專利名稱：一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法及其配用的試劑盒和其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，具體涉及一種用酶比色反應測定P-羥丁酸
的方法及其配用的試劑盒和其用途。
背景技術：
目前血清|3 -羥丁酸的測定目前檢測的方法是酶動力學法，在輔酶I (NAD+)存在
的條件下，P-羥丁酸在P-羥丁酸脫氫酶的作用下生成乙酰乙酸、還原型輔酶I(NADH)及
氫離子，反應生成的還原型輔酶I (NADH)在340nm吸光度的變化可以間接反映病人血清中
的P-羥丁酸的濃度。其反應過程如下
e -羥丁酸脫氫酶
e -羥丁酸+輔酶i--^乙酰乙酸+還原型輔酶i +氫離子 但是此方法易受外源性的干擾。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，而提供一種在酶動力學法反 應測定P-羥丁酸的基礎上偶聯了一步酶反應，從而保證精確度高及其配速度快、操作簡 單的用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法。 本發明的另一個目的是提供用以實現用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用 的試劑盒。 本發明的第三個目的是一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒 的用途，用來判斷人體酮癥酸中毒程度。 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種用酶比色反應測定P-羥丁 酸的方法，所采取的措施為P-羥丁酸與輔酶I在P-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙 酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生 成最高吸光率在505nm處的紅色物質甲月替(formazane)，并在505nm波長處測定紅色物質 甲月替(formazane)吸光度的變化來定量生物樣本中P _羥丁酸的含量，其反應方程式如
下
0 -羥丁酸脫氫酶
e-羥丁酸+輔酶i---------^乙酰乙酸+還原型輔酶i+氫離子
黃遞酶
還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶I。 采取的措施還包括 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法中，上述的反應過程具體為在0. 225ml的試劑I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置于37。C水浴5分鐘，并 讀取吸光度AO，加入0. 075ml的試劑11，37"水浴5分鐘后，讀取吸光度Al， AA = Al-AO。
在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法中，所述的試劑I包括 lOOmmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/ L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括1KU/L的P -羥丁酸脫氫 酶。 在上述的一種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法中，其特征是13 -羥丁酸的含 量計算按以下公式進行計算 P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ; 其中AX =樣本吸光率A5。5 Ac =標準品吸光率A5。5Ec = P -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)。 —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成 分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及266測試/ 盒，所述的試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml ，試劑II為40ml 。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒中，所述的每個 試劑盒包含試劑I 一瓶60ml 、試劑II 一瓶20ml 、 P -羥丁酸標準品一瓶1ml 、 P -羥丁酸異 常血清對照一瓶1ml 。 —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，該測定用于判斷 人體酮癥酸中毒診斷。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途中，所依
據的原理反應方程式如下
0 -羥丁酸脫氫酶
e-羥丁酸+輔酶I---------^乙酰乙酸+還原型輔酶I +氫離子
黃遞酶
還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶1。 與現有技術相比，本發明的優點在于可線性測定生物樣本中P-羥丁酸濃度范 圍，并應用液體雙試齊U，測定P _羥丁酸所需樣本量少，僅需6 P L血清即可，此夕卜，測定時反 應時間短，操作簡單，適用于大量檢測，同時也方便通過測定血中P-羥丁酸的含量可作為 糖尿病患者病情變化的指標，為防止并發癥的產生和酮癥酸中毒形成提供了及時可靠的防 治依據。
具體實施例方式
以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的描述，但本發明并 不限于這些實施例。 本發明酶比色法反應測定13 -羥丁酸是在酶動力學法反應測定13 -羥丁酸的基礎上偶聯了一步酶反應，反應過程當中，首先P-羥丁酸在P-羥丁酸脫氫酶的作用下生成乙 酰乙酸、還原型輔酶I及氫離子，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下 反應生成紅色物質甲月替(formazane)在505nm處有最高吸光度，其反應方程式如下
e -羥丁酸脫氫酶
e-羥丁酸+輔酶i---------^乙酰乙酸+還原型輔酶i+氫離子
黃遞酶
還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶I 1.試劑組成試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶
2. P -羥丁酸測定
1)反應過程在0. 225ml的試劑I {100,1/LTris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20,1/L的草 酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫}中加入L的 0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置于37。C水浴5分鐘，并讀取吸光度A0，加入0. 075ml的 試劑II (1KU/LP -羥丁酸脫氫酶)，37t:水浴5分鐘后，讀取吸光度Al， AA = Al-AO。
2)計算及結果 |3 -羥丁酸的含量計算按以下公式進行計算 P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX A Ax/ A Ac ; 其中AX =樣本吸光率A5。5 Ac =標準品吸光率A5。5 Ec = |3 -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)， 結果13 -羥丁酸線性范圍0 4. 5mmol/L。 —種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成 分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及266測試/ 盒，所述的試劑I包括lOOmmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml，試劑II為40ml，所述的每個試劑盒包 含試劑I 一瓶60ml、試劑II 一瓶20ml、 P -羥丁酸標準品一瓶lml、 P -羥丁酸異常血清對 照一瓶lml，檢測介質血清，主要適用于體外診斷。
試劑配置 本試劑盒為液體雙試劑，可直接上機使用。如果受限于分析儀比色杯容積限制，可 以依比例(詳見試驗參數)調整試劑試劑1、樣本/標準品/血清對照及試劑試劑II使用 試劑的穩定與貯存期試劑及標準品避光保存2 8t:—年，嚴禁冷凍，P-羥丁酸
質控血清2 8t:或冷凍保存一年。
5
倍數。
樣本處理
1) 空腹采血并盡快分離血清；
2) 血清標本2 8t:保存穩定一周，_201:冷凍保存可穩定3個月。 試驗參數與操作步驟
溫度 37 °C
測試方法 終點法
啟動反應 6 ii L樣本/標準品/血清對照+225 ii L試劑I (或依比例混勻) 孵育時間 5min
終止反應力B 75 ii L試劑11 (或依比例混勻) 延遲時間 10min 測試儀 日立710Q
1. 試劑和樣品用量可因儀器不同，按比例增減。
2. 測試中P-羥丁酸正常或升高血清對照應作為陰性或陽性參照。
3. 若樣品P-羥丁酸濃度大于4. 5mmol/L，須用生理鹽水稀釋樣品，結果乘以稀釋
4. 如保存不當，試劑發現有渾濁時，應棄用。
5. 溶血對測定有干擾，操作過程中要盡量避免溶血。
參考值正常參考范圍0 0. 28mmol/L，各實驗室需要根據自身實驗條件自行制 定正常人血清e-羥丁酸范圍。 —種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，用于測定血清標 本中的13 _羥丁酸含量，從而用來判斷人體酮癥酸中毒的危險性，這里酮體是脂肪酸的代 謝產物，包括乙酰乙酸、P-羥丁酸、丙酮，其中絕大部分為P-羥丁酸，血清中P-羥丁酸 的含量可以反映酮體的含量。糖尿病患者病情與葡萄糖的利用密切相關，與脂類的代謝密 切相關。目前用于糖尿病病情監測的指標主要有血糖、糖化血紅蛋白，二者是血中糖在不同 時期的反映，不能充分說明體內脂類代謝情況和病情發展趨勢，而體內酮體的含量可反映 脂肪的代謝的狀況，血清中P-羥丁酸的測定可作為脂肪毒性作用的觀察指標。長鏈脂肪 酸長期作用胰島將損害葡萄糖氧化代謝和葡萄糖引起的胰島素分泌，加速了糖尿病患者病 情的發展，有研究表明，高脂肪酸使平滑肌細胞排列無序化，失去特征結構，變為泡沫細胞。 對血中酮體的檢測，可及時有效地控制血脂水平，有助于預防和推遲動脈粥樣硬化的發生 和發展。因此，血中P-羥丁酸的測定可作為糖尿病患者病情變化的指標，為防止并發癥的 產生和酮癥酸中毒形成提供了及時可靠的防治依據。
原理 在ra為8. 5的Tris-HCL緩沖液體系下血清P-羥丁酸與輔酶I在P-羥丁 酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I。生成的還原型輔酶I和碘硝基四 氮唑紫(INT)在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在50511111處的紅色產物-甲月替 (formazane)，據此可在505nm波長處測定紅色產物吸光度的變化來定量生物樣本中P _羥
丁酸的含量，所依據的原理其反應過程為
6e -羥丁酸脫氫酶
e -羥丁酸+輔酶i--^乙酰乙酸+還原性輔酶i+氫離子
黃遞酶
還原性輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(forraazane)(紅色)+輔
酶I (AMax = 505nm) 本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬技術領 域的技術人員可以對所描術的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替 代，但并不會偏離本發明的精神所定義的范圍。
權利要求
一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法，其特征是β-羥丁酸與輔酶I在β-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在505nm處的紅色物質甲月替(formazane)，并在505nm波長處測定紅色物質甲月替(formazane)吸光度的變化來定量生物樣本中β-羥丁酸的含量，其反應方程式如下F2009101556381C00011.tif
2. 根據權利要求l所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是上述的反應過程具體為在0. 225ml的試劑I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置 于37t:水浴5分鐘，并讀取吸光度AO，加入0. 075ml的試劑11，37t:水浴5分鐘后，讀取吸 光度Al， AA = Al-AO。
3. 根據權利要求2所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是所述 的試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmo1/ L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括1KU/L的 P-羥丁酸脫氫酶。
4. 根據權利要求3所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是P-羥 丁酸的含量計算按以下公式進行計算P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ;其中^=樣本吸光率~。5Ac二標準品吸光率A^Ec = 13 -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)。
5. —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，其特征是所述的試劑盒 由以下成分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及 266測試/盒，所述的試劑I包括100,1/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20,1/L 的草酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑 II包括1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml ，試劑II為40ml 。
6. 根據權利要求5所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，其 特征是所述的每個試劑盒包含試劑I 一瓶60ml 、試劑II 一瓶20ml 、 P -羥丁酸標準品一 瓶lml、 13 -羥丁酸異常血清對照一瓶1ml 。
7. —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，其特征是該測定 用于判斷人體酮癥酸中毒診斷。
8. 根據權利要求7所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，其特征是所依據的原理反應方程式如下 <formula>formula see original document page 2</formula>
全文摘要
本發明提供了一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法及其配用的試劑盒和其用途。在Tris-HCL緩沖液體系下血清β-羥丁酸與輔酶I在β-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在505nm處的紅色物質甲月替(formazane)，據此可在505nm波長處測定紅色產物吸光度的變化來定量生物樣本中β-羥丁酸的含量。本法可線性測定生物樣本中β-羥丁酸濃度范圍(0～4.5mmol/L)，該測定用于判斷人體酮癥酸中毒診斷，本發明所用試劑應用液體雙試劑，測定β-羥丁酸所需樣本量少，此外，測定時反應時間短，操作簡單，適用于大量檢測。
文檔編號C12Q1/32GK101726463SQ200910155638
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者張聞 申請人:張聞