一種人肝癌細胞系hlcz01及其應用的制作方法

專利名稱：一種人肝癌細胞系hlcz01及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物動物細胞領域，尤其涉及一種人肝癌細胞系及其應用。
背景技術：
肝臟具有多種重要的生理功能，主要包括:合成和分泌大量的血清蛋白，如白蛋白和脂蛋白；合成和轉運與蛋白結合的脂質；解毒功能；合成分泌膽汁；合成糖來調節血糖；分解氨基酸合成尿素；激活維生素；合成和分解糖原；合成谷胱甘肽和金屬硫蛋白等。隨著生物技術的進步，利用基因重組和細胞融合的方法可以生產很多有用的生物制品，但相比之下，動物細胞培養技術比以前顯得更加重要。考慮到肝臟具有比其他器官更多的生理功能，包括其顯著的合成和分泌胞漿蛋白的功能，且擁有更強的合成白蛋白、脂蛋白、運輸脂質、尿素、糖原、谷胱甘肽的能力和更強的代謝能力，這使得使研究者更有興趣利用肝臟細胞培養生產上述產品。基于此，為了研究肝臟功能并生產相關的生物制品，需要培養肝細胞。然而，目前的細胞培養技術并不能在肝細胞的培養時期生產出血漿蛋白等生物制品，正常肝細胞離體后活力極速下降，這導致相關產品的獲得變得十分困難。肝臟也是成人體內少數可以再生的器官，但是在培養皿中培養的肝細胞傳代次數有限，不能反復培養。已有的一些肝細胞系由于是非人源的或與人肝細胞相差較大而不能廣泛應用。目前已有一些來源于實驗動物的肝細胞系，比如來源于大鼠(Tsao et.al., Exp.Cell Res.,1984,154:38-52 ；Enat et al., Proc.Nat.Acad.Sci USA，1984,87:1411-1415)，利用無血清培養基建立的來源于成年大鼠肝臟的大鼠上皮細胞(Chessebeuf and Padieu, InVitro, 1984, 20:780-795 ；Enat et al., Proc.Natl.Acad.Sc1., 1984,81:1411-1415)。大鼠月干細胞中還可轉入SV40DNA(Woodworth et al.,Cancer Res.,1987,46:4018-4026 ；Ledleyet al., Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 1987,84:5335-5339)，但是由于和人的肝細胞代謝不同，這種細胞不能用于研究人體內藥物代謝和肝癌生成。此外，人肝細胞無性繁殖也已有相關報道(Kaighn and Prince, Proc.Nat.Acad.Sc1., 1971,68:2396-2400)，長期培養的人胎肝也已經建立(Salas-Prato, M.et al.，InVitro Cell Dev.Biol., 1988, 24:230-238 ；Sells,M.A.et al.,InVitro Cell Dev.Biol.,1985,21:216-220),但是由于胎肝和成年肝在代謝方面的差異，使得胎肝在腫瘤生成和毒理研究方面的應用受到局限，成年肝更易用于腫瘤生成和毒理研究。為了尋找替代肝細胞的研究模型，研究者建立了來源于肝癌、且與正常肝細胞有相同功能(比如分泌白蛋白功能)的細胞系。目前已建立有多種肝癌細胞系(e.g.，Knowles et al., U.S.Pat.N0.4, 393, 133, issued Jul.12,1983 ；Knowles B.B.et al.,Science,1980,209:497-499 ；Monjardino J.and CrawfordE., Virology,1979，96:652-655 ；Park J.G.et al., Int.J.Cancer, 1995,62:276-282 ；Zhong et al., PNAS,2005,102(26):9294-9299 ；Fuand Cheng, Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2000,44(12):3402-3407)，比如肝癌細胞系 HepG2 (U.S.Pat.N0.4393133)。進一步利用 HepG2 的研究也已有相關報道(Kelly et al.，In Vitro Cell, and Dev.Biol.，1989，25:217-222 ；U.S.Pat.N0.5，290，684 ;and Darlington et al.，In Vitro Cell, and Dev.Biol.，1987，2-3:349-354)。另外，Nakabayashi 建立了肝癌細胞系 Huh7 (Cancer Research，1982，42:3858-3863) o綜觀現有的出版文獻，已有的肝癌細胞系包括但不限于:HLF(OkayamaUniversity, medical school:1975)，HLE, c_I (Okayama University, medical school:1975)，HuH-6clone5(Okayama University, medical school:1976), HuH-7(OkayamaUniversity,medical school: 1979)，C_HC_4(Hokkaido University,school of medicine:1979)，HCC-M(Keio University, school of medicine:1980)，JHH-1 (The Tokyo JikeiUniversity School of Medicine:1980)， JHH-2(The Tokyo Jikei University Schoolof Medicine: 1982)，JHH-4 (The Tokyo Jikei University School of Medicine:1983)，KIM-1 (Kurume University, school of medicine: 1983)，JHH-5 (The TokyoJikei University School of Medicine: 1984)，JHH-6 (TheTokyo Jikei UniversitySchool of Medicine: 1984)，0HR(Showa University, school of medicine: 1985)，KMCH-1(Kurume University, school of medicine: 1985)，KMG-A(Kurume University,school of medicine:1985)，JHH-7(The Tokyo Jikei University School of Medicine:
1986)，JHC-1(TheTokyo JikeiUniversity School of Medicine: 1986)，KYN-1(KurumeUniversity, school of medicine: 1986)，KYN-2(Kurume University, school ofmedicine: 1987), HCC-T (Keio University, school of medicine:1986), HPT-NT/D3 (Kyushu University, faculty of medicine: 1986)，Hep-tabata(Mie University,Faculty of Medicine:1986), HuCC-Tl (Toyama Medicine and PharmaceuticalUniversity,faculty of medicine: 1987)，HuH-28(Okayama University,medical school:
1987).上述相關數據可參見人類細胞Vol.1, N0.1，ρ.106-126,1988。已有大量的研究利用生物反應器培養肝細胞來制造人工肝。人工技術已在腎臟、心臟和肺移植方面取得進展。利用人造肝和其他技術長期保留肝功能已有報道(例如，Anand A.C.，Indian J. Gastroenterol.，2003，22Suppl2:S69_74 ；Ueda et al.，ASAIOJ, 2003,49 (4):401-6 ；Tilles et al.，J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.，2002，9 (6):686-96 ；Metab.Brain Dis.，2005，20(4):327-35 ；and Park and Lee，J.Biosci Bioeng.，2005,99(4):311-9) o 肝輔助設備也有過相關報道(例如，Lu et al.,Tissue Eng.,2005,11(11-12):1667-77 ；Pless and Sauer, Transplant Proc.，2005，37(9):3893-5 ；Millisand Losanoff，Nat.Clin.Pract.Gastroenterol Hepatol.，2005，2 (9):398-405 ;andGeorge J.，J.Assoc.Physicians India，2004，52:719-22)。這些肝輔助設備在移植手術中經常用到。例如，人造肝和肝輔助設備能讓爆發性肝衰竭病人在手術前保持清醒和鎮定；能讓病人在移植手術后穩定，特別是在對再灌注沒有反應的情況下，也可在某些情況下代替肝移植。為了更好地利用生物人造肝和肝輔助器，需要發明輕便小巧的生物反應器。因此要求所培養細胞在反應器內產生急需和足夠的肝特異蛋白。人正常肝細胞的缺乏使肝癌細胞在此應用上具有很大潛力。研究者已經成功地利用HepG2細胞在這種裝置中生產抗凋亡蛋白 Bcl-2 (Terada S.，J.Biosc1.Bioeng.，2003，95 (2):146-51) 肝癌是一種常見的腫瘤，多數肝癌是由肝炎病毒引起的，如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV);目前尚無有效的療法。HCV感染是一種主要的人類感染疾病，尚無有效疫苗進行防治。已有部分證據證明了細胞免疫清除肝炎病毒的重要性，但是病人體內抗體介導的抗病毒反應機制尚不明確。多數病人體內的抗體可以中和病毒抗原，但是血清中中和抗體的含量和強度未知，缺乏支持病毒感染的細胞或動物模型限制了對中和抗體的研究。盡管已有一些來源于人肝癌的細胞系，但這些已有的細胞系多數是低分化的且肝細胞功能不健全。據我們所了解的情況，目前尚無一株可以支持HBV和HCV感染的細胞系， 這也限制了抗病毒藥物的研發和應用。盡管有部分的研究小組利用人原代肝細胞檢測到了少量HCV復制，但是還沒有能支持野生型HCV大量復制的細胞系(Tagawa M.etal., J.Gastroenterol Hepatol, 1995,10:523-527 ；Ito T.et al., J.Gen.Virol., 1996,77 (Pt.5):1043-1054 ；Ito Τ.et al., Hepatology, 2001, 34:566-572) 2005 年，兒個研究小組成功地在細胞系中呈現了 2a型HCVJFH1的生理周期(Heller T.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2005，102:2579-2583 ；ffakita T.et al.，Nat.Med.，2005，11(7):791-796 ；Zhong J.et al., PNAs,2005,102(26):9294-9 ;Lindenbach B.D.et al., Science2005,309(5734):623-6)。目前,唯一能支持HCV感染的動物模型是黑猩猩(Lanford R.E.et al.,Virology,2002,293:1-9)。這種動物模型的優點是呈現了病毒的真實生理周期，盡管與感染人的病理表現不同(Alter M.J.et al., N.Eng.J.Med., 1999, 341:556-562 ；Bassett S.E.et al.,J.Virol.,1998,72:2589-2599)，但這種模型針對病毒感染后宿主的免疫反應提供了大量解釋。利用此種模型的最大限制是大猩猩來源少，且價格昂貴。樹駒是接近靈長類的一種小動物，很容易適應實驗室環境。有研究表明樹駒也能感染多種人類病毒，包括肝炎病毒(dieZ.C.et al.，Virology,1998，244:513-520)。表達HCV核心蛋白的轉基因鼠已被用來研究肝臟病理和腫瘤生成(Lemon S.M.etal.，Trans.Am.Clin.Cl imatol.Assoc.，2000，111:146-156)。多數轉基因動物沒有顯示對肝細胞的毒性，有一種模型顯示出淋巴細胞炎癥和肝細胞壞死(ZhaoX.et al.，J.Clin.1nvest, 2002,109:221-232)，另外兩種模型顯示出脂肪變性和肝癌(Moriya K.etal.，J.Gen.Virol, 1997，78 (Pt.7):1527-1531 ；Moriya K.et al.，Nat.Med.，1998,4:1065-1067)。利用HBV轉基因小鼠模型極大地開闊了對HBV引起的免疫疾病發生機理的研究(Chisari F.V.et al., Science, 1985, 230:1157-1160 ；Chisari F.V.et al.，H印atology，1995，22:1316-1325)。轉基因小鼠在HCV免疫學方面尚未被廣泛應用，對病毒蛋白的免疫耐受成為利用小鼠動物模型研究的一個問題。以上現有的研究結果表明，獲得具有肝癌類似功能的肝癌細胞系和動物模型是極為有利的。這些細胞系的潛在應用包括但不局限于:篩選和評價抗腫瘤藥物；在細胞系中培養HBV、HCV，模擬病毒的自然感染方式；篩選和評價抗病毒藥物；研究肝細胞的代謝動倉泛。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種高分化、可在體外培養、具有肝臟的功能特性、可被肝炎病毒感染的人肝癌細胞系HLCZOI，還相應提供該人肝癌細胞系HLCZ01在細胞模型、動物模型、制備篩選抗病毒和抗腫瘤藥物等方面的應用。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種人肝癌細胞系HLCZOlJf述人肝癌細胞系HLCZOl為保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)、且保藏號為CCTCCNO:C201309的人肝癌細胞系。該人肝癌細胞系HLCZOl的保藏單位為中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏單位的地址位于中國武漢大學，保藏日期為2013年I月17日，該人肝癌細胞系HLCZOl被命名為人肝癌細胞系HLCZOl。上述的人肝癌細胞系HLCZ01, —方面它屬于高分化的人肝癌細胞系；另一方面，該人肝癌細胞系HLCZOl可被肝炎病毒感染，所述肝炎病毒特別是指乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV),包括丙肝病毒2a型和乙肝病毒各型在內均可感染。HBV和HCV可在本發明的人肝癌細胞系HLCZOl中大量復制。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的人肝癌細胞系HLCZOl作為支持肝炎病毒感染的細胞模型的應用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒(特別是包括丙肝病毒2a型和乙肝病毒各型在內均可感染)。本發明的人肝癌細胞系HLCZOl支持HBV和HCV的完整生活周期；通過在細胞模型中培養HBV和HCV，可模擬病毒的自然感染方式。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的人肝癌細胞系HLCZOl作為建立支持病毒感染的動物模型的應用。所述病毒優選包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。具體的，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可用于非人類的動物模型，將人肝癌細胞系HLCZOl植入或轉入動物體內(比如小鼠體內)，可用于建立支持病毒感染的動物(例如小鼠)模型。利用本發明人肝癌細胞系HLCZOl建立的動物模型有利于進行肝臟病理學和肝炎病毒學研究。如前所述，由于人肝癌細胞系HLCZOl支持HBV和HCV的完整生活周期，因此，人肝癌細胞系HLCZOl中可以重現HBV和HCV的關鍵病理過程，使得含有該人肝癌細胞系HLCZOl的動物模型可用于研究人體對HBV和HCV的抗病毒反應。作為一個總的技術構思，正是基于`本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可以作為支持肝炎病毒感染的細胞模型或作為建立支持病毒感染的動物模型進行應用，這便有利于臨床篩選抑制或干預HBV和HCV的藥物(包括病毒疫苗及其他輔助試劑)，因此，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl還可在制備、篩選或評價抗肝炎病毒藥物中進行應用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。作為一個總的技術構思，本發明上述的人肝癌細胞系HLCZOl可在培養基中體外培養，進而可被用于預測化合物對細胞的致癌和致畸研究；通過化學致癌研究可進一步用于制備、篩選或評價抗腫瘤藥物。作為一個總的技術構思，本發明上述的人肝癌細胞系HLCZOl具有肝臟的重要功能和特性，可將氨轉化為尿素；而將氨代謝為尿素的功能使其成為制造人造肝或肝輔助設備的有利工具，以用于臨床或科研。因此，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl還可在人造肝的制備中進行應用。除上述基本的應用方式外，本發明上述的人肝癌細胞系HLCZOl還可用于研究肝細胞代謝(例如評價化合物在肝臟中的代謝激活作用)及其他代謝功能研究、肝細胞中肝炎病毒生存復制研究、人類寄生蟲研究等；還可在在細胞中轉入外源基因研究其功能；由于本發明的人肝癌細胞系HLCZOI可以表達細胞色素P450、CyPlAl、CyPlBl和CyP2C9蛋白，因此，該人肝癌細胞系HLCZOl還可應用于需要進行大量同源細胞實驗的場合，例如藥物代謝研究，
與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明篩選、得到了一種具有開創性意義的人肝癌細胞系HLCZ01，該人肝癌細胞系HLCZOl不僅屬于高分化的人肝癌細胞系，而且可在培養基中體外培養；其具有肝臟的重要功能和特性，可將氨轉化為尿素，可以表達細胞色素P450、CyPlAl、CyPlBl和CyP2C9蛋白，更重要的是其可被肝炎病毒感染，HBV和HCV可在其中大量復制；由于本發明人肝癌細胞系HLCZOl所具有的特殊性能，使得本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可廣泛應用于抗病毒、抗腫瘤藥物的制備、研發、篩選和評價，可用于制備生物人造肝等各種臨床治療用生物制品，本發明的篩選培養的人肝癌細胞系HLCZOl比其他動物肝細胞更有利于研究人肝臟代謝功能和疾病發展過程。一種人肝癌細胞系HLCZ01，其保藏單位為中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，地址為中國武漢大學，保藏號為CCTCC NO:C201309，保藏日期為2013年I月17日。


圖1為本發明實施例中通過RT-PCR檢測三種細胞中基因ALB和AAT的對比檢測結果，其是在凝膠成像儀下拍攝到的電泳圖。圖2為本發明實施例中通過Western Blot檢測三種細胞中ALB和AAT蛋白表達的對比檢測結果。圖3為本發明應用實施例1中人肝癌細胞系感染HCV后病毒拷貝量隨培養時間的變化曲線。圖4為本發明應用實施例1中人肝癌細胞系感染HCV后免疫熒光的檢測結果，其中，左圖表示以抗丙肝病毒NS5A的抗體檢測病毒感染細胞內的病毒；中圖表示以DAPI襯染細胞核；右圖表示將左圖與中圖合并后的圖像。圖5為本發明應用實施例2中HLCZOl細胞被來源于!fepaG2.2.15細胞內的HBV感染后PCR定量檢測結果。圖6為本發明應用實施例3中兩種人肝癌細胞系感染HCV后病毒拷貝量隨培養時間的變化曲線。圖7為本發明應用實施例3中人肝癌細胞系感染HBV和HCV后免疫熒光的檢測結果，其中四張圖片從左至右依次為:以針對丙肝病毒的NS5A抗體檢測細胞內丙肝病毒；以乙肝病毒核心蛋白抗體檢測細胞內乙肝病毒；以DAPI襯染細胞核；左側三張圖片合并得到的圖片，其中個別細胞可以被兩種病毒同時感染。
圖8為本發明應用實施例1中以HLCZOl細胞制備人源化小鼠被丙肝病毒感染后，小鼠血清中病毒含量隨感染時間的變化曲線。圖9為本發明應用實施例2中HLCZOl細胞內乙肝病毒含量隨干擾素用量和處理時間的變化關系圖。圖10為本發明應用實施例1中HLCZOl細胞內丙肝病毒含量隨干擾素用量和處理時間的變化關系圖。圖11為本發明應用實施例4中流式檢測HLCZOl細胞對TRAIL的敏感性結果。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料或生物制劑，如無特殊說明，均為可從市場上購得的常規試劑。以下實施例中的定量實驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中所用的主要實驗材料與試劑:(I)細胞培養:人肝癌細胞系HLCZOl (已保藏)、Huh7.5細胞(Huh7.5細胞從美國洛克菲勒大學Charles Rice教授實驗室饋贈得到)，HCVcc (JFH1病毒上清，HCV材料從日本傳染病國立中心Takaji Wakita教授實驗室饋贈得到)，IOOmm細胞培養板(Costar公司)，60mm細胞培養板(Costar公司)，六孔細胞培養板(Costar公司)，DMEM培養基(Invitrogen公司)、青霉素和鏈霉素(Invitrogen公司)、谷氨酰胺(Invitrogen公司)、羊血清(Invitrogen公司)、胰蛋白酶(Invitrogen公司)、非必需氨基酸(Invitrogen公司)U XPBS (Hyclone 公司)；(2)細胞總RNA提取:TRIZ0L (Invitrogen公司)、異丙醇(上海生工)、無水乙醇(上海生工)、DEPC (上海生工);(3) Reverse Transcription PCR 和 Real Time PCR: Invitrogen RT-PCR 試劑盒(Invitrogen 公司)、SYBR Premix Ex Taq (Taraka 公司)、200μ L PCR 八聯管(Eppendorf公司)；(4)細胞總蛋白提取:RIPA裂解液(Thermo公司)、蛋白酶抑制劑(Merck公司)、蛋白濃度測定試劑(Bio-Rad公司);(5) Western Blot:PVDF膜(Bio-Rad公司)、抗ALB抗體(SANTA CRUZ)、抗AAT抗體(SANTACRUZ)、抗HCVNS5A抗 體(美國佛羅里達大學饋贈)，二抗goat ant1-mouse IgG(HRP)(Invitrogen 公司)、Western Blot 化學發光底物(Thermo 公司)、Western Blot 曝光機(Keda 公司)；(6)免疫熒光:載玻片和蓋玻片(SPI Supplies公司)、免疫組化筆(ZL1-9305，PAPPen)、I XPBS(Hyclone 公司)、羊血清(Invitrogen 公司)、抗 HCVNS5A 抗體(自制)、二抗goat ant1-mouse IgG (FITC) (Invitrogen 公司)、DAPI (Invitrogen 公司)。實施例:本實施例獲得了一種本發明的人肝癌細胞系HLCZ01，該人肝癌細胞系HLCZOl已保藏于中國典型培養物保藏中心，且保藏號為CCTCC NO:C201309，保藏單位的地址位于中國武漢大學，保藏日期為2013年I月17日，該人肝癌細胞系HLCZOl被命名為人肝癌細胞系 HLCZOI。HLCZOl細胞系的建立與培養方法1.取一男性肝癌患者手術切除的新鮮手術標本，PBS洗一次，將組織塊用手術刀切成Imm3的小塊鋪于已用膠原蛋白處理過的培養皿(100毫米)內，加入8ml新鮮培養基，同時加入表皮生長因子，終濃度為10ng/ml ；2.培養2天后換新鮮培養基，以后每3天換新鮮培養基；3.觀察培養皿中長出細胞克隆后，PBS洗一次細胞，將0.25%胰酶滴于細胞克隆上，置培養箱中約Imin后取出，用移液槍吸取新鮮培養基將消化后的克隆沖起吸出，轉移到12孔板中繼續培養；
4.帶細胞在12孔板中長滿后轉移至六孔板中，長滿后再擴大至IOcm培養皿中；5.將I X IO7個細胞接種到NOD-SCID鼠皮下，約45天后長出明顯腫塊，取出腫塊后繼續按照人肝癌組織培養方法培養而得到HLCZOl細胞。通過RT-PCR檢測本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl中含有肝細胞特異基因ALB和AAT，具體過程如下:將人肝癌細胞系Huh7、本發明的人肝癌細胞系HLCZOl和中國倉鼠卵巢細胞系CHO (從美國ATCC購買)平鋪于六孔細胞培養板中(30萬/孔)，每種細胞各鋪占兩孔；培養24h后，三種細胞各取一孔，用TRIZOL提取細胞總RNA，然后取IygS RNA逆轉錄成cDNA，以I μ L cDNA為模板進行PCR，擴增ALB和AAT基因，擴增后的結果如圖1所示。由圖1可見，人肝癌細胞系Huh7和人肝癌細胞系HLCZOl中均能擴增出肝細胞特異基因ALB和AAT，而非肝癌細胞系CHO中不能擴出這兩種基因。通過Western Blot證實本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl中可表達肝細胞特異蛋白ALB和AAT，具體過程如下:取上述六孔細胞培養板中剩余三孔的三種細胞，用RIPA Buffer裂解細胞，將細胞裂解液置于冰上15min,然后以13000rpm離心15min(4°C ),取上清轉入新EP管中；Lowry法測蛋白濃度，分別取50 μ g蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，最后用Ant1-ALB、Ant1-AAT —抗和帶HRP標記的二抗來檢測各蛋白樣品中ALB和AAT的表達，結果如圖2所不，由圖2可見，人肝癌細胞系Huh7和HLCZOl細胞中均有ALB和AAT蛋白表達，而非肝癌細胞系CHO中不表達這兩種蛋白。由以上實驗可以證實，本發明篩選獲得的人肝癌細胞系HLCZOl不僅含有肝細胞特異基因ALB和AAT，而且可表達肝細胞特異蛋白ALB和AAT。應用實施例1 =HLCZOl被肝炎病毒HCV感染。1.將本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl和現有的Huh7.5鋪設于六孔細胞培養板中(20萬/孔)，24h后將培養基換成只含有2% FBS的培養基，以MOI = 0.2的JHll病毒感染細胞；24h后換新鮮的完全培養基，將細胞分別培養I天、2天、3天和6天，對應時間點用TRIZOL提取兩種細胞的總RNA，然后取IygS RNA逆轉錄成cDNA，以I μ L cDNA為模板進行定量PCR，檢測兩種細胞中的HCVRNA水平，結果如圖3所示。2.另取感染3天后的上述部分人肝癌細胞系鋪于60mm培養皿中的蓋玻片上，繼續培養3天。I XPBS沖洗細胞兩次后，用冰丙酮將上述的兩種人肝癌細胞系固定8min。I XPBS清洗固定后長有前述人肝癌細胞系的蓋玻片3次，每次5min，羊血清室溫下封閉30min，然后加Ant1-NS5A—抗孵育lh，I XPBS洗3次后加FITC標記的二抗孵育lh，lXPBS洗3次后DAPI封片，最后在熒光顯微鏡下觀察，結果如圖4所示，圖4可進一步證明，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl細胞中可檢測出病毒蛋白NS5A。由上可見，HCV感染HLCZOl細胞后，通過熒光定量PCR檢測細胞中HCV RNA水平，以及免疫熒光檢測細胞中病毒蛋白表達，進一步證實本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可被肝炎病毒HCV(JFHl)感染。基 于此，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可作為支持肝炎病毒HCV感染的細胞模型進行應用，也可作為建立支持HCV病毒感染的動物模型進行應用，還可用于制備、篩選或評價抗HCV肝炎病毒藥物。以本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl作為支持肝炎病毒(上述丙肝病毒)感染的細胞模型進行應用的情形如圖3和圖4所示。以本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl作為建立支持上述丙肝病毒感染的動物模型的應用情形如圖8所示，圖8為本實施例中以人肝癌細胞系HLCZOl制備人源化小鼠被丙肝病毒感染后，小鼠血清中丙肝病毒含量隨感染時間的變化曲線。本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl還可用于制備、篩選或評價抗丙型肝炎病毒藥物。根據我們的實驗發現，上述丙肝病毒感染該人肝癌細胞系HLCZOl后，目前用于治療丙肝的藥物一α -干擾素可以降低丙肝病毒感染該人肝癌細胞系HLCZOl內的病毒含量(參見圖10)，圖10即顯示了 HLCZOl細胞內丙肝病毒含量隨干擾素用量和處理時間的變化關系，由此可見，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可用于制備、篩選或評價抗丙型肝炎病毒藥物。應用實施例2 =HLCZOl被肝炎病毒HBV感染。將本實施例中的人肝癌細胞系HLCZOl鋪于60mm培養皿中，24h后將培養基(DMEM培養基)換為IfepaG2.2.15細胞上清與完全培養基(按1:1的體積比)混合，繼續培養5天。5天后細胞傳代，換為正常培養基培養，每3天傳代時取部分細胞提取總細胞DNA。取第46天所提DNA作為模板進行定量PCR，檢測人肝癌細胞系HLCZOl細胞中的HBV含量，結果如圖5所示，由圖5可見，人肝癌細胞系HLCZOl細胞中可被檢測出HBV。由上可見，HBV感染HLCZOl細胞后，通過熒光定量PCR檢測細胞中HBV的含量水平，進一步證實本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可被肝炎病毒HBV (來源于!fepaG2.2.15細胞內的乙肝病毒)感染。基于此，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可作為支持肝炎病毒HBV感染的細胞模型進行應用，也可作為建立支持HBV病毒感染的動物模型進行應用，還可用于制備、篩選或評價抗HBV肝炎病毒藥物。
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以本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl作為支持肝炎病毒(上述乙肝病毒)感染的細胞模型進行應用的情形如圖5所示。本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl還可用于制備、篩選或評價抗乙型肝炎病毒藥物。根據我們的實驗發現，上述乙肝病毒感染該人肝癌細胞系HLCZOl后，目前用于治療乙肝的藥物一α -干擾素可以降低乙肝病毒感染該人肝癌細胞系HLCZOl內的病毒含量(參見圖9)，圖9即顯示了 HLCZOl細胞內乙肝病毒含量隨干擾素用量和處理時間的變化關系，由此可見，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可用于制備、篩選或評價抗乙型肝炎病毒藥物。應用實施例3 =HLCZOl同時被肝炎病毒HBV和HCV感染。1.取HBV(應用實施例2中的HBV)感染53天后的HLCZOl細胞鋪于六孔細胞培養板中(20萬/孔)，同時取未被HBV感染的HLCZOl細胞鋪于六孔細胞培養板中(20萬/孔)，24h后將完全培養基換成只含有2% FBS的培養基，以MOI = 0.2的JFHl病毒感染前述的兩種HLCZOl細胞(HBV感染和未被HBV感染的兩種細胞)。24h后換新鮮的完全培養基，將細胞分別培養I天、2天、3天和6天，對應時間點用TRIZOL提取細胞總RNA，然后取Iug總RNA逆轉錄成cDNA，以IuL cDNA為模板進行定量PCR，檢測細胞中HCV RNA水平，結果如圖6所示，由圖6可見，HCV在兩種HLCZOl細胞中的含量均隨感染時間延長而增加，但被HBV感染過的HLCZOl細胞中HCV含量低于未被感染過的HLCZOl細胞。2.取被HBV感染過的HLCZOl細胞，再以上述方法感染HCV6天，丙酮固定細胞，分別用針對HBV核心蛋白抗原和HCV NS5A蛋白的抗體檢測細胞中的肝炎病毒，結果如圖7所示，由圖7可見，HLCZOl細胞中能檢測出HBV和HCV兩種病毒蛋白，且能在同一個HLCZOl細胞中檢測到兩種病毒蛋白。由上可見，HBV和HCV同時感染HLCZOl細胞后，通過熒光定量PCR檢測細胞中HBV和HCV RNA水平，以及免疫熒光檢測細胞中病毒蛋白表達，進一步證實本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可同時被肝炎病毒HBV(來源于!fepaG2.2.15細胞內的乙肝病毒)和HCV(JFHl)感染。基于此，本發明的人肝癌細胞系HLCZOl可作為支持肝炎病毒HBV和HCV同時感染的細胞模型進行應用，也可作為建立支持HBV和HCV病毒同時感染的動物模型進行應用，還可用于制備、篩選或評價同時抗HBV和HCV肝炎病毒藥物(參見圖6 圖10)。應用實施例4 =HLCZOl在制備、篩選或評價抗腫瘤藥物中的應用。圖11給出了目前用于臨床試驗II期的藥物TRAIL可誘使該HLCZOl細胞發生死亡的實驗數據，由此可以看出，本實施例的人肝癌細胞系HLCZOl還可用于制備、篩選或評價抗腫瘤藥物。綜合以上應用實施例的檢測結果，這有力證明本發明建立的細胞系HLCZOl為一株人肝癌細胞系，該人肝癌細胞系HLCZOl能被HBV和/或HCV(同時感染)，但HBV并不局限于實施例2中的來源于HepaG2.2.15細胞中的HBV，HCV也并不局限于來源于2a型HCV的JFHl感染。本發明人肝癌細胞系HLCZOl的建立將給HBV、HCV等肝炎病毒學方面、肝癌腫瘤學方面及其他方面的研 究提供有力的工具，擁有廣闊的應用價值和應用前景。
權利要求
1.一種人肝癌細胞系HLCZOl，所述人肝癌細胞系HLCZOl為保藏于中國典型培養物保藏中心、且保藏號為CCTCC NO:C201309的人肝癌細胞系。
2.根據權利要求1所述的人肝癌細胞系HLCZ01，其特征在于:所述人肝癌細胞系HLCZOl為可被肝炎病毒感染的人肝癌細胞系。
3.根據權利要求2所述的人肝癌細胞系HLCZ01，其特征在于:所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒2a型。
4.一種如權利要求1 3中任一項所述的人肝癌細胞系HLCZOl作為支持肝炎病毒感染的細胞模型的應用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒2a型。
5.一種如權利要求1 3中任一項所述的人肝癌細胞系HLCZOl作為建立支持病毒感染的動物模型的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:所述病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。
7.一種如權利要求1 3中任一項所述的人肝癌細胞系HLCZOl在制備、篩選或評價抗肝炎病毒藥物中的應用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。
8.一種如權利要求1 3中任一項所述的人肝癌細胞系HLCZOl在制備、篩選或評價抗腫瘤藥物中的應用。
9.一種如權利要求1 3中任一項所述的人肝癌細胞系HLCZOl在制備人造肝中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人肝癌細胞系HLCZ01，該人肝癌細胞系HLCZ01為保藏于中國典型培養物保藏中心、且保藏號為CCTCC NOC201309的人肝癌細胞系。本發明的人肝癌細胞系HLCZ01可作為支持肝炎病毒感染的細胞模型進行應用，可作為建立支持病毒感染的動物模型進行應用，還可用于制備、篩選或評價抗肝炎病毒藥物、抗腫瘤藥物，還可用于制備人造肝。
文檔編號C12N5/09GK103087989SQ20131004114
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者朱海珍, 左朝暉, 王小紅, 楊大榮, 劉念禮 申請人:湖南省腫瘤醫院