一種生產hiv－1的gag病毒樣顆粒的方法

專利名稱：一種生產hiv－1的gag病毒樣顆粒的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產HIV-1 Gag病毒樣顆粒的方法、由該方法制得的病毒樣顆粒以及該病毒樣顆粒在疫苗中的應用。
背景技術：
HIV基因組包括三個主要的開放閱讀框架(open reading frame)。gag開放閱讀框架(圖1)編碼一分子量為55kDa的前體蛋白質(Pr55Gag)，該前體蛋白質在病毒體成熟過程中被一種編碼HIV的蛋白酶進一步分解為三個主要的結構蛋白質、一個調節區和兩個間隔肽(spacerpeptides)(Luciw，1996)。該結構蛋白質包括基質(MA)蛋白質(P17-AA1至AA132)，衣殼(CA)蛋白質(P24-AAl33至AA363)及核衣殼(NC)蛋白質(P9-AA377至AA432)。該調節區(P6)跨越AA449-AA500，而該間隔區P1和P2分別位于AA433至AA448和AA364至AA376(von Schwedler等，1998)。
Pol開放閱讀框架從AA430處與gag的開放閱讀框架重疊，并且通過一種在翻譯過程中、以5-10％的頻率發生的核糖體移碼現象(ribosomal frame-shifting event)而產生一種分子量為160kDa的Gag-Pol前體蛋白質(Pr160)(Jacks等，1988)。該pol基因編碼若干開放閱讀框架，包括HIV-1的蛋白酶、逆轉錄酶、核糖核酸酶H及整合酶。Env開放閱讀框架位于pol的下游并且編碼一種分子為160kDa、病毒包膜蛋白質gp41和gpl20的前體蛋白質(gpl60)(Luciw，1996)。
感染了宿主細胞后，HIV-1的RNA就會逆轉錄成DNA，該DNA隨后整合到宿主的基因組中(前病毒期)。該Gag前體和Gag-Pol前體被從細胞液中被轉錄的HIV-1前病毒RNA翻譯并導向該宿主細胞膜。該Gag前體與兩份病毒RNA結合并且與Gag-Pol前體相互作用，以形成沿宿主細胞膜排列的顆粒樣結構。他們以這樣的方式聚集以誘導膜彎曲及隨后的芽形成，在此期間，病毒Env蛋白質也參與顆粒的形成。在該顆粒從膜上脫離(pinch off)之后，該HIV-1顆粒成熟，同時蛋白質酶將Gag和Gag-Pol分解為成熟的結構蛋白質和功能蛋白質，使得核濃縮及由此產生一成熟的傳染性病毒。
在哺乳動物和昆蟲細胞中，在沒有任何其它編碼HIV基因的情況下，Pr55 Gag曾被顯示組裝入病毒樣顆粒(VLPs)中。這些顆粒與未成熟的HIV病毒的形態非常相似并且是非傳染性的(Overton等，1989；Gheysen等，1989；Royer等，1991；Royer等，1992；Shioda和Shibuta，1990；Vernon等，1991；Mergener等，1992)。人們發現許多的Gag區在驅使該顆粒的裝配過程中具有重要作用，并且，事實上約80％的這種前體蛋白質可以被缺失或被異源序列置換而不會明顯影響VLP的產生(Accola等，2000)。關于各個含有Gag的蛋白質的功能，將下在面討論這些重要的區域。
MA蛋白質(p17)Gag的MA區(圖2)包括132個氨基酸，并且負責將Gag蛋白質導向質膜及病毒樣顆粒的裝配。位于MA的N端的M區(逆轉錄酶病毒膜聯區(membrane-binding domain))主要擔負此功能。MA具有一N端甘氨酸殘基，該殘基被發現是將Gag導向宿主細胞膜和便于顆粒裝配所必須的(Gheysen等，1989)。為了實現上述功能，該甘氨酸殘基必須經過十四烷基化(myristylated)。Gag的N端上發生十四烷基化的氨基酸識別序列是gly-x-x-x-ser/thr。
已證明在宿主細胞膜上，經過十四烷基化的HIV-1 Gag前體的導向和積累發生在感染桿狀病毒(baculovirus-infected)的酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞內(Jacobs等，1989；Gheysen等，1989；Bryant和Ratner，1990)。甘氨酸殘基的取代會破壞(erradicated)顆粒的形成，甘氨酸殘基的互補會恢復VLP的生產，并且當使用myr-突變株時，人們發現Gag前體在感染細胞的胞質中積累，但并不與宿主細胞膜相連。因此，該十四烷基部分是穩定地結合膜和顆粒所必需的。只有完全抑制Gag的十四烷基化，才能防止VLP出芽(Morikawa等，1996)，也就是說，僅僅少數十四烷基化的Gag分子就足以完成質膜的導向和出芽。
Spearman(1997)曾指出豆蔻酸是Gag-宿主細胞膜穩定的主要決定因素，因此對于顆粒裝配具有重要作用。Paillart和Gttlinger(1999)曾提出一種模型，其結果顯示Gag的N端對于插入宿主細胞膜是至關重要的。
除了該十四烷基化信號，有資料表明MA的其他區域對于將Gag導向宿主細胞膜及隨后的顆粒裝配是重要的。Fcke等(1993)提出MA的大部分缺失(AA16-99)會導致顆粒形態的顯著改變，從而使得在內質網中產生未成熟顆粒。對于將包膜蛋白正確地裝配入病毒，MA是必需的。
Yuan等(1993)指出各種MA缺失和置換導致病毒顆粒的產生顯著降低。他們證明MA的多堿區(polybasic region)(AA20-32)作為到膜的Gag轉運信號的一部分是可能的。
Zhou等(1994)進一步研究了該多堿區，并且指出該高堿性殘基形成一個帶正電荷表面，該帶正電荷表面與胞質的脂雙層的內表面上的帶負電荷的磷脂相互作用。Ono和Freed(1999)曾指出MA的一個單突變(AA6從V至R)可以嚴重地削弱膜結合而不影響十四烷基化。
衣殼(CA)蛋白質(p24)CA區(圖3)編碼一個長度約為230個氨基酸的蛋白質，并且具有若干個可能對顆粒裝配起重要作用的區域，其中的第一個區為主要的同源區(MHR)。從CA下游的N端延伸到MHR的區域對于顆粒的形成不是必要的，但任何進一步延伸至MHR的進一步缺失都會削弱顆粒的生產(Borsetti等，1998)。Zhao等，(1994)也提出包括一個AA140-150的10個氨基酸缺失和一個AA250-260的間隔缺失的HIV-1 CA的桿狀病毒結構可導致在昆蟲細胞的細胞膜上積累病毒蛋白質。然而，沒有顆粒裝配或胞外出芽表明CA的這兩個區至少，必須在正常的顆粒形成中扮演某種角色。
另一方面，Borsetti等(1998)指出在MA(除了該十四烷基錨以外)和該CA區的N端都不存在的情況下，可以形成有效的顆粒，因此，可推定在十四烷基錨和MHR之間沒有明顯的區域對于有效顆粒的釋放或裝配是絕對必要的。他們推定Gag的C端一半(C-terminal half of Gag)包括蛋白質-蛋白質相互作用區，該區對于有效顆粒的裝配是必要的。
似乎該C端序列是蛋白質-蛋白質相互作用所必需的，但不是球形顆粒的形成所必需的，該球形是由CA區上的N端延伸的存在決定的。
人們(Gheysen、Shioda和Shibuta)報導過該顆粒中存在RNA(大小不均一且是病毒及細胞源的)。
還有關于截斷P2間隔區以破壞顆粒的形成的報導。
間隔區2(p2)Borsetti等于1998年指出，p2的存在或缺乏分別決定將Gag蛋白質裝配到球形顆粒或圓柱狀顆粒。Morikawa等(2000)也證實了該區對于VLP的生產是必需的，因為如果該區被以任何方式截斷，VLP的生產就被破壞了。
核衣殼(NC)蛋白質(p7)已證實該NC區(圖4)包括兩個高度保守的Cys-His盒，該盒類似于經常出現在DNA結合蛋白質中的鋅指基序(zinc finger motifs)。該盒被認為在RNA結合和衣殼化中起作用，但是也影響顆粒裝配的其他方面。有兩個高堿性區在這兩個鋅指基序的側面，這兩個鋅指基序被提出對體外的RNA結合有影響并且，如果其被突變，則會影響RNA衣殼化進入病毒體。Jowett等(1992)指出該第二Cys-His盒的缺失并不影響顆粒形成，但顯著降低了RNA結合。然而，他們還指出兩個Cys-His盒的缺失促進大顆粒的形成和RNA結合的降低。Cys-His盒上游序列的缺失使得顆粒形成能力完全被破壞。
Dawson和Yu(1998)提出該NC區對于HIV-1的有效裝配是必要的，而且對于生產野生型濃度(wildtype density)顆粒是必要的。
除該Cys-His盒外，人們還發現靠近NC的N端的一個I區(相互作用區或裝配區)，其負責Gag蛋白質復合體的形成，也負責質膜Gag蛋白質的點狀轉化灶(punctate foci)的形成。有兩個帶有正電荷的堿性精氨酸殘基(AA380和AA384)已被指出對于該N端I區(相互作用區或裝配區)的功能是至關重要的。Sandefur等(2000)曾提出I區-缺陷型突變株阻斷出芽VLP的形成。
間隔區1(p1)CA和NC被一個短的間隔區SP1分隔，該間隔區SP1為蛋白酶剪切位點。Wiegers等(1998)曾指出當從NC處剪切SP1被阻斷，顆粒的成熟就會被延遲，并且該核糖核蛋白核心具有一不規則結構。然而，當從CA處剪切SP1被阻斷，產生了核糖核蛋白核心的正常凝聚，但是衣殼凝聚被抑制了。他們因此推定HIV成熟是一個連續過程，該過程由在單獨位點處的剪切率所控制。
P6蛋白質在Gag的C端區(P6)(圖5)內具有控制顆粒大小的重要因素，因為有資料表明該區的各種缺失和置換誘導非常大的顆粒的形成(Garnier等，1998)。在P6中，一個被稱為晚(L)區的特定間隔區已被確定對于病毒-細胞分離步驟具有重要作用。該區有一PTAPP氨基酸序列。人們認為，P6中該區的下游序列對于病毒釋放是不必要的。
Gag景響VLP形成的其他特征Buck等(2001)最近發現HIV-1 Gag開放閱讀框架的mRNA顯示了啟動Gag翻譯起始、生產40kDa Gag蛋白質的內部核糖體插入位點(IRES)的活性。該IRES位于靠近CA的N端的一個內部AUG密碼子處。由于翻譯的起始被認為是在與該mRNA帽結構無關的其他宿主細胞因子的參與下，被核糖體的直接結合啟動的，因此，當Gag在體外系統中表達時，就會產生結果。
VLP裝配和釋放所需的最小HIV-1 Gag序列盡管有人已報道了Gag的許多區在Gag VLP裝配和釋放中具有獨特的功能，但Gag的缺失突變株顯示其中多個區不是必要的，并且有人已提出VLP的裝配對于Gag蛋白質的重要修飾有令人驚訝的耐受性(Wang等，1998；Accola等，2000；Wilk等，2001)。Wang等(1998)制備了系列C端截短型突變體，并用之檢測生產VLP的能力。缺乏大部分的C端Gag的截短型Gag前體被裝配到顆粒中并被從哺乳動物細胞中釋放出來。缺失大部分的MA和整個P6區的突變體仍然產生顆粒，盡管所產生的顆粒少于野生型顆粒。能夠進行VLP裝配的最小Gag是一個28kDa的蛋白質，該蛋白質由少量MA氨基酸和CA-p2區組成。當大部分的MA區缺少時，CA的N端部分似乎是至關重要的，意味著需要一完整的CA區裝配和釋放顆粒。Accola等(2000)提出80％的Gag可缺失或被異源性序列置換而不會顯著地破壞VLP的產生。該仍能有效地形成VLP的最小嵌合分子為16kDa。該結構含有一酵母轉錄因子GCN4的亮氨酸鋅區以取代核殼體的裝配功能，其后還有一PPPPY基序以提供L區功能，并且該結構僅保留該十四烷基化信號和Gag的C端CA-p2區。
Gag引起免疫反應的能力對付AIDS流行的長期辦法是通過用一種適當的疫苗進行免疫，并且有目前用于開發疫苗的大量的HIV-1基因和抗原表位。盡管到目前為止沒有使用Gag疫苗，但是許多的研究已表明在感染HIV-1的病人及被新疫苗攻擊的動物中，該蛋白質誘導一種免疫反應(Friedman等2000；Revskaya和Frankel，2001)。有文章表明該反應在某些情況下是體液和細胞共同介導的(Qui等，1999；Leung等，2000；Qui等，2000；Montefiori等，2001；Kazanji等，2001)。
Goulder等(2000)已研究確定該抗原表位決定被全球流行病沖擊最嚴重的族群和年齡群中的CTL反應。他們集中在Gag上，因為許多的Gag特異性反應被發現是與HIV感染中的保護反應有關(Nixon和McMichael，1991；Riviere等，1995)。該優勢免疫Gag-特異CTL反應似乎集中在3個高度免疫原區，該3個區橫跨Gag p17和Gag p24蛋白質全長的16％，但其卻表現出所檢測到的三分之二的占優勢的Gag-特異CTL反應。該結果表明Gag是疫苗設計的一個理想的候選物。
植物作為疫苗源有許多的使用植物作為外源蛋白來源的例子，并且這些植物被認為是大規模蛋白質生產的可行的且有競爭力的表達系統(Doran，2000)。贊成使用其的理由包括具有大規模、低成本生物量生產的潛能、被哺乳動物病毒和其他動物病原體污染的風險較小、植物細胞正確地折疊和組裝多亞基蛋白質的能力，以及對植物食品或飼料中蛋白質口服給藥的低處理要求。因此，他們考慮一個可行的選擇，以生產外源蛋白質，該蛋白質可用作疫苗。
許多潛在有用的疫苗候選者是在植物中生產而在動物中檢驗。一種有用的用于將外源基因導入植物的技術是通過病毒載體傳遞的。
由于在外殼蛋白基因上的融合，Usha等(1993)曾使用豇豆花葉病毒(CPMV)顆粒表達在其外殼蛋白上的口蹄疫病毒(FMDV)的抗原表位。
Koo等(1999)通過將來自鼠肝炎病毒(MHV)的短抗原表位融合到煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白上，隨后使其在煙草植物中繁殖，從而得到煙草花葉病毒的雜種。
Fernández-Fernández等(2001)曾經開發了一種用于表達外源蛋白質的李痘疫病毒載體。他們用其表達一種兔出血癥病毒(RHDV)的抗原性結構蛋白，制備嵌合病毒顆粒，當該嵌合病毒顆粒被接種到兔體內，會產生一種抗RHDV的免疫反應。
還有其他許多方法用于在植物中生產疫苗候選者。McCormick等(1999)表明對TMV載體進行修飾使得該載體不僅在植物中產生單鏈Fv片段，而且將該片段分泌到質外體中。這就使得產物的收獲比不得不從葉提取物中分離該外源蛋白簡單了許多。人們還嘗試用轉基因植物生產用作疫苗候選者的外源蛋白。Mason等(1996)曾用轉基因煙草和馬鈴薯成功地生產諾沃克病毒衣殼蛋白，該蛋白在鼠中表現出免疫原性。Wigdorowitz等(1999)用轉基因紫花苜蓿植物表達一種抗FMDV的抗原蛋白，并且表明經純化后的抗原免疫的動物顯示抗病毒的免疫原性。
還有幾種在植物中生產抗HIV-1的候選疫苗的嘗試。Yusibov等(1997)曾將苜蓿花葉病毒的衣殼蛋白作為載體分子以表達來自HIV-1(V3環)的抗原肽。帶有編碼該抗原肽序列的重組病毒的體外轉錄是從DNA結構合成的，并且被用于接種煙草植物。該重組病毒顆粒被生產、純化并用于老鼠的免疫。該抗原在被免疫的老鼠體內產生特異性病毒中和抗體。Zhang等(2000)將一番茄叢矮病毒(TBSV)用作一種HIV-1p24蛋白質的表達載體。該基因作為一與TBSV外殼蛋白ORF的5′端部分的框架內融合(in-frame fusion)被導入到該TBSV基因組中。導入植物導致接種葉片內的p24融合蛋白的積累。
到目前為止，還沒有關于GAG VLPs在植物中正確裝配的能力的文獻報導。盡管曾有報導說一些蛋白質，甚至是一些HIV蛋白質在植物和昆蟲體內被裝配到VLPs中，但是許多其他的蛋白質根本沒有或不能正確地裝配到植物或昆蟲中，并且對哺乳動物的研究也不能準確地表明VLPs是否同樣可以在植物或昆蟲中產生。

發明內容
根據本發明的第一實施方式，本發明提供一種含有編碼一種HIVGag多肽的核苷酸序列的載體，其中，該編碼Gag多肽的核苷酸序列包括一個與SEQ ID NO1所述序列具有至少90％的序列一致性的序列。
根據本發明的第二實施方式，本發明提供一種含有編碼一種HIVGag多肽的核苷酸序列的載體，其中，該編碼Gag多肽的核苷酸序列包括一個與SEQ ID NO2所述序列具有至少90％同源性的序列。
上述兩種實施方式中的載體可以是一種植物病毒載體，例如，一種如pBSG1057載體的煙草花葉病毒源(tobacco mosaic virus-derived)cDNA克隆載體，或是一種馬鈴薯Y病毒屬源(potyvirus-derived)cDNA，如煙草蝕刻病毒(tobacco etch virus)(TEV)或蕪菁花葉病毒(turnipmosaic virus)(TuMV)。該載體還可以是一種含有一T源質粒結構(T-derived plasmid construct)的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。
或者，該載體可以是一種桿狀病毒(baculovirus)載體，如桿粒(bacmid)載體。
根據本發明的第三實施方式，本發明提供一種包括基本如上述載體的細胞，其中該核苷酸序列可操作地與適于該細胞表達的控制元件相連。
該細胞可以是一種植物細胞或昆蟲細胞。例如，該細胞可以是一種本塞姆氏煙草(N.benthamiana)植物細胞或一種Sf 21細胞、Sf 9細胞或類似的細胞。
根據本發明的第四實施方式，本發明提供一種生產一種HIV-1免疫原蛋白質或相關多肽的方法，該方法包括如下步驟將一載體或載體系統導入宿主細胞中，該載體或載體系統含有一編碼HIV-1免疫原蛋白質或通過取代、缺失和/或插入一個或多個核苷酸，和/或其一端或兩端的延伸或截短而衍生得到的相關多肽的核酸序列，該核酸序列具有與SEQ ID NO1所述序列至少90％的一致性；在宿主細胞中表達該核酸序列；及回收在該宿主細胞中所生產的HIV-1免疫原蛋白質或相關多肽。
根據本發明的第五實施方式，本發明提供一種生產一種HIV-1免疫原蛋白質或相關多肽的方法，該方法包括如下步驟將一載體或載體系統導入宿主細胞中，該載體或載體系統含有一編碼HIV-1免疫原蛋白質或通過取代、缺失和/或插入一個或多個核苷酸，和/或其一端或兩端的延伸或截短而衍生得到的相關多肽的核酸序列，該核酸序列具有與SEQ ID NO2所述序列至少90％的一致性；在宿主細胞中表達該核酸序列；及回收在該宿主細胞中所生產的HIV-1免疫原蛋白質或相關多肽。
該載體和宿主細胞可以是基本如上所述的載體和宿主細胞。
根據本發明的另一實施方式，本發明提供一種基本如上述方法生產的HIV-1蛋白質或多肽。
該蛋白質可以是一種HIV-1 Pr55 Gag蛋白質，且可以被裝配成病毒樣顆粒(VLPs)的形式。
根據本發明的另一實施方式，本發明提供一種用于治療或預防哺乳動物感染HIV的疫苗，該疫苗包括基本如上所述的蛋白質或多肽的病毒樣顆粒。
該疫苗可誘導一種針對適當易感宿主中病毒樣顆粒的免疫反應。
該疫苗可包括一種藥學上的賦形劑和/或輔料，以及一種治療上的有效劑量的病毒樣顆粒。


圖1所示為HIV-1基因組的gag的開放閱讀框架；圖2所示為圖1的gag基因的基質(MA)蛋白(p24)區；圖3所示為圖1的gag基因的衣殼(CA)蛋白(p24)區；圖4所示為圖1的gag基因的核衣殼(NC)蛋白(p7)區；圖5所示為圖1的gag基因的p6蛋白質區的區；圖6所示為用于克隆至pBSG1057(SEQ ID NO1)中的Du422 gag序列的DNA序列。粗體下劃線表示該gag基因，虛線下劃線表示部分pol框；
圖7所示為pBSG1057的質粒圖；圖8所示為pBSGgag6的質粒圖；圖9所示為pBSGgagpot11的質粒圖；圖10所示為天然的Du422 gag序列(SEQ ID NO2)的DNA序列；圖11所示為通過使用anti-p17單克隆抗體(Chemicon公司)免疫截留(immunotrapped)到碳包網(carbon-coated grids)上的由于gagopt表達產生的HIV-1亞型C Pr55 Gag VLPs(該條形表示100納米)。
圖12所示為(a)在轉染Sf21細胞中產生的HIV-1亞型C Gag VLP和(b)從Sf21質膜出芽進入細胞外介質的Gag VLP(條形代表100納米)；圖13所示為圖6的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO3)；及圖14所示為圖10的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
具體實施例方式
現參照本發明的具體實施方式
，對本發明進行更詳細的描述。
將Gag克隆到TMV載體pBSG1057通過使用大規模生物技術公司(Large Scale Biology Corporation)的載體質粒pBSG1057，可在煙草中獲得瞬時表達。當在體外被轉錄成RNA時，該載體提供一種表達天然或植物密碼子優化的Du422 Pr 55 Gag的易感工程煙草花葉病毒。
該Gag基因來自HIV-1分離DU422株(得自南非性工作者組，在歐洲細胞培養物保藏中心的臨時保藏號為01032114)(圖6)。該Gag基因包括整個Gag基因序列和pol基因序列的前57個堿基(SEQ ID NO2)。該Gag基因被克隆到一個大腸桿菌載體pGEM-T easyTM的EcoRI和SalI限制性酶位點內。該基因兩端通過PCR擴增進行修飾，使得PacI和XhoI限制性酶位點就分別與5′和3′端連接，以便于克隆到TMV載體pBSG1057內(圖7)。擴增的產物被重新克隆到pGEM-TeasyTM內并且進行測序以驗證該限制性酶位點和gag序列的完整性。
通過PacI和XhoI限制性酶消化，將該綠色熒光蛋白(GFP)基因序列從pBSG1057上切割下來，并且將gag在這2個位點處克隆到TMV載體中以生產該克隆pBSGgag6(圖8)。
可以得知，該同樣的gag結構可以被框內(in frame)克隆到馬鈴薯Y病毒屬源cDNA克隆中，被衍生自馬鈴薯Y病毒屬蛋白組的、適當的內切蛋白酶識別序列側翼包圍(flank)，用于通過體外轉錄的易感重組馬鈴薯Y病毒屬RNA的表達。對于來自任何植物病毒的載體，結果是相同的。
還可以得知，可以通過用一種根癌農桿菌懸浮液滲透煙草葉的方式實現在煙草中的大規模瞬時表達。使用該方法，可以轉化許多細胞，并且可軀體地(somatically)產生該蛋白質，而不是首先必須產生愈合組織，然后產生轉基因植物(Kapila等，1997)。該載體可以是含有一種T源質粒結構的根癌農桿菌。
煙草蝕刻病毒，例如可從大規模生物公司獲得的這類病毒，也可用于本發明。
煙草gag基因的密碼子優化采取另一種策略進行煙草gag基因密碼子優化，合成該基因，并且使用與上述相似的策略將該基因克隆到pBSG1057 TMV載體，以希望當該基因被導入本塞姆氏煙草中時，可以加強Gag蛋白質的表達。該密碼子優化的gag基因序列(SEQ ID NO1)在被去除了GFP后，被克隆到pBSG1057的PacI和XhoI限制性酶位點內。所得的克隆被稱為pBSGgagopt11(圖9)。
pBSGgaq6、PBsGgagopt11和pBSG1057的轉錄使用Ribomax轉錄/翻譯試劑盒(Promega公司)制備pBSGgag6、pBSGgagopt11和pBSG1057的mRNA。每個反應使用10微克的各種質粒。
用重組TMV mRNA感染本塞姆氏煙草將pBSGgag6和pBSGgagopt11克隆的mRNA轉錄物以及前述的含有GFP(pBSG1057)的TMV載體接種到本塞姆氏煙草植物中。以水接種的(Water-inoculated)植物作為陰性對照。
用藥棉棒將該mRNA(50μl)擦到一個六周齡本塞姆氏煙草植物的開展的葉子上。該植物在植物室的正常的生長條件下生長，并且每天用UV燈監控采用pBSG1057 mRNA轉錄物接種的對照植物的接種后的葉子和上面的葉子中綠色熒光點(GFP)的出現，并且監控在接種的pBSGgag6、接種的pBSGgagopt11及接種的pBSG1057植物中的TMV癥狀。以GFP的系統散布作為TMV重組體系統散布的指示劑，以葉子為樣品，用于使用蛋白質印跡法(Western blotting)、EM分析法和酶聯免疫吸附分析(ELISA)檢測Gag蛋白質。
TMV癥狀和GFP熒光接種后(dpi)第4天，就可以在UV燈下看到在那些感染有pBSG1057 mRNA轉錄物的接種后葉子上有綠色熒光點。接種后10天，就可以看到綠色熒光點擴散到上面的葉子上。接種后第17天，在接種pBSG1057的植物的新生長部分可看到有TWV癥狀，并且接種后第24天，在接種pBSGgag6和接種pBSGgagopt11的植物的新生長部分可看到有TWV癥狀。
檢測Gag蛋白質粗蛋白質的制備是通過用研缽和研杵將葉子粉碎，用粗棉布(cheesecloth)過濾剩余的固體物質，并加入上樣緩沖液完成的。
蛋白質印跡法將該樣品煮沸5分鐘，跑10％SDS聚丙烯酰胺凝膠以分離該蛋白質。已解析的蛋白質(resolved proteins)被從該SDS聚丙烯酰胺凝膠上轉移(transblotted)到硝化纖維膜上。用一種稀釋為1∶200的抗鼠p17單克隆抗體(Chemicon公司)檢測(probe)該膜。
與桿狀病毒產生的、突出存在一種55kD蛋白質的gag(見下述內容)相比，含有從接種pBSGgag6和接種pBSGgagopt11的葉子中制得的粗蛋白質的泳道(lane)并未產生任何積極的結果。
EM分析Gag VLPs(免疫截留的)在PBS(pH7.4)中，將粗頂端(crude apical)葉提取物(35dpi)磨碎，然后低速離心成殘留有未磨過組織的粒狀沉淀。將少量的葉提取物在銅網格上干燥，并被一種稀釋為1∶200的抗鼠p17單克隆抗體(Chemicon公司)免疫截留。將該網格用乙酸鈾酰復染色，并用透射電子顯微鏡進行觀察。
有非常少量的植物材料出現在接種pBSG1057的樣品(無大小為100至120納米的顆粒)和非常少量的TMV顆粒中。
在來自本塞姆氏煙草植物的濃縮提取物中可檢測到明顯的病毒樣顆粒，該顆粒在形態學上與桿狀病毒表達的Gag Pr55 VLPs(圖12)一致。在該接種pBSGgag6的樣品中，有大量的100-110納米大小的VLPs，以及少量的TMV亞單位大小的顆粒(25納米)。在該接種pBSGgagopt11的樣品中，具有形似于、但少于在該接種pBSGgag6的樣品中所看到的100-110納米大小顆粒的顆粒。
ELISA將粗葉提取物低速離心成殘留有未磨過組織的粒狀沉淀。將少量該粒狀沉淀稀釋于1×PBS中，并通過使用Vironostikap24 HIV-1抗原ELISA試劑盒檢測p24抗原。
酶聯免疫吸附分析蛋白質粗制備物的初步結果表明，接種pBSGgagopt11的葉子中的gag蛋白質是以每毫升粗制備蛋白質溶液含有460微微克的水平存在。在經適當載體系統感染的本塞姆氏煙草植物中，gagopt基因的表達顯著地高于天然的gag基因。
HIV-1亞型C gag VLPs的桿狀病毒表達使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(生命技術公司)制備HIV-1亞型C Gag VLPs。它們提供一種相應的陽性對照用于進一步的蛋白質(Gag)檢測試驗，并且可被用于產生針對HIV-1亞型C Gag的特異性抗體。
將該來自南非的HIV Du422分離株(Williamson等，2003)(SEQID NO2)的HIV-1亞型C Gag基因克隆到pFastBacl的多克隆位點，然后轉移到感受態(competent)大腸桿菌DH10Bac細胞中，然后篩選以成功移置到桿狀病毒穿梭載體(桿粒)中。
根據生產商協議(Gibco生命科學公司)，通過重組體桿狀病毒表達該全長十四烷基化的Pr55Gag前體蛋白，在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf21)細胞中生產Gag VLPs。在28℃條件下，將該細胞在補充有胎牛血清的TC100培養基(Gibco生命科學公司)中培養84小時。
由于該克隆的gag基因包括一個N端甘氨酸殘基序列，所以人們期望該重組蛋白質被靶向至該宿主質膜。因此，所形成的VLPs隨后就從細胞表面芽生到昆蟲細胞培養基中。將被轉染的Sf21細胞與通過在3000g的離心過濾而與芽生到培養基的VLPs分離。如上所述，Nermut等(1994)將推定的Pr55Gag VLPs從蔗糖密度梯度培養液中純化出來。將純化后的VLPs在4℃的1×磷酸鹽緩沖鹽液(PBS)中透析16小時，并在10％凝膠上SDS-PAGE后，通過使用稀釋為1∶1000的1×PBS(pH7.4)的HIV-1 p17的抗血清(ARP431，NIBSC)，采用蛋白質印跡法檢測Gag的含量和完整性。
可以通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察到Sf21細胞生產VLP的過程。通過將細胞按序固定到1倍的PBS(pH7.4)中的2.5％戊二醛和1％的四氧化鋨中，將重組感染病毒的細胞制備成超薄切片(ultrathinsectioning)。在1×PBS和水中清洗固定的細胞，然后使之在梯度乙醇溶液和100％丙酮中脫水，然后將其包埋在斯撲(Spurrs)樹脂中并被截短。用2％乙酸鈾酰和雷諾茲(Reynolds)檸檬酸鉛對該切片部分進行染色，并用放大率為12000×至100000′，加速電壓為80千伏的ZeissS1109電子顯微鏡進行觀察。
通過將該細胞外介質中收獲的Gag VLP吸附到碳包銅網格上，用2％乙酸鈾酰或2％甲胺鎢酸鹽對進行染色后，進行TEM觀察(圖12)。
在該電子顯微鏡下，可觀察到直徑約為110-120納米的VLPs，從而驗證了成功地生產了gag VLP。使用蛋白質印跡法分析，可以觀察到解析到SDS page膠的樣品中有一個單個的分子量為55kD的蛋白質帶，并且可以看到gag P17蛋白質的單克隆抗體和多克隆抗體活躍地反應。使用蛋白質印跡法分析，隨后還檢測到兩個另外的抗桿狀病毒源VLPs的gag P24蛋白質的單克隆抗體，并且積極地反應。
疫苗開發如上所述，在植物細胞和昆蟲細胞內制得的免疫原VLPs可被用于制備一種用于治療或預防哺乳動物感染HIV的疫苗。該疫苗被期望可以在該哺乳動物體內誘導產生一種對該病毒樣顆粒的免疫反應。除了含有一種治療上的有效劑量的病毒樣顆粒外，該疫苗還包括一種藥學上的賦形劑和/或輔料。
盡管上述對本發明的描述是通過參照具體的實施方式進行的，但并非意在用上述內容限制本發明。
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序列表<110>開普敦大學南非醫學研究會<120>一種生產HIV-1的GAG病毒樣顆粒的方法<130>PA132610/PCT<140>PCT/IB03/<141>2003-12-04<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1549<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1)<400>1gaattcatgg gtgcgagagc gtcaatatta agaggggaaa aattagataa atgggaaaag 60attaggttaa ggccaggggg aaagaaacat tatatgttaa aacacatagt atgggcgagc120agggagctgg aaagatttgc acttaaccct ggccttttag aaacatcaga aggatgtaaa180caaataatga aacagctaca accagctctc cagacaggaa cagaggaact taaatcatta240tacaacacag tagcaactct ctattgtgta catgaaaaga tagaagtacg agacaccaag300gaagccttag ataagataga ggaagaacaa aacaaatgtc agcaaaaaac gcagcaggca360aaagcggctg acgggaaagt cagtcaaaat tatcctatag tgcagaatct ccaagggcaa420atggtacatc aagccatatc acctagaacc ttgaatgcat gggtaaaagt aatagaagaa480aaggctttta gcccagaggt aatacccatg tttacagcat tatcagaagg agccacccca540caagatttaa acaccatgtt aaatacagtg gggggacacc aagcagccat gcaaatgtta600aaagatacta ttaatgaaga ggctgcagaa tgggatagat tacatccagt ccatgcgggg660cctattgcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg aactactagt720acccttcagg aacaaatagc atggatgaca agtaacccac ctattccagt gggagacatc780tataaaagat ggataattct ggggttaaat aaaatagtga gaatgtatag cccggtcagc840attttggaca taagacaagg gccaaaggaa ccctttcgag actatgtaga tcggttcttt900aaaactttaa gagctgaaca agctacacaa gaagtaaaaa attggatgac agacaccttg960
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權利要求
1.一種含有編碼一種HIV Gag多肽的核苷酸序列的載體，其特征在于，該編碼Gag多肽的核苷酸序列包括一個與SEQ ID NO1所述序列具有至少90％的序列一致性的序列。
2.一種含有編碼一種HIV Gag多肽的核苷酸序列的載體，其特征在于，該編碼Gag多肽的核苷酸序列包括一個與SEQ ID NO2所述序列具有至少90％同源性的序列。
3.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于，該載體是一種植物載體。
4.如權利要求3所述的載體，其特征在于，該載體是一種煙草花葉病毒載體。
5.如權利要求3所述的載體，其特征在于，該載體是一種含一T源質粒結構的根癌農桿菌。
6.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于，該載體是一種桿狀病毒載體。
7.一種含有如權利要求1-6中任一項所述載體的細胞，其特征在于，該核苷酸序列與適于該細胞內表達的控制元件可操作地連接。
8.如權利要求7所述的細胞，其特征在于，該細胞是一種植物細胞。
9.如權利要求8所述的細胞，其特征在于，該細胞是一種本塞姆氏煙草植物細胞。
10.如權利要求7所述的細胞，其特征在于，該細胞是一種昆蟲細胞。
11.如權利要求10所述的細胞，其特征在于，該細胞是一種Sf 21或Sf 9細胞。
12.一種生產一種HIV-1免疫原蛋白質或一種相關多肽的方法，該方法包括如下步驟(a)將一載體或載體系統導入宿主細胞中，該載體或載體系統含有一編碼HIV-1免疫原蛋白質或通過取代、缺失和/或插入一個或多個核苷酸，和/或其一端或兩端的延伸或截短而衍生得到的相關多肽的核酸序列，該核酸序列具有與SEQ ID NO1所述序列至少90％的一致性；(b)在該宿主細胞中表達該核酸序列；及(c)回收在該宿主細胞中所生產的HIV-1免疫原蛋白質或相關多肽。
13.一種生產一種HIV-1免疫原蛋白質或一種相關多肽的方法，該方法包括如下步驟(a)將一載體或載體系統導入宿主細胞中，該載體或載體系統含有一編碼HIV-1免疫原蛋白質或通過取代、缺失和/或插入一個或多個核苷酸，和/或其一端或兩端的延伸或截短而衍生得到的相關多肽的核酸序列，該核酸序列具有與SEQ ID NO2所述序列至少90％的一致性；(b)在該宿主細胞中表達該核酸序列；及(c)回收在該宿主細胞中所生產的HIV-1免疫原蛋白質或相關多肽。
14.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，該載體是一種植物載體。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，該載體是一種煙草花葉病毒載體。
16.如權利要求14所述的方法，其特征在于，該載體是一種含有一T源質粒結構的根癌農桿菌。
17.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，該載體是一種桿狀病毒載體。
18.如權利要求12-16中任一項所述的方法，其特征在于，該宿主細胞是一種植物細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，該植物細胞是一種本塞姆氏煙草植物細胞。
20.如權利要求12、13或17中任一項所述的方法，其特征在于，該宿主細胞是一種昆蟲細胞。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，該昆蟲細胞是一種Sf 21或Sf 9細胞。
22.一種如權利要求12-21中任一項所述方法生產的HIV-1蛋白質或多肽。
23.如權利要求22所述的蛋白質或多肽，其特征在于，該蛋白質或多肽是一種HIV-1 Pr55 Gag蛋白質。
24.如權利要求22或23所述的蛋白質或多肽，其特征在于，該蛋白質或多肽被裝配成病毒樣顆粒(VLPs)的形式。
25.一種用于治療或預防哺乳動物感染HIV的疫苗，該疫苗包括如權利要求22-24中任一項所述蛋白質或多肽的病毒樣顆粒。
26.如權利要求25所述的疫苗，其特征在于，該疫苗誘導一種針對適當易感宿主中的病毒樣顆粒的免疫反應。
27.如權利要求25或26所述的疫苗，其特征在于，該疫苗包括一種藥學上的賦形劑和/或輔料以及一種治療上的有效劑量的該病毒樣顆粒。
全文摘要
本發明描述了一種含編碼HIV Gag多肽的核苷酸序列的載體，該載體用于制備HIV－1 Gag病毒樣顆粒。該載體可以是一種植物載體，例如，一種如pBSG1057載體的煙草花葉病毒載體或一種煙草蝕刻病毒載體。該載體還可以是一種含T源質粒結構的根癌農桿菌。或者，該載體可以是一種昆蟲載體，如桿狀病毒載體。本發明還描述了HIV－1 Gag病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒在治療或預防哺乳動物感染HIV的疫苗中的應用，該疫苗包括基本如上所述的蛋白質或多肽的病毒樣顆粒。
文檔編號C12N15/82GK1745095SQ200380109384
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月4日 優先權日2002年12月4日
發明者安·賈弗雷, 安娜·利塞·威廉森, 愛德華·彼得·雷比茨基 申請人:開普敦大學, 南非醫學研究會