專利名稱：一種高淋巴道轉移的人肝癌細胞系的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及從淋巴結轉移灶中建立具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系。
背景技術：
90年代以來，原發性肝癌已成為我國死亡率居第二位的惡性腫瘤。原發性肝癌惡性度高，進展快，手術切除是最有效的治療措施。但即使是直徑小于5cm的小肝癌，手術后的5年復發率也高達40-50％。術后復發轉移是阻礙肝癌患者生存期的最大的障礙。肝癌的轉移途徑主要有血道轉移、淋巴道轉移、直接侵潤和種植等。臨床實踐表明，淋巴道轉移在肝癌患者中并不少見，Kojiro等進行了660例肝癌尸檢，其中淋巴道轉移率為58.3％。但大多數肝癌轉移方面的研究都是關于肝癌血道轉移機理的研究，而肝癌淋巴道轉移機理的研究沒有得到相應的重視，這同缺乏良好的肝癌淋巴道轉移模型系統有關。
肝癌的動物模型和細胞模型的研究已有近40年的歷史，現已建成了許多穩定的肝癌動物模型和細胞系，但絕大多數動物模型不發生轉移，其中發生淋巴道轉移的動物模型和細胞系更是很少見報道。Seki等從人肝癌淋巴結轉移灶中建立了4株腫瘤細胞系PLC/PRF/5、HuH-7、OCUH-16和Nuk-1，但均無明確的淋巴道轉移能力。師長宏等將HCC-9724-P細胞株原位注射于裸鼠肝臟，建成廣泛轉移模型。凌茂英等將小鼠H22肝癌細胞系接種于615小鼠爪墊皮下，建成了淋巴道轉移模型，并建成淋巴道高轉移細胞系H22/F20、Hca-F25/L，從Hca-F25/L中分離出淋巴道轉移能力不同的5個克隆株。
然而，縱觀國內外的人肝癌模型，尚無有明確的淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系，肝癌淋巴道轉移的研究缺少良好的實驗平臺。
發明內容
本發明的目的是建立具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系，為肝癌淋巴道轉移的研究建立良好的實驗平臺，以利對肝癌轉移的機理進行深入研究。
本發明采用裸小鼠體內連續篩選法，將具有多向高轉移潛能的HCCLM6細胞系(復旦大學肝癌研究所)，接種于裸小鼠淋巴管豐富，血管較少的爪墊部位，由于該部位特殊的組織結構，相當于持續向腫瘤細胞施加淋巴道轉移的壓力，而解除了血道轉移的壓力，經過數輪爪墊部位的連續篩選，獲得在一定時間內穩定的具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系，命名為淋巴道高轉移潛能人肝癌細胞系(HCCLYM，human hepatocellular carcinoma cell line with high lymphaticmetastasis potential)，保藏號CGMCC No.1061。
經檢測，HCCLYM細胞系具備下列生物學特性體外培養時為典型的多邊形上皮樣細胞，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，細胞平均直徑38±2微米；核型分析結果顯示HCCLYM細胞為亞三倍體核型，染色體數目范圍45-68條，主流染色體數目為56-60，占78％；細胞群體倍增時間31.6小時，克隆形成率54±4％，流式細胞分析表明，細胞周期各時相的百分率分別為凋亡細胞G1期54.25％，S期25.56％，G2-M期10.45％；明膠酶譜法檢測表明HCCLYM細胞可分泌大量基質金屬蛋白酶(MMPs)，其中以MMP-9及其活性型為主；PCR法檢測細胞基因組中有HBV DNA整合；免疫細胞化學染色表明，HCCLYM細胞AFP表達強陽性。
HCCLYM細胞系肝臟原位移植成瘤率100％，5周后裸鼠發生肝門、幽門、腸系膜、脾門和鎖骨下淋巴結100％轉移。
結果表明，本發明細胞系具備特殊的轉移表型，即接種于裸鼠肝臟原位可發生100％淋巴結轉移。為深入研究肝癌淋巴道轉移的機理，預防和治療肝癌淋巴道轉移提供了理論和實踐基礎。
圖1為培養的HCCLYM細胞其中，Giemsa染色，200×，多邊形上皮樣細胞，貼壁生長，細胞核大而深染，核仁明顯，可見病理性核分裂像。
圖2為HCCLYM細胞系肝臟原位種植5周后轉移結果A為原位移植瘤，轉移的肝門淋巴結B為原位移植瘤，轉移的幽門淋巴結C為多個腸系膜根部和腸系膜轉移淋巴結D為轉移淋巴結常規病理切片，HE染色，100×，可見淋巴結的大部分區域被轉移的腫瘤細胞所占據，只有少量淋巴結組織，但淋巴結外膜完整。
具體實施例方式
實施例1 建立高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系1.裸小鼠爪墊皮下部位接種取HCCLM6細胞3×106/0.05毫升接種于裸小鼠右側爪墊內側皮下部位。裸小鼠為BALB/C-nu/nu，雄性，4-6周齡，購于中國科學院上海藥物研究所，無特殊病原體環境下飼養。5周后，無菌操作取裸鼠同側腘窩、腹股溝、髂總、腎門等處轉移淋巴結。
2.體外原代培養擴增轉移淋巴結中的腫瘤細胞將上述轉移的淋巴結置無菌平皿內，PBS清洗，剔除淋巴結外的結締組織，在200目不銹鋼篩網研磨，用含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)的高糖DMEM培養液(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)沖洗篩網，制成單細胞懸液。將上述細胞懸液移入24孔板內，1毫升/孔，常規培養。24小時后換液，沖洗孔底，除去不粘附的淋巴細胞和細胞碎屑，繼續培養、匯合后，移至6孔板逐級擴大培養，移至25平方厘米培養瓶常規培養。在腫瘤細胞擴增時聯合應用機械刮除法和梯度消化法除去混雜的成纖維細胞。前者是先在倒置顯微鏡下劃出成纖維細胞密集的區域，再用橡皮擦子刮除之；后者是應用胰酶消化時腫瘤細胞和成纖維細胞脫壁時間不同的特性，控制消化時間，分離兩種細胞。
3.步驟2中擴增的腫瘤細胞接種于裸小鼠爪墊，方法同步驟1。重復上述過程8輪。
4.細胞建系經上述8輪篩選后，腫瘤細胞常規傳代培養，培養液為高糖DMEM培養液(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)加10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)，培養溫度為37℃，氣體環境為5％CO2/95％空氣，濕度為飽和濕度，隔天更換培養液，每4-5天傳代一次，常規凍存后復蘇成活良好。
經上述連續裸小鼠淋巴道轉移篩選，建立了本發明具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系。
實施例2HCCLYM細胞系肝臟原位移植裸小鼠模型1.體外常規培養條件為含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)的高糖DMEM培養液(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)，37℃，5％CO2/95％空氣，飽和濕度。
2.生長至對數生長期的HCCLM3細胞，用0.25％胰酶+0.1％EDTA常規消化，PBS洗滌細胞，臺盼蘭排除法計數活細胞，制備細胞懸液，濃度為2.5×107/毫升。
3.取上述細胞懸液0.2毫升(5×106個)，接種于4-6周齡BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠的背部近腋部皮下，無特殊病原體環境下飼養。
4.2周后皮下瘤生長至直徑約1.0cm，取皮下瘤切成直徑1mm的瘤組織小塊原位接種于裸小鼠肝臟左葉，5周后，取肺臟及肝門、幽門、腸系膜、脾門、鎖骨下等處淋巴結，10％福爾馬林溶液固定，連續切片，常規HE染色后顯微鏡下觀察轉移情況。
表1為HCCLYM細胞系的具體轉移情況的鑒定數據。
表1接種劑量5×106細胞/0.2ml接種裸鼠數(只) 10成瘤率 100％(10/10)5周后瘤直徑(厘米) 1.25±0.45淋巴結轉移率100％(10/10)肝門80％(8/10)幽門60％(6/10)腸系膜 30％(3/10)脾門30％(3/10)左鎖骨下10％(1/10)5周后的肺轉移率 40％(4/10)
權利要求
1.一種高淋巴道轉移的人肝癌細胞系(CGMCC No.1061)，其特征是肝臟原位移植成瘤率100％，肝門、幽門是、腸系膜、脾門和鎖骨下淋巴結轉移率100％。
2.按權利要求1所述的一種高淋巴道轉移的人肝癌細胞系，其特征是所述肝臟原位移植是裸小鼠肝臟原位移植，所述淋巴結轉移是裸小鼠淋巴結轉移。
3.按權利要求1所述的一種高淋巴道轉移的人肝癌細胞系，其特征是還具備下列生物學特性體外培養時為典型的多邊形上皮樣細胞，亞三倍體核型，主流染色體數目為54-57，可分泌基質金屬蛋白酶，基因組中有HBV DNA整合，AFP表達強陽性。
4.權利要求1所述的細胞系，其特征是通過下述方法建立，(1)HCCLM6細胞接種于裸小鼠爪墊皮下，5周后取轉移淋巴結；(2)上述轉移淋巴結制備成單細胞懸液，體外原代培養擴增轉移淋巴結中的腫瘤細胞；(3)步驟2中擴增的腫瘤細胞接種于裸小鼠爪墊，方法同步驟1。重復上述過程8輪；(4)上述8輪篩選后，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養液，37℃，5％CO2/95％空氣，飽和濕度傳代培養腫瘤細胞。
全文摘要
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及從淋巴結轉移灶中建立具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系。本發明采用裸小鼠體內連續篩選法淋巴道轉移篩選，建立了具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系HCCLYM，保藏號CGMCCNo.1061。其原位種植于裸鼠肝臟可發生100％淋巴結轉移，是目前首例具有高淋巴道轉移潛能的人肝癌細胞系。為深入研究肝癌淋巴道轉移的機理，預防和治療肝癌淋巴道轉移提供了理論和實踐基礎。
文檔編號C12N5/08GK1546653SQ20031010929
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月12日 優先權日2003年12月12日
發明者田波, 湯釗猷, 田 波 申請人:復旦大學附屬中山醫院