專利名稱：：一種檢測土壤硝酸還原酶活性的分析方法
技術領域：
：本發明涉及土壤中硝酸還原酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中硝酸還原酶活性的分析方法。技術背景土壤中的硝酸還原酶能將土壤氮代謝過程中形成的硝態氮還原生成亞硝態氮，土壤中的還原態化合物可作為氫的供體。硝酸還原酶N03—-N-N0「-N+2H因此，土壤中硝酸還原酶活性的強弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氣態損失，間接影響氮肥的利用效率和大氣的氮污染。土壤中硝酸還原酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質地的強烈影響，同時也受到農田耕作制度、管理措施以及不同種植作物的影響。因此，對土壤中硝酸還原酶活性的檢驗有很重要的意義。而到目前為止，有關硝酸還原酶活性的測定基本都是參照①.X.哈茲耶夫[蘇]著，鄭洪元、周禮愷、張德生譯的《土壤酶活性》和Kandeler(1995)的《Methodsinsoilbiology》等書中的方法。該種方法步驟比較繁瑣，需用專用的試劑瓶和抽濾裝置進行抽真空培養，且培養批次的不同具有差異性和不確定性，使其難以適應土壤中硝酸還原酶活性的定性比較和定量研究；同時，該種方法樣品的前期處理比較麻煩，降低了實驗的效率，增加了實驗結果的不準確性。
發明內容本發明的目的在于提供一種檢驗土壤中硝酸還原酶活性的分析方法。該方法是在借鑒前人測定方法的原理基礎上，對硝酸還原酶活性的測定步驟和顯色方法進行了部分改進(對其樣品的處理方法和測定方法進行改進)，從而減少樣品處理和試驗步驟的復雜性，使分析結果更加精確可靠，分析重現性更好。為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為一種檢測土壤中硝酸還原酶活性的分析方法，1)稱取0.5-lg過0.5-1.5mm篩的土壤風干樣品n份分別裝入n支試管中，n>2，向試管中分別加入1-3mL0.5-lmM/L的2，4-二硝基酚溶液，混勾；然后向其中n-l支試管中加入1-1.5mL重量濃度0.05-0.15%的底物KN0r溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；再向試管中分別加入l-2mL重量濃度0.5%-1%的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5-10mL，搖勻，塞上不透氣的橡膠塞后29-3rC恒溫培養24h;同時作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)；2)培養結束后，用10-40mL蒸餾水將試管內的土液混合物完全轉移至100mL的三角瓶中，再用蒸餾水補充至50-100mL;3)加入鋁鉀礬飽和溶液l-2mL,振蕩，過濾；4)取濾液lmL于50mL容量瓶中，加入1-3mL蒸餾水和4-8mL顯色劑(相對于亞硝酸根離子過量)，然后用蒸餾水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下用分光光度計比色測定吸光值A;5)標準工作曲線的制備吸取亞硝酸根標準儲備液].mL,定容至100mL,此為2.5mgN0廣N/L的溶液。再分別吸取該液0、1、2、3、4、5mL于50mL容量瓶中，加少量蒸餾水和4mL顯色劑，并用蒸餾水定容。此標準系列含亞硝態氮的量分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgN(V-N/L。在520nm下比色測定一系列已知濃度的NO廣N標準溶液的吸光值A'，以N02--N溶液的濃度和吸光值A'制作工作標準曲線，得到斜率b;6)根據吸光值A和斜率b,計算所測定溶液中亞硝酸根的濃度S，S=A*b;7)計算樣品中亞硝酸根含量；8)計算硝酸還原酶活性計算公式為[(S「S2)承50承V/1000承V2]/W.T=mgNO廠N/g土.24h式中S,為樣品中的N02-N的含量(mg/L);S2為樣品對照中的N02-N的含量(mg/L);50為定容的溶液體積(mL);V,為提取液總體積(mL);V2為吸取濾液的體積(mL);W為稱土樣重(g);T為培養土樣的時間(h);IOOO為單位轉化系數。對于酸性土樣品，分析前應調解其PH為7-8.5，可采用加入碳酸鈣的方法調解，每支試管中分別加入15-25mgCaC03,混勻后再向試管中分別加入1-3mL0.5-lmM/L的2,4-二硝基酚溶液，混勻。(對于石灰性土壤而言，碳酸鈣無需加入，因為土壤本身的PH值即可以滿足微生物的最適pH)。厭氧培養所使用的蒸餾水，使用前，需將其加熱至沸騰驅除水中的02,然后封閉冷卻至室溫。所述顯色劑為重量濃度35%的醋酸配制的重量濃度0.154的a-萘胺溶液和重量濃度0.5%的對氨基苯磺酸溶液等體積的混合液，而它們的加入相對于亞硝酸根為過量的。本發明方法改進的依據土壤硝酸還原酶與亞硝酸還原酶、土壤羥胺還原酶一樣都是參與土壤中氮素代謝的還原酶類。它們在測定過程中均需要厭氧培養條件。亞硝酸還原酶活性的測定方法則是以亞硝酸鈉(NaN02)為底物，經過24小時厭氧培養，通過單位時間內N021的減少量來表征；羥胺還原酶活性的測定則是以羥胺(NH力H)為底物，經過5小時厭氧培養，通過單位時間內羥胺的減少量來衡量羥胺還原酶的活性。與此相同，本方法中硝酸還原酶活性測定則是以硝酸鉀UN03)為底物，通過加入2，4-二硝基酚抑制亞硝酸還原酶的活性，經過24小時的厭氧培養，通過檢測單位時間內N02—-N的生成量來表征硝酸還原酶的活性。加入5-10mL排除溶解氧的液封，目的就是為培養試驗創造良好的厭養環境。本發明所使用的反應原理為利用硝酸鉀為底物，土樣在厭氧條件下，3(TC恒溫培養24h。亞硝酸還原酶通過加入2，4-二硝基酚抑制。在硝酸還原酶的作用下將硝態氮還原為亞硝態氮，產生的亞硝酸根與rpncc試劑反應顯色，520nm比色測定酶促反應后生成的亞硝態氮的量，來表征硝酸還原酶的活性。與過去的分析方法相比較，本發明的優點主要有1)所需設備簡單、降低了試驗成本。本發明中的培養試驗是在直徑10-15mm、長為100-150mm的普通玻璃試管中進行，不需用原來方法中提及的用來實現抽真空的帶磨口塞的專用真空瓶及真空泵。2)與傳統的酚二磺酸比色法相比，此種顯色方法更加簡單，本發明所使用的顯色方法靈敏度更高，大大提高了分析的準確度。3)操作簡單，分析結果穩定可靠，重現性好。原來方法需要設置滅菌土壤作為對照，本方法只需要一個不加底物的溶液作為對照；同時，由于本發明所涉及到的培養方法減少了厭氧培養過程的復雜性和不確定性，故分析結果重現性非常良好。4)簡化了操作步驟。土面位于液面以下就是為了創造培養所需要的厭氧環境，減少對抽氣設備及真空環境的依賴性。具體實施方式1.0.05%-0.15°/。的KN03溶液:稱取0.05-0.15gKN03用蒸餾水定容至100mL。2.0.5%-1%的葡萄糖溶液準確稱取0.50-1.OOg葡萄糖，用蒸餾水定容至100mL。3.碳酸鈣分析純試劑。4.鋁鉀鞏飽和溶液將硫酸鉬鉀溶于蒸餾水中，直至過飽和。5.顯色劑1(rpiicc試劑)用比重為1.04的醋酸分別配制0.ly。的oc-萘胺溶液和O.5%的對氨基苯磺酸溶液(b),用前將等體積a、b混合即成。比重1.04的醋酸(相當于重量百分數35%的醋酸)配置取175mll00y。的醋酸，定容至500ml，即為35%，比重1.04的醋酸。稱取0.2goc-萘胺用重量百分數35%，比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml，此為(a)液。稱取1，Og對氨基苯磺酸用重量百分數35%,比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml,此為(b)液。6.2,4-二硝基酸溶液(2,4-DNP,0.8mM):稱取0.1481g2，4-DNP于蒸餾水中，用蒸餾水定容至1000mL。加熱使之全部溶解。在5-300|ig2,4-DNP范圍內測定每個土類的最適抑制劑用量。7.標準貯備液(250mgN02—-N/L):溶解1.2314gNaN02并用蒸餾水定容至1000ml，放于4'C冰箱中保存，保存時間不宜過久，以不超過數周為宜。8.作標準曲線的制備吸取上述標準貯備液lml,定容至100ml,此為2.5mgN02—-N/L的溶液。再分別吸取該液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加少量蒸餾水和4ml顯色劑，并用蒸餾水定容。此標準系列含亞硝態氮的量分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgN02—-N/L。在520nm下比色測定一系列已知濃度的NaN(V溶液的吸光值A'，以NaN02溶液的濃度和測定的吸光值A'制備標準曲線，得到斜率b;搡作步驟-.1)稱取lg過l隱篩的土壤風干樣品4份于4支試管中，分別加入20mgCaCO3,混勻后向試管中分別加入lmL0.8mM/L的2,4_二硝基酚溶液，混勻；然后向其中3支試管中加入l-1.5mL0.05%-0.15%的底物KNOr溶液，另l支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；再向試管中分別加入l-2mL0.5%-ly。的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5-10mL,搖勻，塞上不透氣的橡膠塞后3(TC(士rC)恒溫培養24h;同時作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)；2)培養結束后，用30mL蒸餾水將試管內的土液混合物完全轉移至100mL的三角瓶中，再用蒸餾水補充至50mL;73)加入鉬鉀礬飽和溶液lmL，振蕩，用致密濾紙過濾；4)取濾液lmL于50mL容量瓶中，加入少量蒸餾水和4mL的顯色劑(相對于亞硝酸根過量)，然后用蒸餾水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下用分光光度計比色測定吸光值A;5)根據吸光值A和斜率b,計算所測定溶液中亞硝酸根的濃度S，S=A*b;6)計算樣品中亞硝酸根含量；7)計算硝酸還原酶活性計算公式為[(S「S2)承50來vyi000承V2]/W.T=mgN02_N/g土.24h式中S,為樣品中的N02-N的含量(mg/L);S2為樣品對照中的NO廠N的含量(mg/L);50為定容的溶液體積(mL);V!為浸體液總體積(mL);V2為吸取濾液的體積(mL);W為稱土樣重(g);IOOO為單位轉化系數；T為土壤培養的時間(h)。實施例1本實施例所使用的黑土釆自于中國科學院海倫生態試驗站，設三個不同的處理l號位對照，既不經過任何處理和添加任何土壤添加劑在25。C培養24h以上的普通土壤；2號為添加硝化抑制劑DCD且在25。C培養24h以上的土壤；3號為添加硝化抑制劑DMPP且在25。C培養24h以上的土壤。土壤含水量均為20%(風干土重)。2號和3號添加硝化抑制劑的土壤，其中兩種抑制劑的添加量都是50卯m，用上述方法檢測三種硝酸還原酶的活性。每種土壤得具體分析步驟如下1)稱取lg過l醒篩的土壤風干樣品4份于4支試管中，分別加入20mgCaCO3,混勻后向試管中分別加入lraL0.8mM/L的2,4-二硝基酴溶液，混勻；然后向其中3支試管中加入lmL0.05%的003溶液，另l支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；再向試管中分別加入lmL1%的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至10mL,搖勻，塞上不透氣的橡膠塞后3(TC"rC)恒溫培養24h;同時作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)；2)培養結東后，用30mL蒸餾水將試管內的土液混合物完全轉移至100mL的三角瓶中，再用蒸餾水補充至50mL;3)加入鋁鉀礬飽和溶液lmL,振蕩，用致密濾紙過濾；4)取濾液lmL于50mL容量瓶中，加入少量蒸餾水和4mL的顯色劑(相對于亞硝酸根過量)，然后用蒸餾水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下用分光光度計比色測定吸光值A;5)根據吸光值A和斜率b,計算所測定溶液中亞硝酸根的濃度S,S=A*b;6)計算樣品中亞硝酸根含量;7)計算硝酸還原酶活性。試驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表中數據可以看出，各處理之間結果差異達到顯著水平，較小的標準差值表明該分析方法結果之間的偏差較小，精確度較高，重現性好。實施例2本實施例所使用的三種不同種植作物的棕壤均釆于中國科學院沈陽生態實驗站其中4號土壤前茬作物為水稻，5號土壤前茬作物為玉米，6號土壤前茬作物為大豆。三種不同耕作制度的土壤均在含水量為20%(風干土重)，溫度在25。C條件下培養24h以上，測定其硝酸還原酶活性，具體步驟如下底物硝酸鉀濃度為0.1%,加入0.50mL,葡萄糖濃度為1%,加入lmL,其余步驟同實例1。試驗結果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中數據同樣顯示了分析結果的穩定性及較高的精密度。權利要求1.一種檢測土壤中硝酸還原酶活性的分析方法，其特征在于1)稱取0.5-1g過0.5-1.5mm篩的土壤風干樣品n份分別裝入n支試管中，n≥2，向試管中分別加入1-3mL0.5-1mM/L的2，4-二硝基酚溶液，混勻；然后向其中n-1支試管中加入1-1.5mL重量濃度0.05-0.15％的底物KNO3溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；再向試管中分別加入1-2mL重量濃度0.5％-1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5-10mL，搖勻，塞上不透氣的橡膠塞后29-31℃恒溫培養24h；同時作試劑空白對照；2)培養結束后，用10-40mL蒸餾水將試管內的土液混合物完全轉移至100mL的三角瓶中，再用蒸餾水補充至50-100mL；3)加入鋁鉀礬飽和溶液1-2mL，振蕩，過濾；4)取濾液1mL于50mL容量瓶中，加入1-3mL蒸餾水和4-8mL顯色劑(相對于亞硝酸根離子過量)，然后用蒸餾水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下用分光光度計比色測定吸光值A；5)在520nm下比色測定一系列已知濃度的亞硝酸根標準溶液的吸收值A’，以亞硝酸根的濃度和測定的吸光值A’制作工作標準曲線，得到斜率b；6)根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中亞硝酸根的濃度S，S＝A*b；7)計算樣品中亞硝酸根含量；8)計算硝酸還原酶活性計算公式為[(S1-S2)*50*V1/1000*V2]/W.T＝mgNO2-N/g土.24h式中S1為樣品中的NO2-N的含量(mg/L)；S2為樣品對照中的NO2-N的含量(mg/L)；50為定容的溶液體積(mL)；V1為提取液總體積(mL)；V2為吸取濾液的體積(mL)；W為稱土樣重(g)；T為培養土樣的時間(h)；1000為單位轉化系數。2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于對于酸性土樣品，分析前應調解其PH為7-8.5,可釆用加入碳酸鈣的方法調解，每支試管中分別加入15-25mgCaC03,混勻后再向試管中分別加入l-3mL0.5-lmM/L的2，4-二硝基酚溶液，混勾。3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于厭氧培養所使用的蒸餾水，使用前，需將其加熱至沸騰驅除水中的02，然后封閉冷卻至室溫。4.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述顯色劑為重量濃度35%的醋酸配制的重量濃度0."/。的a-萘胺溶液和重量濃度0.5%的對氨基苯磺酸溶液等體積的混合液，而它們的加入相對于亞硝酸根為過量的。全文摘要本發明涉及一種檢測土壤中硝酸還原酶活性的分析方法1)稱取過篩的土壤風干樣品n份于試管中，向試管中分別加入2，4-二硝基酚溶液，混勻；然后向其中n-1支試管中加入底物硝酸鉀溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；再向試管中分別加入葡萄糖溶液，用蒸餾水補充至5-10ml，恒溫培養；2)用蒸餾水補充至50-100ml；3)加入鋁鉀礬飽和溶液，振蕩，過濾；4)取濾液加蒸餾水、顯色劑，在520nm下測定吸光值A；5)計算樣品中亞硝酸根含量。本發明優點為1)簡化了操作步驟，減少了厭養培養過程的復雜性和不確定性；2)減少對設備要求的依賴性；3)準確度高，易操作；4)結果穩定可靠，重現性好。文檔編號G01N1/28GK101271060SQ200710010680公開日2008年9月24日申請日期2007年3月21日優先權日2007年3月21日發明者史云峰,武志杰,陳利軍,雋英華申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所