物和方法包括基礎鹽營養液。如本文使用的，基礎鹽營養液指鹽的混合物，其提供給細胞正常細胞代謝所需的水和某些大量的無機離子，維持細胞內和細胞外滲透平衡，提供碳水化合物作為能量源，以及提供緩沖系統以維持培養基在生理PH范圍內。基礎鹽營養液的實例包括但不限于達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’ sModifiedEagle’ sMedium, DMEM)、最小必需培養基(MEM)、基礎伊格爾培養基(Basal EagleMedium, BME)、RPM11640、Ham’s F_10、Ham’s F-12、α -最小必需培養基(a MEM) ,Glasgow's最小必需培養基(G-MEM)和伊思考夫改良達爾伯克氏培養基(Iscove’ s ModifiedDulbecco's Medium)，以及其混合物。在一個特定實施方案中，基礎鹽營養液是DMEM和Ham’ s Fl2近似50:50的混合物。
[0185]預期組合物還包含微量元素。微量元素可以商購，例如，從Mediatech購買。微量元素的非限定性實例包括但不限于化合物，包括鋁、氯、硫酸鹽、鐵、鎘、鈷、鉻、鍺、鈉、鉀、鈣、磷和鎂。含有微量元素的化合物的具體實例包括但不限于A1C13、AgN03、Ba(C2H3O2)2,CdCl2、CdS04、CoCl2、CrCl3、Cr2 (SO4) 3、CuS04、檸檬酸鐵、Ge02、K1、KBr、L1、鑰酸、MnS04、MnCl2、NaF、Na2SiO3, NaVO3, NH4VO3, (NH4) 6Mo7024、NiSO4, RbCl、硒、Na2SeO3、H2Se03、亞硒酸二鈉、硒基甲硫氨酸、SnCl2, ZnSO4, ZrOCl2,以及其混合物和鹽。如果存在硒、亞硒酸鹽或硒基甲硫氨酸，它的濃度為約0.002至約0.02mg/L。此外，還可以存在羥基磷灰石。
[0186]預期氨基酸可以添加至限定培養基。這種氨基酸的非限定實例是甘氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酸、L-谷氨酸/Glutamax、L-精氨酸鹽酸鹽、L-天冬酰胺一水合物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物、L-胱氨酸2HC1、L-谷氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽一水合物、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羥脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物和L-纈氨酸。在某些實施方案中，氨基酸是L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羥基脯氨酸、L-纈氨酸以及其混合物。
[0187]還預期，限定培養基能夠包含抗壞血酸。優選地，抗壞血酸以約lmg/L至約1000mg/L的起始濃度存在，或者從約2mg/L至約500mg/L,或者從約5mg/L至約100mg/L,或者從約10mg/L至約100mg/L或者約在50mg/L。
[0188]此外，組合物和方法還可以包括其他組分，諸如血清白蛋白、轉鐵蛋白、L-谷氨酰胺、脂類、抗生素、β-巰基乙醇、維生素、礦物質，可以存在ATP和類似組分。可以存在的維生素的實例包括但不限于維生素 A、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、D1、D2、D3、D4、D5、E、生育三烯酚、Kl和K2。本領域技術人員能夠確定用于給定培養的礦物質、維生素、ATP、脂類、必需脂肪酸等的最佳濃度。補加劑的濃度可以，例如為從約0.001 μ M至約ImM或更高。可以提供的補加劑的濃度的具體實例包括但不限于約0.005 μ Μ、0.01 μ Μ、0.05 μ Μ、0.1 μ Μ、0.5μΜ、1.0μΜ、2.0μΜ、2.5μΜ、3.0μΜ4.0μΜ、5.0μΜ、10μΜ、20μΜ、100μΜ 等。在一個具體實施方案中，組合物和方法包括維生素Β6和谷氨酰胺。在另一具體實施方案中，組合物和方法包括維生素C和鐵補加劑。在另一具體實施方案中，組合物和方法包含維生素Kl和維生素Α。在另一具體實施方案中，組合物和方法包括維生素D3和ΑΤΡ。在另一具體實施方案中，組合物和方法包括維生素Β12和轉鐵蛋白。在另一具體實施方案中，組合物和方法包含生育三烯酚和β_巰基乙醇。在另一具體實施方案中，組合物和方法包含谷氨酰胺和ΑΤΡ。在另一具體實施方案中，組合物和方法包含ω-3脂肪酸和谷氨酰胺。在另一具體實施方案中，組合物和方法包含ω-6脂肪酸和維生素在另一具體實施方案中，組合物和方法包含α -亞麻酸和B2。
[0189]本發明的組合物實質上無血清。如本文所用的，“實質上無血清”指在本發明的溶液中不存在血清。血清不是本發 明的組合物和方法的必需成分。因此，血清在任一組合物中的存在僅應該歸因于雜質，例如，來自起始物質或來自原代細胞培養物的殘余血清。例如，實質上無血清培養基或環境能夠包含少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的血清，其中仍然觀察到培養基或環境的目前改善的生物活性維持能力。在本發明的具體實施方案中，實質上無血清的組合物不包含血清或血清替代物，或者僅包含來自分離添加至限定培養基的血清或血清替代物組分的微量血清或血清替代物。
[0190]本發明的組合物和方法還包括用于刺激可分化細胞內ErbB2酪氨酸激酶活性的方法。在一個具體實施方案中，本發明的組合物和方法包括至少一種ErbB3配體的存在。通常，ErbB3配體會結合ErbB3受體，并且與ErbB2受體二聚化。ErbB2受體進而一般負責可分化細胞內的細胞內酪氨酸激酶活性。
[0191]如本文使用的，“ErbB3配體”指能結合ErbB3的配體，ErbB3進而與ErbB2 二聚化，由此活化了 ErbB2/ErbB3異二聚體受體的ErbB2部分的酪氨酸激酶活性。ErbB3配體的非限定性實例包括神經調節蛋白-1 ;神經調節蛋白-1的剪接變體和同種型，包括但不限于HRG-β、HRG-α、Neu分化因子(NDF)、乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)、神經膠質生長因子2(GGF2)以及感覺和運動神經元衍生因子(SMDF);神經調節蛋白_2，神經調節蛋白-2的剪接變體和同種型，包括但不限于NRG2-13，外調蛋白(Epiregulin)和雙調蛋白(Biregulin)。
[0192]在一個實施方案中，用于刺激ErbB2_定向的酪氨酸激酶活性的方法包括至少一種 ErbB3 配體,其選自神經調節蛋白-1、Heregulin- β (HRG- β )、Heregulin- a (HRG- α )、Neu分化因子(NDF)、乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)、神經膠質生長因子2 (GGF2)、運動神經元衍生因子(SMDF)、神經調節蛋白-2、神經調節蛋白-2β (NRG2-13)、外調蛋白、雙調蛋白以及其變體和功能片段。在另一具體實施方案中，本發明的組合物和方法包括用于刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶活性的多種方法，諸如但不限于利用多種ErbB3配體。
[0193]在本發明的組合物和方法的更具體實施方案中，ErbB3配體是HRG-β或其變體或功能片段。在一個實施方案中，衍生培養添加蛋白、多肽或其變體或功能片段的種類與培養的細胞的種類相同。例如，如果培養小鼠ES細胞，具有與小鼠(mus musculus)HRG-^序列相同的氨基酸序列的HRG-β被用作培養添加劑，以及被視為是“相同種類的”。在其他實施方案中，衍生生物添加劑的種類不同于培養的細胞。例如，如果培養小鼠ES細胞，具有與人HRG-β序列相同的氨基酸序列的HRG-β用作培養基的添加劑，并且被視為“不同種類的”。
[0194]如本文使用的，“功能片段”是與全長多肽發揮相似生理或細胞效應的全長多肽的片段或剪接變體。功能片段的生物效應在范圍或強度上不必與全長多肽相同，只要觀測到相似得生理或細胞效應即可。例如，HRG-β的功能片段能夠可檢測地刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶。
[0195]如本文所用的，術語 “變體”包括嵌合的或融合的多肽、同系物(homolog)、類似物、直向同源物、和旁系同源物。此外，參考蛋白或多肽的變體是其氨基酸序列與參考蛋白或多肽至少約80%相同的蛋白或多肽。在具體實施方案中，變體與參考蛋白或多肽至少約85%、90%、95%、95%、97%、98%、99%甚或100%相同。如本文所用的，術語“對應于(correspond(s)to) ”和“對應于(corresponding to) ”當涉及序列比對時,意指參考蛋白或多肽,例如野生型人或小鼠神經調節蛋白-1內列舉的位置，以及與參考蛋白或多肽上的位置對齊的修飾的蛋白或多肽中的那些位置。因此，當目標蛋白(subject protein)或多肽的氨基酸序列與參考蛋白或多肽的氨基酸序列對齊時，“對應于”參考蛋白或多肽序列的某些列舉位置的序列是與參考序列的這些位置對齊但并不必然位于參考序列的這些精確數值位置的那些序列。用于確定序列間的對應氨基酸的比對序列的方法在下文有描述。
[0196]例如，具有與參考氨基酸序列(例如，編碼TGF-β的序列)至少約95% “相同”的氨基酸序列的多肽被理解為指該多肽的氨基酸序列與參考序列相同，除了該氨基酸序列可以在編碼參考TGF-β的參考氨基酸序列的每100個氨基酸中包括多達約5個修飾。換句話說，為了獲得具有與參考氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列的肽，參考序列的多達約5%氨基酸殘基可以被缺失或由另一氨基酸取代，或者可以將多達參考序列的總氨基酸約5%的多個氨基酸插入參考序列。參考序列的這些修飾可以發生在參考氨基酸序列的N-末端或C-末端位置，或者發生在那些末端位置的任一處，單獨散置在參考序列的氨基酸間，或者參考序列內的一個或多個鄰近組(contiguous group)中。
[0197]如本文所用的，“同一性(identity)”是核苷酸序列或氨基酸序列與參考核苷酸或氨基酸序列相比的同一性度量。一般而言，對比序列以獲得最高階匹配。“同一性”本身具有本領域認可的含義，并且能夠利用發表的技術來計算。(參見，例如，ComputationalMolecular Biology (計算分子生物學)，Lesk, Α.Μ.，ed.，Oxford University Press, NewYork (1988) ; Biocomputing:1nformatics And Genome Pro jects (生物計算:信息和基因組項目)，Smith, D.W.，ed.，Academic Press, New York(1993);Computer Analysisof Sequence Data(序列數據的計算機分析)，Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G.,eds., Humana Press, New Jersey(1994);von Heinje, G.，Sequence Analysis InMolecular Biology (分子生物學的序列分析)，Academic Press (1987);以及 SequenceAnalysis Primer (序列分析引物)，Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M StocktonPress, New York(1991))。盡管存在測量兩個多核苷酸或多肽序列間同一'I"生的幾種方法，但術語“同一性”為本領域技術人員所熟知(Carillo, H.&Lipton, D.，Siam J AppliedMath48:1073 (1988))。確定兩序列間同一性或相似性常用的方法包括，但不限于在Guideto Huge Computers (巨型計算機指南)，Martin J.Bishop, ed., Academic Press, SanDiego(1994)and Carillo, H.&Lipton, D., Siam J Applied Math48:1073(1988)中公開的那些。計算機程序還可以包含計算同一性和相似性的方法和算法。確定兩個序列間同一性和相似性的計算機程序方法的實例包括但不限于GCG程序包(Devereux, etal.1984，Nucleic Acids Researchl2:387)、BLASTP, ExPASy, BLASTN、FASTA (Atschul, etal.1990, J Molec Biol215:403)和FASTDB。確定同一性和相似性的方法的實例討論于Michaels&Garian, 2000, Current Protocols in Protein Science (蛋白質科學最新方法)，Voll，John Wiley&Sons, Inc.,其通過引用并入本文。在本發明的一個實施方案中,用于確定兩個或更多個多肽間同一性的算法是BLASTP。
[0198]在本發明的另一實施方案中，用于確定兩個或更多個多肽間同一性的算法是FASTDB,其基于 Brutlag 等的算法(1990，Comp.App.Biosc1.6:237-245，其通過引用并入本文)。在FASTDB序列比對中，查詢 序列和目標序列(subject sequence)是氨基酸序列。序列比對的結果是同一性百分比。可以用于計算同一性百分比的氨基酸序列的FASTDB比對的參數包括但不限于矩陣(Matrix)=PAM, k_維(tuple) =2，錯配罰分(MismatchPenalty) =1,聯合罰分(Joining Penalty) =20,隨機組長度(Randomization GroupLength) =0,截止分數(Cutoff Score) =1,空位罰分(Gap Penalty) =5，空位大小罰分(GapSize Penalty)0.05,窗口大小(Window Size) =500或目標氨基酸序列的長度,無論哪個更短。
[0199]如果目標序列由于N-末端或C-末端添加或缺失而不是由于內部的添加或缺失而短或長于查詢序列，可以進行人工校正，因為當計算同一性百分比時，FASTDB程序不計算目標序列的N-末端和C-末端截斷或添加。對于5’或3’末端截斷的目標序列，相對于查詢序列，通過將在不匹配/對齊的參考序列的N末端和C末端的查詢序列堿基的數目計算為查詢序列總堿基的百分比，來校正同一性百分比。FASTDB序列比對的結果確定匹配/對齊。然后從同一性百分比減去對齊百分比以達到最終同一性百分比分數，這通過利用指定參數的上述FASTDB程序來計算。該校正的分數能夠用于以下目的:確定對比結果如何彼此“對應”，以及同一性百分比。處于人工調整同一性百分比分數的目的，可以考慮分別延伸超過參考或目標序列的N-或C-末端的查詢(受試)序列或參考序列的殘基。也就是說，當人工調整同一性百分比得分或對齊數目時，可以計數不與對照序列的N或C末端匹配/對齊的殘基。
[0200]例如，將90個氣基酸殘基的目標序列與100個殘基的參考序列比對，以確定同一性百分比。缺失發生在受試序列的N-末端，因此，FASTDB比對沒有顯示N-末端前10個殘基的匹配/對齊。10個不成對的殘基表示序列的10% (N-和C-末端的不匹配殘基數目/查詢序列的殘基總數目)，從而將10%從FASTDB程序計算出的同一性百分比中減除。如果剩余的90個殘基完全匹配，則最終的同一性百分比會是90%。在另一實施例中，90個殘基的目標序列與100個殘基的參考序列比較。這一次，缺失是內部缺失，因此在不與查詢序列匹配/對齊的受試序列沒有N-或C-末端。在這種情況下，不人工校正通過FASTDB計算的同一性百分比。
[0201]本發明還提供了嵌合的或融合的多肽。如本文所用的，“嵌合”多肽或“融合多肽”包含參考多肽一成員的至少一部分，所述參考多肽可操作地連接到第二不同多肽。第二多肽具有對應于與參考多肽基本上不相同的且衍生自相同或不同的生物體的多肽的氨基酸序列。關于融合多肽，術語“可操作地連接”意指參考多肽和第二多肽彼此融合，以使兩序列實現歸因于所使用序列的提議的功能。第二多肽可以融合到參考多肽的N-末端或C-末端。例如，在一個實施方案中，融合多肽是GST-1GF-1融合多肽，其中IGF-1序列融合到GST序列的C-末端。這種融合多肽能夠促進重組多肽的純化。在另一實施方案中，融合多肽能夠在N-末端包含異源信號序列。在某些宿主細胞中(例如，哺乳動物宿主細胞)，能夠通過利用異源性信號序列增加多肽的表達和/或分泌。
[0202]除了片段和融合多肽外，本發明還包括天然存在多肽的同系物和類似物。“同系物”在本文被定義為分別具有相似或“相同的”核苷酸或多肽序列的兩個核酸或多肽。同系物包括等位變體、直系同源物、旁系同源物、如下文定義的激動劑和拮抗劑。術語“同系物”還包括由于遺傳密碼的兼并性而不同與參考核苷酸序列的核酸分子，以及由此編碼與參考核苷酸序列編碼的多肽相同的多肽。如本文所用的，“天然存在的”指存在于自然界的核酸或氨基酸序列。
`[0203]多肽的激動劑能夠保留基本上相同的多肽的生物活性，或多肽的生物活性的子集。多肽的拮抗劑能夠抑制天然存在形式的多肽的一種或多種活性。
[0204]在本發明的組合物和方法的另一更為具體的實施方案中，ErbB3配體是HRG-β或其變體或功能片段。ErbB3配體另外的非限定性實例披露于美國第6，136，558,6, 387，638和7，063，961號專利中，這些專利通過引用并入本文。
[0205]基于在其C-末端部分不同的兩種變異EGF-樣結構域,Heregulins —般被分類為兩種主要類型:α和β。然而，這些EGF-樣結構域在包含其中的六個半胱氨酸殘基的間隔中是相同的。基于氨基酸序列比較，Holmes等發現在EGF-樣結構域的第一和第六個半胱氨酸間，HRGs與肝素結合EGF-樣生長因子(HB-EGF) 45%相似，與雙調蛋白(AR) 35%相同，與TGF- α 32%相同，與EGF27%相同。
[0206]44kDa的neu分化因子(NDF)是人HRG的大鼠等同物。與HRG多肽一樣，NDF具有免疫球蛋白(Ig)同源結構域，隨后是EGF樣結構域，并且缺乏N-末端信號肽。目前，至少有六種不同的成纖維細胞的pro-NDFs，基于EGF樣結構域的序列，分類為α或β多肽。基于EGF樣結構域和跨膜結構域間的一段可變序列，分類為同種型I至4。因此，看起來，不同的NDF同種型通過可變剪接產生，并且可以實施截然不同的組織特異性功能。參見，歐洲專利第505148號；以及國際專利
【發明者】托馬斯·C·斯庫爾茲 申請人:韋爾賽特公司