Rna酶h活性的測定的制作方法

專利名稱：Rna酶h活性的測定的制作方法
本申請要求2002年12月23日提交的申請號為60/436,125的美國臨時申請的利益，所述臨時申請以其全文在此處引用作為參考。
1.發明領域本研究涉及能夠實時檢測和監控RNA酶H活性的測定。更具體地，本發明涉及通過熒光猝滅來監控RNA-DNA雙鏈體酶降解的測定。
2.發明背景RNA酶H.RNA酶H是降解與DNA模板雜交的RNA的已知的酶。例如，大腸桿菌(E.coli)RNA酶H1酶負責在DNA合成期間從前導和后隨鏈上除去RNA引物。RNA酶也是細菌、病毒和人類基因組復制中重要的酶。例如，HIV逆轉錄酶全酶在p66亞基的C-末端上擁有RNA酶H活性(Hansen等人，EMBO J.1998，7239-243)，并且抑制該酶活性會影響病毒生命周期內的至少三個獨特點(Schatz等人，FEBSLett.1989，257311-314；Mizrahi等人，Nucl.Acids Res，1990，185359-5363；Furfine &Reardon，J.Biol.Chem.1991，266406-412)。此外，影響HIV RNA酶H活性的突變也會消除病毒的感染性(Tisdale等人，J.Gen.Virol.1991，7259-66)，強調了該酶作為抗病毒靶的潛在用途。
能夠檢測和監控RNA酶H活性的測定和方法以及鑒定可能影響或調節該酶活性的化合物受到相當的關注。然而，現有的用于RNA酶H活性的測定和其他確定核酸切割是否已經發生或進行到什么程度的方法通常是費時費力的。此外，現有的測定也是不連續的并且不能實時監控所述RNA酶反應。這在用戶希望建立所述酶的精確動力學信息(例如表征新的抑制性化合物的作用)的應用中是特別不利的。
熒光共振能量轉移(FRET)。標記寡核苷酸探針的序列特異性雜交已經被用作檢測和鑒定選擇的核苷酸序列的方法，并且用熒光標記來標記這種探針已提供了相對敏感、非放射性的促進探針雜交檢測的方法。近來的檢測方法使用了熒光能量轉移(FRET)的方法而不是直接檢測熒光強度以檢測探針的雜交。當一個染料(猝滅劑)的吸收光譜與另一個染料(供體)的發射光譜重疊并且所述兩種染料非常靠近時，在供體熒光團和猝滅劑染料(可是或不是熒光團)之間就產生了熒光能量轉移。具有這些特性的染料被稱作供體/猝滅劑染料對或能量轉移染料對。
所述供體熒光團的激發態能量通過共振偶極子誘導的偶極子相互作用轉移到相鄰的猝滅劑。這導致了供體熒光的猝滅。在某些情況下，如果所述猝滅劑也是熒光團，其熒光強度可能會增強。能量轉移的效率高度依賴于所述供體和猝滅劑之間的距離，并且預測這些相互關系的公式已由Frster(Ann.Phys.1948，255-75)發展出來。能量轉移效率為50％時的供體和猝滅劑染料之間的距離稱為Frster距離(RO)。已知的熒光猝滅的其他機制還包括例如電荷轉移和碰撞猝滅。
基于緊鄰的兩種染料相互作用產生猝滅的能量轉移和其他機制是用于檢測或鑒定核苷酸序列的非常有吸引力的方法，因為這樣的檢測可以以均勻形式進行。均勻檢測形式比傳統探針雜交測定更簡單，其中所述傳統探針雜交測定基于檢測單個熒光團標記的熒光，這是因為不均勻測定通常要求額外的步驟將雜交標記從游離標記中分離出來。傳統上，FRET和相關方法基于監控一種或同時二種染料標記的熒光性質變化，當兩個互補寡核苷酸通過雜交將二個染料標記置于一起時產生所述熒光性質的變化。在這種形式中，所述熒光性質的變化可當作能量轉移量的變化或當作熒光猝滅量的變化進行測量，一般表現為其中一種染料的熒光強度增加。這樣，在不分開未雜交的和雜交的寡核苷酸的情況下可檢測所述靶核苷酸序列。所述雜交可能發生在二個分開的互補寡核苷酸之間，其中一個用供體熒光團標記而另一個用猝滅劑標記。與所述單鏈寡核苷酸相比，在雙鏈形式中供體熒光減少(猝滅增強)和/或能量轉移增加。
Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992，Academic Press，Inc.，參見，特別是311-352頁)綜述了幾種FRET雜交測定的形式。做為選擇，所述供體和猝滅劑可連接到單個寡核苷酸上，這樣將寡核苷酸未雜交時與它與其互補序列雜交時對比就會發現其中一個或二者的熒光性質有可檢測的差異。在這種形式中，當所述寡核苷酸雜交時供體熒光一般增加并且能量轉移/猝滅下降。例如，自身互補兩端標記的寡核苷酸會形成發夾結構從而使2個熒光團(即所述5’與3’端)在空間上非常接近，在此空間可發生能量轉移和猝滅。自身互補的寡核苷酸與其在第二個寡核苷酸上的互補序列的雜交破壞了發夾結構并增加了所述兩種染料之間的距離，于是降低了猝滅。所述發夾結構的不利方面是它非常穩定并且轉變成非猝滅的雜交形式通常較慢并且反應只是中度有利的(moderately favored)，導致通常較差的表現。Tyagi& Kramer(Nature Biotech.1996，14303-308)描述了根據上面描述標記的發夾，所述發夾在發夾的自身互補臂之間的環上包含檢測序列，所述自身互補臂形成莖部。為了檢測序列與靶雜交并導致猝滅的降低，堿基配對的莖必需熔解。Bagwell等人(Nucl.Acids Res.1994，222424-2425；也參見，美國專利No.5,607,834)描述了“雙發夾”探針和使用它的方法。這些結構在發夾內包含靶結合序列并且因此參與靶和發夾的自身互補序列之間的競爭雜交。Bagwell通過使用錯配使發夾去穩定來解決不利于雜交動力學的問題。
現在也已經描述了均勻方法，所述均勻方法運用了用于檢測核酸擴增的能量轉移或其他熒光猝滅機制。(Lee等人，Nuc.Acids Res.1993，213761-3766)公開了實時檢測方法，在所述方法中雙標記的檢測探針在PCR期間以靶擴增特異性方式進行切割。所述檢測探針在擴增引物的下游雜交，這樣Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性就能消化所述檢測探針，分開形成能量轉移對的兩個熒光染料。隨著探針切割熒光強度增加。
已對用于核酸擴增均勻檢測的信號引物(有時也稱為檢測探針)進行描述(美國專利No.5,547,861)，所述信號引物與所述擴增引物雜交位點下游的靶序列雜交。所述信號引物通過聚合酶作用以與擴增引物延伸類似的方式進行延伸。擴增引物的延伸以靶擴增依賴性方式取代了所述信號引物的延伸產物，產生雙鏈二級擴增產物，所述二級擴增產物可作為靶擴增的指示被檢測。美國專利No.5,550,025(親脂性染料和限制位點的整合)和美國專利No.5,593,867(熒光偏振檢測)對使用單鏈信號引物均勻檢測方法的例子進行了描述。更近年來通過利用FRET方法，信號引物已適合用來檢測核酸靶。美國專利5,691,145公開了包含供體/猝滅劑染料對的G-quartet結構，所述染料對附加在單鏈信號引物的靶結合序列的5’。在靶擴增期間互補鏈的合成使所述G-quartet解折疊，增加了供體和猝滅劑染料間的距離并導致可檢測的供體熒光增加。近年來也已描述了用供體/猝滅劑染料對標記的部分單鏈、部分雙鏈的信號引物。例如，EP 0 878 554公開了具有供體/猝滅染料對的信號引物，所述信號引物位于單鏈限制性內切核酸酶識別位點的兩側。在靶存在的情況下，所述限制位點變成雙鏈并且可被限制性內切核酸酶切割。切割分開所述染料對并減少供體猝滅。EP 0 881 302描述了具有分子內堿基配對結構附加到其上的信號引物。當所述分子內堿基配對結構折疊時，連接到所述結構上的供體/猝滅劑染料對中的供體染料被猝滅，但在靶存在的情況下，與所述分子內堿基配對結構互補的序列得以合成。這樣便使所述分子內堿基配對結構解折疊并且將所述供體和猝滅劑染料分開，導致供體猝滅的減少。Nazarenko等人(美國專利No.5,866,336)描述了類似的方法，其中使擴增引物具有發夾結構構型，所述發夾結構攜帶供體/猝滅劑染料對。
因此，存在對能檢測和/或監控RNA和其他核酸降解，例如通過諸如RNA酶H的酶降解的測定和方法的持續需求。具體地，存在對能實時檢測和監控這種活性的測定和方法的需求。
* **在本部分或本申請通篇所引用的任何文獻并不構成承認這些文獻可作為對于此處所描述和要求保護的本發明的“現有技術”。
3.發明概述本發明通過提供檢測核酸酶介導的靶核酸切割的方法克服了現有技術的不利方面，所述方法通過(a)將靶核酸與熒光標記的寡核苷酸探針雜交，所述熒光標記的寡核苷酸探針與所述靶核酸互補并且在其一末端包含熒光團而在另一末端包含猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅熒光團的熒光信號，以及(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致熒光團和猝滅劑充分分離以減少熒光團熒光信號的猝滅；(b)將所述探針-靶雜交體與具有核酸酶活性的試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割所述靶核酸并且因此釋放完整探針；并且(c)通過測量所述熒光團熒光信號與所述探針-靶雜交體的信號相比時的減少來檢測探針的釋放。
本發明另一個實施方案提供了通過將靶RNA與熒光標記的寡脫氧核糖核苷酸探針雜交以測量試劑的RNA酶H活性的方法，所述探針與所述靶RNA互補并且在其一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅劑，其中(i)當所述探針不與所述靶RNA雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅熒光團的熒光信號，以及(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致熒光團和猝滅劑充分分離以減少熒光團熒光信號的猝滅；將所述探針-靶雜交體與試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割靶RNA并且因此釋放完整的探針；并且測量所述熒光團的熒光信號與所述探針-靶雜交體的信號相比時熒光信號的減少。
在一個實施方案中，所述試劑選自RNA酶H，逆轉錄酶、大腸肝菌RNA酶H1和H2、人RNA酶H1和H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。在優選的實施方案中，所述逆轉錄酶是HIV逆轉錄酶。而在另一個實施方案中，所述逆轉錄酶包含RNA酶結構域。
在本發明實施方案中，所述探針是DNA，并且所述靶是DNA∶RNA雜交體底物。此外在本發明實施方案中，所述探針長度至少是18個核苷酸。
在本發明中，當所述探針不與所述靶核酸或RNA雜交時，采取使所述熒光團和猝滅劑相接近的二級結構構象。此外，在化合物存時進行RNA酶H介導的或核酸酶反應的情況下，其中在核酸酶反應期間熒光團熒光信號減少的速率與在化合物不存在的情況下進行相同反應時觀察到的減少速率相比有差異，所述方法指示所述化合物抑制或增強所述試劑的核酸酶活性的能力。
在本發明的一個實施方案中，所述方法監控在RNA酶H介導的或核酸酶反應期間所述熒光團的熒光信號。
本發明還提供了通過將靶核酸與熒光標記的寡核苷酸探針雜交以篩選試劑的核酸酶活性調節劑的方法，所述寡核苷酸探針與靶核酸互補并且在其一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅熒光團的熒光信號，以及(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致熒光團和猝滅劑充分分離以減少熒光團熒光信號的猝滅；制備兩個含有所述探針-靶雜交體的樣品；將第一個樣品的探針-靶雜交體與試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割靶核酸并且因此釋放完整探針；在候選化合物存在的情況下，將第二個樣品的探針-靶雜交體與試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割靶核酸并且因此釋放完整探針，所述候選化合物正在進行其調節所述試劑的核酸酶活性的能力的測試；通過測量所述熒光團的熒光信號與所述探針-靶雜交體的信號相比時的減少以檢測各樣品中所述探針的釋放；并且比較兩個樣品中所述熒光團熒光信號下降的速率，其中兩個樣品在核酸酶反應期間熒光團熒光信號下降速率的差異指示所述化合物抑制或增強所述試劑的核酸酶活性的能力。
在優選的實施方案中，與第一個樣品相比第二個樣品中所述熒光團熒光信號更大程度或更大相對的速率降低表示所述候選化合物是試劑的激動劑。在另一個實施方案中，與第一個樣品相比第二個樣品中所述熒光團熒光信號更小程度或更小相對的速率降低表示所述候選化合物是試劑的拮抗劑。
本發明還提供了用于測量試劑核酸酶活性的試劑盒，包含靶核酸和熒光標記的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針與所述靶核酸互補并且在其一末端包含熒光團而在另一末端包含猝滅劑，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅熒光團的熒光信號，以及(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團熒光信號的猝滅。
在所述試劑盒的一個實施方案中，所述探針的長度至少為18個核苷酸。在所述試劑盒的另一個實施方案中，當探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使所述熒光團和猝滅劑相接近的構象。
在所述試劑盒優選的實施方案中，所述探針是DNA，并且所述靶核酸是DNA∶RNA雜交體底物。
在所述試劑盒的一個實施方案中，本發明還具有試劑。在優選的實施方案中，所述試劑選自RNA酶H、逆轉錄酶、大腸桿菌RNA酶H1和H2、人RNA酶H1和H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。然而在另一個實施方案中，所述逆轉錄酶是HIV逆轉錄酶。
本發明也提供了用于測量試劑核酸酶活性的測定混合物，其包含靶核酸和熒光標記的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針與所述靶核酸互補并且在其一末端包含熒光團而在另一末端包含猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅熒光團的熒光信號，以及(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團熒光信號的猝滅。
在所述測定的優選實施方案中，所述探針是DNA，并且所述靶核酸是RNA。在另一個實施方案中，所述探針和所述靶核酸相互雜交形成探針-靶雜交體。
在所述測定混合物的一個實施方案中也具有試劑。在優選的實施方案中，所述試劑選自RNA酶H、逆轉錄酶、大腸桿菌RNA酶H1和H2、人RNA酶H1和H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。在進一步的實施方案中，所述逆轉錄酶是HIV逆轉錄酶。
4.附圖簡述

圖1A-1B顯示由T7 RNA聚合酶反應合成的底物RNA的PAGE分析。圖1A顯示在變性(7M尿素-15％聚丙烯酰胺)凝膠上評價的RNA產物，而圖1B顯示非變性(天然15％聚丙烯酰胺)凝膠。兩種凝膠上的核酸都通過溴化乙錠染色來檢測。如下對兩個圖中的凝膠進行上樣泳道149-聚體模板DNA(SEQ ID NO2)；泳道2對照RNA125-聚體；泳道3-6從T7 RNA聚合酶反應中產生的RNA；和泳道749-聚模板DNA。
圖2A-2D顯示通過PAGE評價的放射性標記的RNA-DNA底物。圖2A說明與所述底物RNA(SEQ ID NO1)退火的底物DNA核苷酸序列(SEQ ID NO2)。圖2B顯示加載有與33P末端標記DNA退火的非標記RNA的非變性凝膠的圖象。圖2C和2D分別顯示變性和非變性的聚丙烯酰胺凝膠，所述兩種凝膠都已加載有內部放射性標記的RNA和非標記的DNA。所述核酸檢測方法通過磷酸成象(phosphoimagery)進行。
圖3A-3B顯示來自對RNA酶H活性基于PAGE的測定的結果。圖3A顯示來自所述測定的實施方案的結果，在所述實施方案中使用了未標記的RNA/末端標記的DNA底物，而圖3B顯示來自替代的實施方案的結果，所述實施方案使用了標記的RNA/未標記的DNA底物。
圖4顯示加載有在HIV RT RNA酶H活性測定中消化的未標記RNA/末端標記的DNA雜交體的聚丙烯酰胺凝膠的圖象。
圖5A-5B分別顯示分別由圖3A和圖4說明的PAGE凝膠的定量分析確定的HIV RT RNA酶H活性的圖。
圖6A-6C顯示用ssRNA底物運行的PAGE凝膠，所述ssRNA底物與(圖6A)或不與(圖6B)1U(19fmol≈2.2ng)HIV RT RNA酶H酶溫育，以及PAGE凝膠，其中2.5pmol RNA-DNA雜交體底物與所述酶溫育以確定其RNA酶H活性(圖6C)。
圖7是來自RNA酶H測定的PAGE凝膠，所述凝膠上運行有PolyA(泳道2-3)、polyU(泳道4-5)和18S RNA(SEQ ID NO5；泳道6-7)以及放射性標記的RNA-DNA雜交體底物。
圖8顯示來自RNA酶H測定的PAGE凝膠，所述凝膠上運行有此處稱為Oligo 1(SEQ ID NO6；泳道3-5)、Oligo 2(SEQ ID NO7；泳道6-8)和Oligo 3(SEQ ID NO8；泳道9-11)的“污染寡核苷酸”。
圖9A-9D顯示來自基于PAGE的RNA酶H測定的結果，所述測定使用HIV RNA酶H(圖9A)、MMLV RNA酶H(圖9B)和突變體MMLV RNA酶H(圖9C)。這些數據的定量分析描繪于圖9D。
圖10A-10C提供了本發明優選的、實時RNA酶H測定的說明示意圖。圖10A說明例舉的RNA底物(SEQ ID NO10)與例舉的DNA探針(SEQ ID NO9)退火，所述DNA探針用熒光基團部分(F)和猝滅劑部分(Q)標記。在所述RNA底物被RNA酶H消化后，所述DNA探針的5’-和3’-區域能相互退火，于是使熒光團部分和猝滅劑部分充分接近以使猝滅劑部分至少吸收部分由熒光團部分發射的可檢測信號(圖10B)。圖10C說明在這個測定中隨著RNA酶H降解RNA底物可能實時觀察到的典型熒光信號。
圖11A-11B是來自本發明實時RNA酶H測定的熒光強度測量值的圖，所述測定使用了HIV RT RNA酶H(圖11A)和大腸桿菌RNA酶H1(圖11B)。
5.詳述本發明涉及用于實時監控RNA酶H活性的熒光測定的方法。具體地，本發明涉及通過熒光減少來定量估計RNA酶H活性。
定義根據本發明，可以使用本領域技術范圍內的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這些技術在文獻中得已詳盡解釋并且此處用于描述這些技術的術語一般具有本領域通常使用的含義。參見，例如，Sambrook，Fitsch & Maniatis，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(此處稱為“Sambrook等人，1989”)；DNACloningA Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glovered.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.E.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人，(eds.)，Current Protocolsin Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.(1994)。
如本文中使用的本語“熒光標記”或“熒光團”是指能在可檢測范圍內顯示熒光的物質或其部分。根據本發明能使用的熒光團的例子包括異硫氰酸熒光素、熒光素胺、伊紅、羅丹明、丹磺酰、傘形酮、德克薩斯紅、Cy5、Cy3和銪。本領域技術人員還知道其他的熒光標記。一些用于設計敏感的熒光標記的多核苷酸探針的普通指南可以在Heller和Jablonski的美國專利No.4,996,143中找到。這個專利探討了當設計熒光探針時應該考慮的參數，例如熒光部分的間隔(即，當一對熒光標記應用于本方法時)，和連接熒光部分到寡核苷酸的堿基單元上的連接臂的長度。如此處所使用的術語“連接臂”定義為從與其內側端相連的嘌呤或嘧啶堿基到位于其外側端的熒光團的以埃為單位的距離。
術語“酶介導的切割”是指被例如脫氧核糖核酸酶、RNA酶、解旋酶、外切核酸酶、限制性內切核酸酶或逆轉錄病毒整合酶的酶催化的DNA或RNA的切割。其他造成核酸切割的酶為本領域技術人員所了解并且能用于本發明的實踐中。可以在上述Sambrook等人的第5章中找到對這些酶的綜述。
如此處所用的術語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物、探針、待檢測的寡聚體片段、寡聚體對照和未標記的封閉寡聚體并且應該普遍化為指多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)以及嵌合的多核苷酸(含有2-脫氧-D-核酸和D-核糖核苷酸)和任何其他類型的嘌呤或嘧啶堿基的N糖苷、或修飾的的嘌呤或嘧啶堿基的N糖苷的多核苷酸。術語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之間在長度上沒有設想的差別并且這些術語可以互換使用。于是，這些術語包括雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA。優選地，連同本發明測定所使用的寡核苷酸在長度上至少具有10個核苷酸，并且更優選地長度在大約10至100個核苷酸，更進一步優選的寡核苷酸長度在大約25至50個核苷酸。
所述寡核苷酸不一定限于從任何存在的或天然的序列中分離的物理來源的種類，而是可以通過任何方式生成，包括化學合成、DNA復制、逆轉錄或其組合。術語“寡核苷酸”或“核酸”指的是基因組DNA或RNA、cDNA、半合成的或合成來源的多核苷酸，根據其來源或操作，所述多核苷酸(1)和與之在天然狀況下相連接的多核苷酸的全部或部分無關；和/或(2)連接到除了與之在天然狀況下相連接的多核苷酸之外的多核苷酸上；和(3)是非天然的(在天然狀況下不能找到)。寡核苷酸由起反應的單核苷酸組成，以通過這樣的方式形成寡核苷酸，從而在一個方向通過磷酸二酯鍵將一個單核苷酸戊糖環上的5’磷酸附著到其相鄰單核苷酸的的3’氧上，并且如果單核苷酸戊糖環的5’磷酸沒有連接到單核苷酸戊糖環的3’氧上，所述單核苷酸就稱為寡核苷酸的“5’端”，而接下來如果單核苷酸戊糖環的3’氧沒有連接隨后的單核苷酸戊糖環上的5’磷酸就稱其為寡核苷酸的“3’端”。核酸序列，即使已內化成更大的寡核苷酸，也還可以說具有5’和3’端。兩個截然不同的、無重疊的寡核苷酸與相同的線性互補核酸序列的兩個不同區域退火，于是一個寡核苷酸的3’端指向另一個的5’端，則前者被稱為“上游”寡核苷酸而后者稱為“下游”寡核苷酸。通常，“下游”是指在單鏈寡核苷酸上位于3’方向的位置，或在雙鏈寡核苷酸中是指位于參照核苷酸鏈的3’方向的位置。
術語“引物”可以指超過一個寡核苷酸，無論是天然分離的如在純化的限制酯切消化中還是合成產生的。當被放置于反應條件下時，所述引物必需能充當沿互補鏈(DNA或RNA)合成的啟始位點，在所述反應條件下合成的引物延伸產物與所述核酸鏈互補。這些反應條件包括存在有4種不同的脫氧核糖核苷酸三磷酸和多聚化誘導試劑例如DNA聚合酶或逆轉錄酶。所述反應條件包括在最佳溫度下相容緩沖液(包括作為輔因子或影響pH、離子強度等的組分)的使用。為了擴增反應中的最大效率，所述引物優選地是單鏈。
互補核酸序列是指寡核苷酸，當所述寡核苷酸與所述核酸序列進行比對時，一條序列的5’端與另一序列的3’端配對。這種結合稱為“反向平行”。在天然核酸中不常見的修飾的堿基類似物可能被整合(通過酶促反應或合成方式)到核酸中，所述核酸包括但不限于本發明的引物、探針或延伸產物，并且所述修飾的堿基類似物可以包括例如肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。兩條核酸鏈的互補可能并不完全；一些穩定的雙鏈體可能含有錯配的堿基對或未配對的堿基并且核酸技術領域的技術人員通過考慮許多變量可以假設地確定它們的穩定性，所述變量包括寡核苷酸的長度、寡核苷酸中胞嘧啶和鳥嘌呤堿基的濃度、離子強度、pH和錯配堿基對的數量、頻率和位置。核酸雙鏈旋的穩定性通過熔解或解離溫度、或“Tm”來進行測量。特定反應條件下的特定核酸雙鏈旋的Tm。它是一半堿基對已經解離時的溫度。
如此處所使用的，術語“靶序列”或“靶核酸序列”是指有待進行擴增、檢測或兩者都進行的寡核苷酸區域。所述靶序列位于兩個用于擴增的引物序列之間或作為逆轉錄的單鏈cDNA產物。所述靶序列既可以是從樣品或標本中天然獲得的也可以是合成產生的。
如此處所使用的，“探針”包括可與靶核酸中的序列形成雙鏈體結構的核糖-寡核苷酸，這是由于所述核糖-寡核苷酸中的至少一個序列與所述靶區域中的序列互補造成的。優選地，所述探針不含有與用于引發聚合酶鏈反應(PCR)或逆轉錄(RT)反應的序列互補的序列。所述探針可以是嵌合的，即部分由DNA組成。當使用嵌合型探針時，如果所述探針的3’端由DNA部分組成，則通常對這個末端封閉以防止所述探針整合到引物的延伸產物中。在最后的脫氧核糖核苷酸堿基的3’羥基上加入的化學部分例如生物素、熒光素、羅丹明和甚至磷酸基團可以用作3’端封閉基團并且在特殊確定的情況下可同時用作可檢測的標記或猝滅劑。此外，所述探針中可加入修飾的堿基或修飾的鍵以允許對雜交、聚合或水解更大程度的控制。
術語“標記”是指任何可用來提供可檢測(優選地能定量的)實時信號的原子或分子。所述可檢測標記可附著到核酸探針或蛋白上。標記提供能通過熒光、磷光、化學發光、放射性、比色(ELISA)、X-射線衍射或吸收、磁力、酶活性或其組合進行檢測的信號。
術語“吸收體/發射體部分”是指能吸收一種波長的光能并且同時能發射另一種波長的光能的化合物。這包括磷光性的和熒光部分。選擇吸收體/發射體對的要求是(1)它們應該能容易地功能化并偶聯到所述探針上；(2)吸收體/發射體對應當絕對不能阻礙所述功能化探針與其互補的核酸靶序列雜交；(3)最終的發射(熒光)應當最大限度地充足并且持續足夠長時間以使本專業技術人員能進行檢測和測量；和(4)使用相容的猝滅劑應當允許充分消除任何進一步的發射。
如本申請中所使用的，“實時”是指對信號的動力學產生的檢測，包括采取多次讀取以鑒定一段時間內所述信號的特征。例如，實時測量可包括確定可檢測產物的增加速度。作為選擇地，實時測量可包括確定靶序列擴增到可檢測水平前所需的時間。
術語“化學發光的和生物發光的”包括參與光發射反應的部分。化學發光部分(催化劑)包括過氧化物酶、細菌螢光素酶、螢火蟲螢光素酶、功能化的鐵-卟啉衍生物和其他物質。
如此處所定義的，“核酸酶活性”是指模板特異性核糖-核酸核酸酶RNA酶H的活性。如此處所用的，術語“RNA酶H”是指能特異性地降解DNA/RNA雜交體中的RNA部分的酶。所述酶不切割單鏈或雙鏈DNA或RNA并且可以獲得在PCR期間通常遇到的溫度下仍保持活性的熱穩定性雜交體。一般地，所述酶將啟動核酸酶活性，由此除去核糖-核苷酸或將核糖-寡核苷酸從所述RNA-DNA雙鏈體中切除，所述RNA-DNA雙鏈體由所述探針與靶DNA序列退火形成。
術語“雜交或反應條件”是指允許所述標記探針選擇性地與其互補的靶核酸序列雜交的測定緩沖液條件。在這些條件下，所述探針與所述靶核酸序列的特異性雜交得以最優化并且同時允許但不限于通過使用核酸酶或另外的具有核酸酶活性的試劑切割所述探針-靶雜交體。使所述反應條件在輔因子、離子強度、pH和溫度方面得以最優化。
RNA酶H分子信標(Beacon)測定在優選的實施方案中，本發明測定和方法在此處稱為“分子信標”測定的測定中檢測RNA酶H的活性和/或其他核酸酶介導的核酸切割。圖10A-10C對這種測定的例舉實施方案進行了示意性說明。所述測定檢測核酸底物的降解，所述核酸底物優選地是與寡核苷酸探針的至少一個區或部分退火的RNA底物。在優選的實施方案中，所述寡核苷酸探針是DNA探針(例如脫氧寡核苷酸探針)，所述探針在本發明上下文中也被稱為DNA“底物”部分。一般地，所述寡核苷酸探針和所述RNA底物都是長度在大約10至大約100個核苷酸的寡核苷酸分子，且可以是例如長度大約為10-50個核苷酸、更優選地長度為15-25個核苷酸的寡核苷酸分子。在優選的實施方案中，所述寡核苷酸探針長度至少為18個核苷酸。
圖10A顯示例舉的具有SEQ ID NO10所列核苷酸序列的RNA底物，其與例舉的具有SEQ ID NO9所列核苷酸序列的DNA探針退火。然而，這些序列僅僅是例舉的，為了說明和更好地解釋本發明的目的。所述RNA底物和/或所述寡核苷酸探針的實際序列不是關鍵的并且本領域技術人員能夠容易地設計其他合適的序列而不必進行過量的實驗。
盡管如此，所述底物和探針序列優選地具有一定的特性。特別地，所述寡核苷酸探針優選地包含此處稱作5’-區域和3’-區域并且分別位于所述寡核苷酸的5’和3’端的序列區域。這些5’和3’區域優選地包含能相互互補的核苷酸序列，這樣當所述寡核苷酸探針沒有和RNA底物退火時，這兩個區域能相互雜交并且由此形成發夾環，例如圖10B說明的例舉的發夾環。
所述寡核苷酸探針還優選地包含第三個序列區域，所述區域優選地位于所述探針的5’-區域和3’區域之間，并且因此在此處被稱作所述寡核苷酸探針的“中心區域”。這個中心區域的實際序列對于實踐本發明也不是關鍵的。所述寡核苷酸探針的中心區域能夠與所述RNA底物的至少一部分充分互補就足夠了，這樣所述兩個分子就能夠在測定條件下相互雜交。
本發明分子信標測定中使用的寡核苷酸探針也可以包含可檢測標記，所述標記在優選的實施方案中包含能發射可檢測熒光信號的熒光的或“熒光團”部分。更優選地，所述寡核苷酸探針進一步包含“猝滅劑”猝滅劑部分，當所述猝滅劑部分位置上與熒光團部分充分靠近時能吸收至少一部分由這個熒光團部分發射的熒光信號。與此應用的合適的熒光標記和合適的猝滅劑在本領域是熟知的。例如，在一個優選的實施方案中，所述熒光團部分可以是熒光素而所述猝滅劑部分可以是dabcyl。這兩個標記都可以商業購得，例如從Stratagene(La Jolla，California)。然而，多種其他這樣的部分通常可獲得和/或在本領域中公知，并且這類其他的熒光團和猝滅劑部分的使用也是在本發明中預期的。本領域技術人員能夠容易地確定其他適合于和可能應用于本發明的分子信標或其他測定的標記和猝滅劑。
所述熒光團和猝滅劑部分優選地附著到所述寡核苷酸探針相反的末端。于是，圖10A中例舉的寡核苷酸探針圖解為在所述寡核苷酸探針的3’區域(例如在3’端)附著有熒光團部分而在所述寡核苷酸探針的5’區域(例如在5’端)附著有猝滅劑部分。然而，所述猝滅劑部分附著到3’-區域和所述熒光團部分附著到5’-區域的實施方案也是可預期的并且通常是同等優選的。
因此特定的熒光團或猝滅劑部分附著到所述寡核苷酸探針的具體哪一端不是關鍵的。然而，所述兩個部分優選地這樣排放，從而當所述寡核苷酸探針與所述RNA底物退火時，所述熒光團和猝滅劑部分相互充分外離以使所述猝滅劑部分不吸收來自所述熒光團部分的可檢測量的信號。然而，當所述寡核苷酸探針的5’-和3’-區域相互雜交時和/或所述寡核苷酸探針形成發夾環(如例如圖10顯示)時，所述熒光團和猝滅劑部分應當充分靠近以使至少部分由熒光團發射的熒光信號被猝滅劑吸收，這樣來自樣品的熒光信號強度就能被檢測到地減小。
因此在優選的實施方案中，所述測定的分子信標由包含寡核苷酸探針和RNA底物的樣品在一定條件下開始，使得所述寡核苷酸探針與RNA底物相互退火，如圖10A所說明。接著，將具有或懷疑具有降解RNA能力的酶(例如RNA酶H酶)或其他分子加入到所述樣品并且將任選的懷疑具有調節所述酶活性能力的測試化合物也加入進去。接著在有所述酶和任選的測試化合物存在的情況下溫育所述探針和底物并且測量樣品的熒光信號強度。不局限于任何特定的理論或作用機制，要明白隨著RNA底物在樣品中被消化，越來越多部分的所述寡核苷酸探針將會自雜交，例如，如圖10B說明的形成發夾環。于是，隨著RNA酶反應的進行，越來越多數量的寡核苷酸探針將采取使猝滅劑部分與熒光團部分相接近的構象，這樣其熒光信號有效地衰減或“猝滅”。隨著反應進行，通過監控所述樣品的熒光強度可以觀察到這個作用。具體地，要明白隨著RNA底物的消化，所觀察到的熒光強度將隨時間減小形成測驗圖，如圖10C中所顯示的例舉的測驗圖。
利益和用途已開發出估量RNA酶H活性的基于速率的或動力學的測定。使用多個熒光團的能力，本測定應用于藥物開發的高通量篩選和用于快速估計動力學常數突出了所述測定的能力。與以放射性形式進行的測定結合，我們已經顯示這種測定特異性地用于RNA/DNA雜交體底物中RNA的降解。這個測定在幾個(基于凝膠的和放射性非-TCA可沉淀計數和IGEN捕獲測定)標準上優于文獻中的其他RNA酶H測定。
首先，所述測定是快速的并且可應用于多孔形式(包括但不限于96-、384-和1536-孔形式)的高通量篩選(HTS)。第二，與基于聚丙烯酰胺凝膠的測定相比本測定的靈敏度與之相當或更好。本測定比傳統的放射性釋放測定的靈敏度高好幾個數量級(參見，例如，Stavrianopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1976，731087-1091；Papaphilis & Kamper，Anal.Biochem.1985，145160-169；Krug & Berger，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1989，863539-3543；Crouch等人，Methods Enzymol.2001，341395-413；Lima，Methods Enzymol.2001，341430-440；Synder & Roth，Methods Enzymol.2001，341-440-452)。第三，相對于IGEN測定(96-孔形式)，它直接確定RNA酶H活性并且不依賴于用于檢測酶活性或酶活性抑制性的產物捕獲。第四，所述測定是基于速率的并且允許直接確定抑制常數。組合的，本測定提供了具有比放射性釋放測定更快速的、放射性的基于凝膠的測定的靈敏性，并且不需要如IGEN捕獲分析法中為檢測酶活性所進行的第二個事件。
本測定的商業價值是藥物開發。本測定的修飾將使得能夠開發新的測定，如對HIV整合酶或其他RNA和DNA代謝酶的測定。
6.實施例本發明也通過下面的實施例進行描述。然而，這些或其他在本說明書中任何地方的實施例的用途僅僅是說明性的并且決不限制本發明或任何舉例說明的術語的范圍和含義。同樣，本發明也不限于此處描述的任何具體的優選實施方案。事實上，通過閱讀本說明書本發明的許多修飾和變化對本領域技術人員來說是一目了然的并且沒有脫離其精神和范圍。因此本發明僅受限于所附的權利要求的術語以及所述權利要求的等同方案的全部范圍。
實施例1在終點測定中測量RNA酶H的活性本實施例描述了使用終點、基于PAGE分析的測定測量兩個例舉的RNA酶H酶活性的實驗大腸桿菌RNA酶H1和HIV逆轉錄酶。在HIV中，p66/p51逆轉錄酶(RT)全酶具有位于p66亞基C末端的RNA酶活性(Hansen等人，EMBO J.1988，7239-243；Kohlstaedt等人，Science 1992，2561783-1790和Sarafiano等人，EMBO J.2001，201449-1461)。影響該酶RNA酶H活性的突變也消除病毒的感染性(Id.)，使得RNA酶H成為誘人的用于新的抗病毒治療法的靶。
材料與方法RNA酶H.HIV p66/p51異源二聚體的樣品從Enzyco，Inc(Replidyne Inc.，Louisville CO)購得。用于重組表達、純化和鑒定該酶的方法在前面已經描述過(Thimmig & Mchenry，J.Biol.Chem.1993，26816528-16536)。所述酶樣品的純度通過聚丙烯酰胺凝膠予以驗證。其特異性活性也經過測定并確定為27個dNTPinc/μg/60分鐘，所述活性與其他HIV RT酶的特異性活性相當。大腸桿菌RNA酶H1的樣品從EPICENTR(Madison，WI)購得。
RNA-DNA底物。起始反應使用與互補的DNA序列退火的ssRNA分子。簡言之，具有SEQ ID NO1(下面顯示)所列核苷酸序列的ssRNA分子通過使用MEGAshortscriptTMHigh Yield Transcription試劑盒(Ambion Inc.，Austin Texas)進行的T7 RNA聚合酶反應產生。簡言之，退火的寡聚體(SEQ ID NOSA和B，下面顯示)用作DNA底物，所述DNA底物用于用T7 RNA聚合酶合成具有SEQ ID NO1(下面顯示)所列序列的RNA序列。
這個反應中所生的RNA通過溴化乙錠(EtBr)染色的變性(圖1A)和非-變性(圖1B)聚丙烯酰胺凝膠進行定量分析。這些凝膠分辨出了想要的29聚體RNA產物，但也顯示了相當大量的“折返(snapback)”的長度估計大約為45到49個核苷酸的RNA產物。
通過將33P-ATP整合到T7 RNA聚合酶反應中生產放射性標記的RNA，并且與具有SEQ ID NO2(下面顯示)所列核苷酸序列的未標記的49聚體ssDNA退火。在這些實驗的可替換版本中，通過T4 PNK用33P在5’端將所述互補的DNA寡核苷酸(SEQ ID NO2)進行放射性標記，并且與未標記的29聚體ssRNA(SEQ ID NO1)退火。
5’-GACTAATACGACTCACTATAGGAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTAACA-3’ (SEQ IDNOA)3’-CTGATTATGCTGAGTGATATCCTTCTTTTATAGTAGAAACCACAATTGT-5’(SEQ ID NOB)5’-GGAAGAAAAUAUCAUCUUUGGUGUUAACA-3’(SEQ ID NO1)5’-TGTTAACACCAAAGATGATATTTTCTTCCTATAGTGAGTCGTATTAGTC-3’(SEQ ID NO2)這些放射性標記的RNA-DNA雜交體底物的質量通過聚丙烯酰胺凝膠進行定量估計。圖2B顯示加載有與33P-末端標記的DNA(SEQ ID NO2)退火的未標記RNA(SEQ ID NO1)的非-變性凝膠圖象，而圖2C-2D顯示加載有與未標記DNA(SEQ ID NO2)退火的放射性標記的RNA(SEQ ID NO1)的變性(圖2C)和非-變性(圖2D)凝膠圖象。變性凝膠上的標記RNA的定量磷酸成象(圖2C)顯示污染物“折返”RNA占到接近總RNA的約35到40％。如所預期的，在天然(即非-變性)凝膠(圖2D)看不到所述“折返”RNA種類，因為RNA分子在這種凝膠上的分離既依賴于不同RNA種類的構型又依賴于其大小，而在圖2C中變性凝膠上的分離取決于天然分子的構型。
結果通過RNA酶H進行的時間依賴性RNA降解。將含有0.5pmol的放射性-標記DNA-RNA底物(25nM濃度)和0.1U的HIV逆轉錄酶(1.9fmol以0.095pM的濃度)的等分試樣在Tris緩沖液(pH8)中溫育，所述緩沖液含有10mM氯化鎂、氯化鉀(0至30mM)、3％的甘油、0.2％NP-40、50μg/ml BSA和1mM DTT。在平行的實驗中，將含0.5pmol標記的DNA-RNA底物(25nM濃度)的等分試樣也用0.01U的大腸桿菌RNA酶H1酶在Tris緩沖液(pH7.5)中進行溫育，所述緩沖液含有100mM氯化鈉、10mM氯化鎂、3％的甘油、0.02％NP-40、50μg/ml BSA。各種等分試樣在37℃下溫育0(即＜30秒)、5、10、20、30、40和60分鐘以使得RNA酶H酶能夠降解RNA，到每個時間點后通過加入等體積的100mM EDTA猝滅所述反應。所述反應產物通過PAGE進行分析。
所述結果展示在圖3A-3B中。具體地，圖3A顯示運行有用HIV RTRNA酶H(泳道1-7)和大腸桿菌RNA酶H1(泳道9-14)消化的未標記RNA/末端-標記DNA底物的聚丙烯酰胺凝膠圖象。泳道8顯示來自沒有酶存在(NE)的對照實驗的結果。如所期望的，隨著等分試樣溫育更長的時間，對應于RNA-DNA雜交體的條帶強度減小，而對應于單獨的標記DNA的條帶強度增加。
圖3B顯示運行有用3U HIV RT RNA酶(66fmol 6.6nM濃度)消化的標記RNA/未標記DNA雜交體底物的同樣的聚丙烯酰胺凝膠圖案，所述消化在50mM HEPES(pH8)、10mM MgOAc、0.02％NP-40、5μg/μl BSA、3％甘油和2mM DTT中進行。RNA酶酶切割的產物是可見的并且以類似于如圖3A中的速度依賴方式進行降解。
為了考察所述測定辨別不同水平RNA酶活性的能力，用不同濃度的HIV-RT酶和/或底物進行額外的實驗。在前面所描述的條件下用0.3或0.1U的HIV-RT酶溫育150nM未標記RNA/末端-標記DNA雜交體底物。
來自這些實驗的定量結果顯示在圖4A-B中。具體地，圖4A顯示加載有用0.3U的HIV-RT酶消化的底物的聚丙烯酰胺凝膠圖象，而圖4B顯示加載有用0.1U的HIV-RT酶消化的底物的聚丙烯酰胺凝膠圖象。圖5A-B分別提供這些數據的定量圖，所述圖顯示觀察到的隨時間進程消化的ssDNA的百分比。如所預期的，當使用更低的RNA酶酶濃度時，所述測定在相同的時間段內檢測到更低水平的消化。
HIV RT RNA酶H不降解ssRNA。也進行了實驗以確定是否存在任何所述RNA酶H酶的非特異性RNA降解，所述非特異性RNA降解可能會對上面論述的結果有影響。此處，在上面描述的用于前面實驗的條件下用1U HIV RT RNA酶H酶溫育0.1μM放射性標記的ssRNA等分試樣底物，并且在變性聚丙烯酰胺凝膠上運行所述反應產物(圖6A)。作為對照，將相同的ssRNA等分試樣在相同的條件下進行溫育，但不用RNA酶H并且也在變性凝膠上運行這些對照等分試樣(圖6B)。對于各反應時間檢測到的放射性標記RNA底物的量是相似的并且沒有觀察到更小的降解產物，表明ssRNA不被所述RNA酶H酶降解。通過使用利用RNA-DNA雜交體底物(圖7C)的平行實驗監控RNA酶H活性程度并且確認這些實驗中使用的酶是有功能的。
單鏈DNA和RNA污染物不影響RNA酶H活性。
也進行了確定ssRNA和/或ssDNA污染物或反應產物是否可能影響RNA酶H活性測量的實驗，例如通過抑制該酶而影響其活性測量。首先，將含有0.1nM(5pmol)的RNA-DNA雜交體底物和1U(2.2ng或3fmol)的HIV RT酶的等分試樣與5、10和50pmol的同聚物polyA(SEQID NO3)或polyU(SEQ ID NO4)或雜聚物(18S)RNA(SEQ ID NO5)一起溫育，使得RNA-DNA雜交體底物的摩爾比例分別是1∶1、2∶1和10∶1。
同聚物polyA 5’-(A)n-3’(n≈500到1000)(SEQ ID NO3)同聚物polyU 5’-(U)n-3’(n≈500到1000)(SEQ ID NO4)18S RNA 5’-CCCUCUCUCUCUCUUAAUGGGAGUGAUUUCCCUCCUCUU(SEQ ID NO5) CGAAUAGGGUUCUAGGUUGAUGCUCGAAAAAUUGACGUCGUUGAAAUUAUAUGCGAUAACCUCGACCUUAAAGGCGCCGACGACAAG-3’將各等分試樣于37℃下溫育并且用聚丙烯酰胺凝膠(圖7)運行反應產物。用125-聚體含有明顯的二級結構的18S RNA滴定樣品確實能以劑量依賴方式抑制HIV RT RNA酶H，如通過每次反應后測量末端-標記的ssDNA的含量所確定的。然而，這種污染物不大可能存在于任何“真實的”RNA酶H測定中。不顯示任何二級結構的同聚物U和A不會抑制HIV RT RNA酶H活性。
含有0.1μM(5pmol)的RNA-DNA雜交體底物的等分試樣也進行類似的實驗并且將1U(2.2ng或19fmol)HIV RT酶與下面表I中所列的其中一個單鏈DNA寡核苷酸一起溫育。在此處稱為Oligo 1、Oligo 2和Oligo 3的這些寡核苷酸也分別由SEQ ID NO6-8確定。各ssDNA寡聚體與不同等分試樣中的底物的摩爾比是1∶1、2∶1和10∶1(即5、10和50pmol)。再一次，將所述等分試樣于37℃下溫育以允許RNA被所述RNA酶H降解，并且接著在30分鐘后猝滅并用PAGE(圖8)進行分析。所述結果表明ssRNA并不抑制HIV RT RNA酶H活性。于是，在所述測定中單鏈RNA或ssRNA的存在(例如作為酶活性的結果產生的)僅僅最小程度地影響對RNA酶活性的估計，如果不是完全沒有影響的話。
表1用RNA酶H底物滴定脫氧寡核苷酸序列Oligo 1(SEQ ID5’-GTGAGGGTAATTCTCTCTCTCTCCCAAACCCCAAA-3’NO6)Oligo 2(SEQ ID5’-ATCTTGGGATAAGCTTCTCCTCCC-3’NO7)Oligo 3(SEQ ID5’-TTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAG-3’NO8)RNA降解要求足夠的RNA酶H活性。為了確定在這些實驗中觀察到的RNA的降解確實由RNA酶H造成的而不是RT全酶的其他活性造成的，使用不同來源的RT酶進行測定。特別地將0.1μM(5pmol)的RNA-DNA底物與購自Promega(Madison，WI)的1U的HIV RT酶(2.2ng或19fmol)或1U的MMLV RT酶(10ng或15fmol)一起溫育。此外使用相同量的突變MMLV RT酶進行同樣的實驗，所述突變MMLV RT酶在前面已描述過并且被鑒定為不具有RNA酶H活性(Roth等人，J.Biol.Chem.1985，2609326；Tanese等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，851977)。
將各樣品的等分試樣于37℃下溫育＜30秒、10、20、30和60分鐘，到各時間點后猝滅所述反應并用上面以前的實驗中描述過的PAGE對反應產物進行分析。圖9A(HIV RNA酶H)、圖9B(MMLV RNA酶H)和圖9C(MMLV RNA酶H-突變體)顯示來自所述實驗的結果。通過在磷酸成象后使用體積分析定量確定反應后殘留在各等分試樣中的底物量，使用公式％底物殘留＝((底物)/(底物+產物))×100％來自本定量分析的結果標繪于圖9D中，并且確認在這些測定中觀察到的來自RNA-DNA雜交體的RNA明顯降解是功能性RNA酶H活性的結果。
實施例2對RNA酶H活性的實時測定本實施例說明優選的測定的具體實施方案，所述測定能實時檢測和監控RNA酶H活性。例舉的測定使用了包含熒光團部分和猝滅劑部分的RNA-DNA雜交體底物。所述熒光團部分包含能發射熒光或其他可檢測信號的部分。相反，所述猝滅劑部分包含能吸收由所述熒光團部分產生的信號的部分。
例如，在此處描述的例舉的實施方案中，所述熒光團部分是熒光素并且所述猝滅劑部分是dabcyl，兩者都可商業購得，例如從Stratagene(La Jolla，CA)。然而，所述熒光和猝滅劑部分的確切鑒定并不關鍵并且各種能用于本發明的這類部分可商業購得和/或通常在本領域公知。其他常見的、可以使用的熒光團的例子包括但不限于Cy3、Cy3.5、Cy5和Cy5.5(從Amersham Biosciences Corp.，Piscataway NJ商業購得)以及德克薩斯紅、熒光素、6-FAM、HEX、TET、TAMRA、羅丹明紅、羅丹明綠、羧基羅丹明、BODIPY、6-SOE、香豆素和Oregon Green，所有這些都可從例如從Molecular Probes(Eurgene，OR)或Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO)商業購得。例舉的猝滅劑部分包括DABCYL(從Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO或從Molecular Probes Eugene，OR商業購得)以及Black HoleQuenchers(“BSQs”，從Biosearch Technologies，Inc.，Novato CA商業購得)例如BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
圖10A示意地說明了可用于這類測定的DNA-RNA雜交體底物的例舉的實施方案。在本實施例中，DNA底物包含SEQ ID NO9所列的核苷酸序列，而RNA底物包含SEQ ID NO10所列的核苷酸序列。本領域技術人員理解所述DNA-RNA底物的確切序列對實踐本發明不是關鍵的。然而，所述序列優選地要具有某些特征。具體地，DNA底物序列優選地包含分別位于脫氧寡核苷酸5’-和3’端的5’-區域和3’-區域。優選地，所述5’-區域和3’-區域互補并能在測定的條件下相互雜交。所述DNA底物也優選地包含與所述RNA底物的至少一部分互補的中心區域，這樣所述DNA底物和RNA底物就能在測定條件下相互雜交，由此形成所述DNA-RNA雜交體底物。為了說明性目的，圖10A說明例舉的DNA底物具有與3’-區域(例如在所述脫氧寡核苷酸的3’端)附著的熒光團部分并且具有與5’-區域(例如在所述脫氧寡核苷酸的5’端)附著的猝滅劑部分。不過，猝滅劑部分附著到3’-區域(例如在所述脫氧寡核苷酸的3’端)和熒光部分附著到5’-區域(例如在所述脫氧寡核苷酸的5’端)的實施方案也是可預期的并且通常是同等優選的。
不受限于任何特定的理論或作用機制，據信隨著RNA酶H降解RNA-DNA雜交體底物中RNA，所述DNA的5’-和3’-區域相互退火以使寡核苷酸探針采取例如圖10B中說明的構象，使熒光團部分和猝滅劑部分充分相接近以使猝滅劑部分吸收至少部分由熒光團部分發射的可檢測信號。結果，通過檢測熒光的衰減或降低可以檢測和監控RNA酶H活性(圖10C)。
為證明其有效性，使用這種測定方式對HIV RT RNA酶H和大腸桿菌的RNA酶H1兩者都進行檢測。如上面實施例1中所描述的，制備RNA酶H酶和RNA底物(SEQ ID NO10)。根據常規方法也制備DNA寡核苷酸探針(SEQ ID NO9)并且用熒光素標記3’-端，用dabcyl標記5’-端，兩者都可從Stratagene(La Jolla，CA)商業購得。
在第一組實驗中，熒光團德克薩斯紅和DABCYL猝滅劑部分標記的寡核苷酸探針(SEQ ID NO9)與RNA(SEQ ID NO10)以摩爾比1∶1和1∶2(DNA∶RNA)進行退火。各測定在25℃下進行，反應進行于終體積為25μl的包含指明量或濃度的底物和抑制劑的50mM Tris緩沖液(pH8)中，所述緩沖液包含10mM氯化鎂、任選的氯化鉀(0到30mM)、3％甘油、1mM DTT、0.02％NP-40和50μg/ml BSA。反應期間，使用Wallac Victor熒光小平板讀出器(Perkin Elmer Life Sciences，Inc.，Boston MA)監控作為時間函數的底物水解，所述讀出器具有由濾光片設置的波長分別為585nm和615nm的激發和發射波長以及具有10nm通帶。將所述底物加入到酶樣品中以啟動反應。用與32-bitWindows Workstation軟件兼容的個人計算機監控儀器數據采集，所述軟件被設計為可以利用WindowsTM95/98/NT的全部性能。每隔30秒進行熒光測量并且標繪于圖11A。此外還進行相似的一組實驗，其中將0.1μM和0.3μM的DNA-RNA底物與0.0003和0.001U的大腸桿菌RNA酶H1于50mM Tris緩沖液(pH7.5)中溫育，所述緩沖液包含100mM氯化鈉、10mM氯化鎂、3％甘油、0.02％NP-40和50μg/ml BSA。在這些樣品中測得的熒光信號作為實時函數標繪于圖11B中。
這些數據顯示上面描述的測定方式是穩健和有效的。觀察到熒光信號的減弱是溫育時間和酶濃度兩者的函數，并且與所述酶降解RNA的速率相符。
7.引用的參考文獻本發明說明書引用和論述了眾多參考文獻，包括專利、專利申請和各種出版物。這類文獻的引用和/或論述僅用來闡明本發明的說明書，并不承認任何這類文獻是此處描述的發明的“現有技術”。所有在本說明書中引用和論述的文獻在此處將其全部內容引入作為參考，其程度就每篇文獻都單獨引入作為參考一樣。
權利要求
1.檢測核酸酶介導的靶核酸切割的方法，所述方法包括(a)將靶核酸與熒光標記的寡核苷酸探針雜交，所述探針與所述靶核酸互補并且在一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅所述熒光團的熒光信號并且(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致所述熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團的熒光信號的猝滅；(b)將所述探針-靶雜交體與具有核酸酶活性的試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割所述靶核酸并且因此釋放出完整的探針；和(c)通過測量所述熒光團的熒光信號與所述探針-靶雜交體的信號相比時信號的減少來檢測探針的釋放。
2.權利要求1的方法，其中所述試劑是具有RNA酶H活性的酶。
3.權利要求2的方法，其中所述試劑選自HIV逆轉錄酶、大腸桿菌RNA酶H1、大腸桿菌RNA酶H2、人RNA酶H1、人RNA酶H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。
4.權利要求1的方法，其中所述探針是DNA，并且所述靶是DNA:RNA雜交體底物。
5.權利要求1的方法，其中所述探針的長度至少為18個核苷酸。
6.權利要求1的方法，其中所述探針當不與所述靶核酸雜交時，采取使熒光團和猝滅劑相接近的發夾狀二級結構構象。
7.權利要求1的方法，其中所述核酸酶反應在化合物存在的情況下進行，其中與化合物不存在的情況下進行同樣反應時觀察到的下降相比，在核酸酶反應期間所述熒光團的熒光信號下降的速率差異指示所述化合物抑制或增強所述試劑的核酸酶活性的能力。
8.權利要求1的方法，所述方法還包括在核酸酶反應期間監控所述熒光團的熒光信號。
9.測量試劑的RNA酶H活性的方法，所述方法包括(a)將靶RNA與熒光標記的寡脫氧核糖核苷酸探針雜交，所述探針與所述靶RNA互補并且在一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅所述熒光團的熒光信號并且(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致所述熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團的熒光信號的猝滅；(b)將所述探針-靶雜交體與所述試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割所述靶RNA并且因此釋放出完整的探針；和(c)測量所述熒光團的熒光信號與所述探針-靶雜交體的信號相比時的減少。
10.權利要求9的方法，其中所述試劑是具有RNA酶H活性的酶。
11.權利要求10的方法，其中所述試劑選自HIV逆轉錄酶、大腸桿菌RNA酶H1、大腸桿菌RNA酶H2、人RNA酶H1、人RNA酶H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。
12.權利要求9的方法，其中所述探針的長度至少為18個核苷酸。
13.權利要求9的方法，其中所述探針當不與所述靶RNA雜交時，采取使熒光團和猝滅劑相接近的發夾狀二級結構構象。
14.權利要求9的方法，其中所述RNA酶H介導的反應在化合物存在的情況下進行，其中與化合物不存在的情況下進行同樣反應時觀察到的下降相比，在RNA酶H介導的反應期間所述熒光團的熒光信號下降的速率差異指示所述化合物抑制或增強所述試劑的RNA酶H活性的能力。
15.權利要求9的方法，所述方法還包括在RNA酶H介導的反應期間監控所述熒光團的熒光信號。
16.篩選試劑的核酸酶活性調節劑的方法，所述方法包括(a)將靶核酸與熒光標記的寡核苷酸探針雜交，所述探針與所述靶核酸互補并且在一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅所述熒光團的熒光信號并且(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致所述熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團的熒光信號的猝滅；(b)制備包含所述探針-靶雜交體的兩個樣品；(c)將所述第一個樣品的所述探針-靶雜交體與試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割所述靶核酸并且因此釋放出完整的探針；(d)在候選化合物存在的情況下將所述第二個樣品的所述探針-靶雜交體與試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性地切割所述靶核酸并且因此釋放出完整的探針，所述候選化合物正在進行其調節所述試劑的核酸酶活性的能力的測試；(e)檢測各樣品中所述探針的釋放，所述檢測是通過測量與所述探針-靶雜交體信號相比時所述熒光團的熒光信號的下降而進行的。(f)比較兩個樣品中所述熒光團的熒光信號的下降速率，其中在所述核酸酶反應期間在兩個樣品中所述熒光團的熒光信號減少的速率差異指示所述化合物抑制或增強所述試劑核酸酶活性的能力。
17.權利要求16的方法，其中與第一個樣品相比第二個樣品中所述熒光團的熒光信號的更大程度或更大相對的速率降低表示所述候選化合物是試劑的激動劑。
18.權利要求16的方法，其中與第一個樣品相比第二個樣品中所述熒光團的熒光信號的更小程度或更小相對的速率降低表示所述候選化合物是試劑的拮抗劑。
19.用于測量試劑的核酸酶活性的試劑盒，包含靶核酸和熒光標記的寡核苷酸探針，所述探針與所述靶核酸互補并且在一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅所述熒光團的熒光信號并且(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致所述熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團的熒光信號的猝滅。
20.權利要求19的試劑盒，其中所述探針長度至少為18個核苷酸。
21.權利要求19的試劑盒，其中所述探針，當不與所述靶核酸雜交時，采取使熒光團和猝滅劑相接近的發夾狀二級結構構象。
22.權利要求19的試劑盒，其中所述探針是DNA，并且所述靶核酸是DNA:RNA雜交體底物。
23.權利要求19的試劑盒，還包括試劑。
24.權利要求23的試劑盒，其中所述試劑選自RNA酶H、逆轉錄酶、大腸桿菌RNA酶H1和H2、人RNA酶H1和H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。
25.權利要求23的試劑盒，其中所述逆轉錄酶是HIV逆轉錄酶。
26.用于測量試劑核酸酶活性的測定混合物，包含靶核酸和熒光標記的寡核苷酸探針，所述探針與所述靶核酸互補并且在一末端含有熒光團而在另一末端含有猝滅基團，其中(i)當所述探針不與所述靶核酸雜交時，所述探針采取使熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅所述熒光團的熒光信號并且(ii)所述探針-靶雜交體的形成導致所述熒光團和猝滅劑充分分離以減少所述熒光團的熒光信號的猝滅。
27.權利要求26的測試混合物，其中所述探針是DNA，并且所述靶核酸是RNA。
28.權利要求26的測試混合物，其中所述探針和所述靶核酸相互雜交形成探針-靶雜交體。
29.權利要求28的測試混合物，還包含試劑。
30.權利要求29的測試混合物，其中所述試劑選自RNA酶H、逆轉錄酶、大腸桿菌RNA酶H1和H2、人RNA酶H1和H2、錘頭狀核酶、HBV逆轉錄酶和整合酶。
31.權利要求30的測試混合物，其中所述逆轉錄酶是HIV逆轉錄酶。
全文摘要
本發明提供了通過將靶核酸與熒光標記的寡核苷酸探針雜交以檢測核酸酶介導的靶核酸切割的方法，所述寡核苷酸探針與所述靶核酸互補并且在其一末端含有熒光團而在另外一末端則有猝滅基團。當所述探針不與靶核酸雜交時，探針采取使所述熒光團和猝滅劑相接近的構象以使所述猝滅劑猝滅熒光團的熒光信號，而所述探針－靶雜交體的形成導致所述熒光團和猝滅劑的充分分離以減少對熒光團熒光信號的猝滅。一旦雜交，所述方法使所述探針－靶雜交體與具有核酸酶活性的試劑接觸，所述試劑的量足以選擇性切割所述靶核酸并因此釋放出完整探針。接著通過與所述探針－靶雜交體的信號相比所述熒光團熒光信號的下降來測量探針的釋放。
文檔編號C12P19/34GK1732272SQ200380107403
公開日2006年2月8日 申請日期2003年12月22日 優先權日2002年12月23日
發明者M·W·奧爾森, J·F·奧康奈爾 申請人:惠氏公司