一種穩定高效表達雞防御素10的細胞系及復合制劑及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種穩定高效表達雞防御素10的細胞系及復合制劑及應用，雞防御素10由猴胎腎細胞MARC145/Gal-10,CCTCC NO：C2014208表達得到。同時，本發明還公開了一種由雞防御素8和雞防御素10混合制得的復合制劑，其中的雞防御素8由猴胎腎細胞MARC145/Gal-8CCTCC NO：C2014207表達得到。本發明公開的細胞系蛋白表達量高，傳代穩定，無論是作為單一制劑還是作為復合制劑，都具有廣譜抗菌性，安全性好，可作為替代傳統的抗生素進行使用。CCTCC NO:C201420720141107CCTCC NO:C201420820141107
【專利說明】一種穩定高效表達雞防御素10的細胞系及復合制劑及應 用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因生物工程【技術領域】，具體涉及一種穩定高效表達雞防御素10的 細胞系及復合制劑及應用。 技術背景
[0002] 我國是禽類產品出口大國，養禽業的健康發展不僅關系到廣大養殖戶的經濟利 益，還關系到國民的身體健康。然而，由于抗生素的濫用，導致檢測出藥物殘留量超標，嚴重 威脅食品安全問題，同時也產生了大量的耐藥菌株，這給養禽業的疾病防控和治療工作帶 來了嚴重的阻礙。為了養禽業的健康發展，我們亟需尋找到一種新的途徑或者新的方法，防 止耐藥性的出現和食品安全等問題。因此尋找和開發無耐藥性的新型抗菌藥物具有非常重 要的現實意義（Miyasaki，1998)。
[0003] 防御素（defensin)又名嗜中性多肽（Neutrophil Peptides, NP)，是一類對抗外 源性病源茵的防御性肽類活性物質，是生物機體免疫系統的一個重要組成部分，在動物、植 物、昆蟲體內廣泛存在，具有廣譜抗菌功能（Tang，1999)。研究表明，各種防御素對革蘭氏 陰性菌、革蘭氏陽性菌、分枝桿菌、霉菌、真菌、囊膜病毒及腫瘤細胞有不同程度的抑制作用 (Salz man，2003)。Gallinacin是廣泛存在于雞體內的一種β-防御素，在雞防御系統中有 重要作用，具有很強的抗細菌活性和廣泛的抗菌譜，提示我們可以將其開發為一種新的抗 微生物制劑。因此，雞防御素的成功獲取能帶來極大的社會、經濟效益。但雞體內天然防御 素表達量低、分子小，分離困難，化學合成防御素成本又太高，所以利用基因工程技術重 組表達外源基因已成為獲取目標蛋白的有效途徑之一（Chen，2001)。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是在于提供了一種穩定高效表達雞防御素10(Gallinacin-10,本發 明或稱Gal-10)的細胞系，該細胞系已于2014年11月7日送往中國典型培養物保藏中心 進行保藏，分類命名：猴胎腎細胞MARC145/Gal-10,保藏編號：CCTCC NO :C2014208。地址： 中國武漢武漢大學。
[0005] 本發明的另一個目的在于提供了猴胎腎細胞MARC145/Gal-10細胞系表達的重組 雞防御素10,該防御素具有顯著的抗菌活性，安全性好。
[0006] 本發明還有一個目的在于提供了一種雞防御素復合制劑，該制劑是由雞防御 素8和雞防御素10混合制得，所述的雞防御素8由猴胎腎細胞MARC145/Gal-8 (CCTCC NO :C2014207)細胞系表達得到，雞防御素10由猴胎腎細胞MARC145/Gal-10(CCTCC NO : C2014208)細胞系表達得到。
[0007] 本發明還有一個目的在于提供了猴胎腎細胞MARC145/Gal_10細胞系在制備抑菌 藥物中的應用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的應用，還包括用于制備家禽生物藥 品中的應用，特別是在制備雞細菌感染性疾病藥物中的應用。
[0008] 本發明還有一個目的在于提供了一種雞防御素復合制劑在制備抑菌藥物中的應 用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的應用，還包括用于制備家禽生物藥品中的應 用，特別是在制備雞細菌感染性疾病藥物中的應用。
[0009] 為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：
[0010] 一種能穩定高效表達雞防御素8的細胞系，其制備方法如下：
[0011] ⑴從15日齡的仔雞體內采集新鮮的雞腎組織，提取雞組織總RNA。反轉錄的cDNA 產物用DNase I 37 °C處理20min以去除基因組DNA污染；
[0012] (2)根據雞防御素8基因序列，PCR擴增雞防御素8,設計引物如下：
[0013] P8-1 :5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0014] P8-2 :5, CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3，
[0015] (3)用EcoR I和BamH I雙酶切雞防御素8和pIRES2-EGFP，將防御素8基因連接 到載體PIRES2-EGFP，獲得重組質粒pIRES2-EGFP-GAL-8,用于細胞轉染。
[0016] (4)將復蘇后傳代3次的marc-145細胞以胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高 糖DMEM培養基調成5 X IO5個/mL的密度，接種于若干個直徑為35mm的培養皿中，于37°C、 5%0)2的細胞培養箱中培養2411。待細胞融合至70%?80%時，按照1^?(^6(^ &1^1^2000 操作說明書進行細胞轉染操作，對照組不加脂質體。6h后更換有血清、無雙抗的高糖DMEM 培養基繼續培養。轉染48h后，開始用600 μ g/mL的G418進行篩選，直至絕大部分細胞死 亡，維持篩選6周。將獲得的細胞采用極限稀釋法傳至96孔細胞培養板。每孔大約1個細 胞，交替使用常規培養基和G^S^OOug/mL)培養基培養單個細胞，至其長出單個克隆。在 熒光顯微鏡下挑選出最優的細胞克隆繼續培養，并不斷擴繁至建立新的細胞系，得到穩定 轉染PIRES2-EGFP-GAL-8的細胞系，該細胞系已于2014年11月7日送往中國典型培養物保 藏中心進行保藏，分類命名：猴胎腎細胞MARC145/Gal-8,保藏編號：CCTCC N0:C2014207。 地址：中國武漢武漢大學。
[0017] 具有以下特征：（1)從形態上觀察，猴胎腎細胞MARC145/Gal-8形態比較規則， 呈近圓形，細胞折光性強，胞質飽滿，核質清晰；（2)細胞易于消化、貼壁和傳代，最適在含 10%胎牛血清的DMEM培養基中生長，細胞倍增時間為32h ; (3)能高效表達雞防御素8,具 有較好的抑菌活性，抑菌譜廣泛；(4)細胞傳代50次以上，仍可以穩定遺傳 Gal-8基因，穩 定表達出雞防御素8。
[0018] 一種能穩定高效表達雞防御素10的細胞系，其制備方法同表達雞防御素10的細 胞系，僅引物不同，具體如下：
[0019] P10-1 :5, CGGAATTCATGAAGATCCTCTGCCTGC 3，
[0020] P10-2 :5, CGGGATCCTTACTGCGCCGGAATCT 3，
[0021] Marcl45/pIRES2-EGFP-GAL-10細胞系已于2014年11月7日送往中國典型培 養物保藏中心進行保藏，分類命名：猴胎腎細胞MARC145/Gal-10,保藏編號：CCTCC NO: C2014208。地址：中國武漢武漢大學。
[0022] 它具有以下特征：（1)從形態上觀察，猴胎腎細胞MARC145/Gal_10形態規則、整 齊，細胞連接緊密，呈圓形，細胞折光性強，胞質飽滿，核質清晰；(2)細胞易于消化、貼壁和 傳代，最適在含10%胎牛血清的DMEM培養基中生長，細胞倍增時間為30. 5h ; (3)能高效表 達雞防御素10,具有較好的抑菌活性，抑菌譜廣泛；(4)細胞傳代50次以上，仍可以穩定遺 傳 Gal-IO基因，穩定表達出雞防御素10。
[0023] 雞防御素10在制備抑菌藥物中的應用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的 應用，所述的雞防御素10在作為生物防腐劑或抑菌劑時，將其涂布在需防腐或抑菌的物體 表面即可還包括用于制備家禽生物藥品中的應用，特別是在制備治療雞細菌感染性疾病藥 物中的應用，將其制備成各類具有抑菌作用的劑型，直接用于家禽即可。
[0024] -種雞防御素復合制劑在在制備抑菌藥物中的應用方面中的應用，包括在制備生 物防腐劑，生物抑菌劑中的應用，所述的復合制劑在作為生物防腐劑或抑菌劑時，將其涂布 在需防腐或抑菌的物體表面即可。復合制劑還包括用于制備家禽生物藥品中的應用，特別 是在制備治療雞細菌感染性疾病藥物中的應用，將其制備成各類具有抑菌作用的劑型，直 接用于家禽即可。
[0025] 與現有技術相比，本發明具有以下特點：
[0026] (1)本發明提供的真核表達載體PIRES2-EGFP-GAL-10可以表達重組雞防御素10 和綠色熒光蛋白，其優點是可對轉染結果進行直觀、及時的觀察和檢測；能高效表達重組雞 防御素10,蛋白獲取方法簡單，成本低。
[0027] (2)本發明提供的重組雞防御素10具有顯著的抗菌活性，安全性好，提供了一種 新的雞疾病防治中的抗菌藥物的方法及其在獸用生物制品中的應用。
[0028] (3)將本發明制備雞防御素10和雞防御素8混合后，發現其抑菌效果明顯比單一 防御素的抑菌效果好。這提示我們可以將兩種甚至多種防御素聯合起來，生產復合防御素 制劑，從而提高抗菌活性和擴大抗菌譜，達到更好的抑菌效果，安全性好，從而替代傳統的 抗生素。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1為一種重組表達質粒重組質粒PCR鑒定示意圖。
[0030] M，DL2000marker ;1，PIRES2-EGFP-GAL-10 ;2, PIRES2-EGFP-GAL-8。
[0031] 圖2為一種重組表達質粒酶切鑒定示意圖。
[0032] M，DL2000marker ;1，EC0RI 和 BamHI 雙酶切重組質粒 PIRES2-EGFP-GAL-8 ; 2, ECORI 和 Bam HI 雙酶切重組質粒 PIRES2-EGFP-GAL-10。
[0033] 圖3為一種穩定轉染雞防御素基因的marcl45細胞示意圖。
[0034] A，B :未轉染的Marc-145細胞；A' ：穩定轉染GAL-8基因的marcl45細胞；B' ：穩 定轉染GAL-10基因的marcl45細胞。
[0035] 圖4為一種PIRES2-EGFP-GAL-8重組質粒PCR穩定性檢測示意圖。
[0036] M，DL2000marker ;1，連續培養10代重組質粒；2,連續培養30代重組質粒；3,連續 培養50代重組質粒。
[0037] 圖5為一種PIRES2-EGFP-GAL-10重組質粒PCR穩定性檢測示意圖
[0038] M，DL2000marker ; 1，連續培養10代重組質粒；2,連續培養30代重組質粒；3,連續 培養50代重組質粒。
[0039] 圖6為一種GAL-8蛋白表達的Western Blot鑒定示意圖。
[0040] 1，連續培養10代重組蛋白；2,連續培養30代重組蛋白；3,連續培養50代重組蛋 白。
[0041] 圖7為一種GAL-10蛋白表達的Western Blot鑒定示意圖。
[0042] 1，連續培養10代重組蛋白；2,連續培養30代重組蛋白；3,連續培養50代重組蛋 白。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合附圖及具體實施例子對本發明作進一步說明。在實施例中涉及的所有培 養基和分子生物學操作方法為本領域技術人員所熟知。本實驗所涉及的分子生物學方法為 常規方法，為本領域人員所熟悉。本發明中未詳細闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩 姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。
[0044] 實施例1 :
[0045] 一種能穩定高效表達雞防御素的細胞系，通過以下步驟篩選得到：
[0046] (1)雞腎組織總RNA的提取及反轉錄
[0047] 從15日齡的仔雞體內采集新鮮的雞腎組織，按照TRIzoL Reagent試劑盒（GIBC0 公司）并按其說明書提取雞組織總RNA。反轉錄的cDNA產物用DNase I 37°C處理20min 以去除基因組DNA污染。
[0048] (2)雞防御素8基因的制備：
[0049] 根據GeneBank中已經發表的雞防御素8基因的序列：GeneBank :NM_001001781. 1 設計引物，
[0050] Ρ8-1 :5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0051] Ρ8-2 :5' CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3'
[0052] 以步驟（1)中的cDNA為模板進行PCR，PCR反應體系為：20ymol/L的引物各lyL， 2.5mmol/L 的 dNTPs 5yL，10Xbuffer 5yL，2.5U/yL 的 rTaq DNA 聚合酶 lyL，加 CldH2O 至50μ L。反應程序：94°C預變性4min ;94°C變性30s，56°C退火40s，72°C延伸45s，共30 個循環；72°C延伸lOmin，得到雞防御素8基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0053] (3)雞防御素10基因的制備：
[0054] 根據GeneBank中已經發表的雞防御素10基因的序列：NM_001001609. 1，設計引 物：
[0055] P10-1 :5, CGGAATTCATGAAGATCCTCTGCCTGC 3，
[0056] P10-2 :5' CGGGATCCTTACTGCGCCGGAATCT 3'。
[0057] 以步驟（1)中的cDNA為模板進行PCR，PCR反應體系為：20ymol/L的引物各lyL， 2.5mmol/L 的 dNTPs 5yL，10Xbuffer 5yL，2.5U/yL 的 rTaq DNA 聚合酶 lyL，加 ddH20 至5(^1^。反應程序：941：預變性41^11;941：變性3〇8,561：退火4〇8,721：延伸458，共30 個循環；72°C延伸lOmin，得到雞防御素10基因，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0058] (4)真核表達載體的構建
[0059] 1)真核表達載體pIRES2-EGFP-GAL-8的構建：
[0060] 用限制性內切酶EcoR I、BamH I雙酶切載體pIRES2-EGFP和純化的GAL-8PCR產 物。酶切體系如下：
[0061]
【權利要求】
1. 一種穩定高效表達雞防御素10的細胞系，其特征在于：猴胎腎細胞MARC145/ Gal-10,保藏編號：CCTCC NO. C2014208。
2. 權利要求1所述細胞系表達的雞防御素10。
3. 權利要求1所述細胞系的細胞培養上清液。
4. 一種含有權利要求2所述的雞防御素或權利要求3所述的細胞培養上清液的復合制 劑。
5. -種雞防御素復合制劑，該制劑包含有雞防御素8和雞防御素10混合制得，所述的 雞防御素8由猴胎腎細胞MARC145/Gal-8 CCTCC NO. C2014207表達得到，雞防御素10由 猴胎腎細胞 MARC145/Gal-10 CCTCC NO. C2014208 表達得到。
6. 權利要求1所述的細胞系或權利要求2所述的雞防御素10或權利要求5所述的復 合制劑在制備抑菌藥物中的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，所述的應用為在制備生物防腐劑中的應用。
8. 根據權利要求6所述的應用，所述的應用為在制備家禽抗菌生物制品中的應用。
9. 根據權利要求8所述的應用，所述的應用為在制備雞細菌感染性疾病藥物中的應 用。
【文檔編號】A01P1/00GK104388390SQ201410653521
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】周莉, 譚本忠, 錢運國, 高其雙, 陳志華, 彭霞, 盧順, 童偉文, 陶弼菲 申請人:武漢市畜牧獸醫科學研究所