病原菌應答性啟動子的制作方法

專利名稱：病原菌應答性啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及對病原菌具有應答性的啟動子以及利用該啟動子的抗病原菌植物。
背景技術：
馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)與馬鈴薯植物之間存在著明確的小種-品種間的專一性寄生關系，這種專一性的寄主-病原菌相互關系大多由病原菌所保有的非病原性基因和寄主所具有的真性抗性基因的組合來決定。嘗試感染非親和性小種時，寄主中被誘導出動態抗性反應。即，感染組織中表達伴隨活性氧生成、超敏感性細胞死亡、植物抗毒素(馬鈴薯中為日齊素)的生成、PR(病理相關)蛋白的表達、乳突毛形成、木質化等過敏性反應的抗性反應，病原菌的發展停止(參照文獻15、32、44、45和47)。另一方面，感染親和性小種時，不會誘導這些抗性反應，病原菌的侵入得到發展，引起馬鈴薯植物的致命性整株感染病——馬鈴薯晚疫病。
可以認為這些動態抗性反應中，最重要的局部抗性反應之一為植物抗毒素的蓄積。植物抗毒素是在感染病原菌時被誘導蓄積的具有抗菌作用的小分子物質，有文獻顯示其在決定感染與否時發揮了重要的作用(參照文獻12、13、21、28和46)。馬鈴薯中的植物抗毒素是倍半萜烯化合物，通過類異戊二烯代謝系統合成(

圖1)。
馬鈴薯中，已知通過引發物處理或接種非親和性小種，類異戊二烯合成由固醇·配糖生物堿合成急劇地轉換為倍半萜烯植物抗毒素的合成。該現象可能是由于在類異戊二烯合成系統的限速步驟中協同作用的角鯊烯合酶和倍半萜環化酶所調節的，這兩種酶分別使該系統偏向固醇·配糖生物堿合成途徑或類異戊二烯植物抗毒素合成途徑(參照文獻8)。馬鈴薯的倍半萜環化酶是vetispiradiene合酶，其被命名為馬鈴薯vetispiradiene合酶(參照文獻53)。有報道指出通過接種病原菌和經來自馬鈴薯晚疫病菌細胞壁的引發物HWC處理，馬鈴薯塊莖組織的PVS活性顯著增加(參照文獻54)。還已知煙草植物中，通過引發物處理，倍半萜烯合成途徑激活，合成了一種植物抗毒素——辣椒二醇(參照文獻42和48)。最近，這些現象在基因表達水平得到闡明。分離馬鈴薯的PVS和角鯊烯合酶的cDNA，以這些克隆作為探針，使用由馬鈴薯塊莖提取的RNA進行Nortern印跡分析時，證實在親和性和非親和性小種接種區中誘導了PVS mRNA的瞬時蓄積。另一方面也顯示有觀察到創傷處角鯊烯合酶誘導的mRNA蓄積，因接種親和性和非親和性小種受到抑制(參照文獻53)。不過，該報告與僅在接種非親和性小種時植物抗毒素生物合成，病原菌發展停止的情況是矛盾的(參照文獻40)。
通常已知很多植物的基因構成多基因家族，各同源基因具有不同器官專一性，在對刺激應答產生的代謝變化中發揮不同的作用。有報道指出馬鈴薯植物中的PVS基因形成多基因家族，存在PVS1～4成員(參照文獻53)。但是，有關這些各成員表達情況的詳細內容未有論述。
(文獻1)Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.and Lipman，D.J.(1990)Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215，403-410.
(文獻2)Arumuganathan，K.and Earle，E.D.(1991)Nuclear DNA content ofsome important plant species.Plant Mol.Biol.Reporter 9，208-218.
(文獻3)Back，K.and Chappel，J.(1995)Cloning and bacterial expression of asesquiterpene cyclase from Hyoscyamus muticus and its molecularcomparison to rerated terpene cyclases.J.Biol.Chem.270，7375-7381.
(文獻4)Back，K.and Chappel，J.(1996)Identtifying functional domainswithin terpene cyclase using domain-swapping strategy.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，6841-6845.
(文獻5)Back，K.and Chappel，J.(1998)Cloning and bacterial expression of asesquiterpene cyclase，a key branch point enzme for the snthesis ofsesquiterpenoid phytoalexn capsidiol in UV-changed leaves of Capsiumannum.Plant Cell Physiol.39，899-904.
(文獻6)
Bradford，M.M.(1976)A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding.Anal.Biochem.72，248-254.
(文獻7)Chang，J.H.，Tai，Y.-S.，Bernal，A.J.，Lavelle，D.T.，Staskawicz，B.J.and Michelmore，R.W.(2002)Functional analyses of the Pto resistancegene family in tomato and the identification of a minor resistancedeterminant in a susceptible haplotype.Mol.Plant-Microbe Interact.15，281-291.
(文獻8)Chappell，J.(1995)The biochemistry and molecular biology ofisoprenoid metabolism.Plant Physiol.107，1-6.
(文獻9)Choi，D.，Ward，B.L.and Bostock，R.M.(1992)Differential inductionand suppression of potato 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme Areductase genes in elicitor arachidonic acid.Plant Cell 4，1333-1344.
(文獻10)Chomczynski，P.and Sacchi，N.(1987)Single-step method of RNAisolation by acid guanidium hiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.162.156-159.
(文獻11)Cruickshark，I.A.M.and Perrin，D.R.(1960)The isolation andparticular characterization of monilicolin A，a polypeptide withphaseollin-inducing activity from Monilinia fructicola.Life Sci.7，449-458.
(文獻12)Darvill，A.G.and Albersheim，P.(1984)Phytoalexins and theirelicitors a defense against microbial infection in plants.Annu.Rev.Plant Physiol.35，243-275.
(文獻13)Dixon，R.A.and Harrison，M.J.(1990)Activation，strueture andorganization of genes involved in microbial defence in plants.Adv.Genet.28，165-234.
(文獻14)Doke，N.and Tomiyama，K.(1980)Effect of hypal wall componentsfrom Phythophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissue.Physiol.Plant Pathol.16，169-176.
(文獻15)Doke，N.(1983)Involvement of superoxide anion generation in thehypersensitive response of potato tuber tissues to infection with anincompatible race of Phythophthora infestans and to the hyphal wallcomponents.Physiol.Plant Pathol.23，345-357.
(文獻16)Facchini，P.J.and Chappel，J.(1992)Gene fmily for an elicitor-indused sesquiterpene cyclase in tabacco.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，11088-11092.
(文獻17)Feinberg，A.P.and Vogelstein，B.(1983)A technique forradiolabelling DNA reaction endoncrease fragments to high specificactivity.Anal.Biochem.136，6-13.
(文獻18)Hashimoto，T.，Yamada，T.，Tada，A.，Kawamata，S.，Tanaka，Y.，Sriprasertsak，P.，Ichinose，Y.，Kato，H.，Izntsu，S.，Shiraishi，T.，Oku，H.and Ohtsuki，Y.(1992)Transient expression of a phenylalanine ammonia-lyase promoter.Plant Cell Reports，11，183-187.
(文獻19)Jefferson，R.A.(1987)Assaying chimeric genes in plantsThe GUSgene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.5，387-405.
(文獻20)Katou，S.，Senda，K.，Yoshioka，H.，Doke，N.and Kawakita，K.(1999)A 51 kDa protein kinase of potato activated with hyphal wall componentsfrom Phytophthora infestans.Plant Cell Physiol.40，825-831.
(文獻21)Kuc，J.and Rush，R.J.(1985)Phytoalexins.Arch.Biochem.Biophys.236，455-472.
(文獻22)Laemmli，U.K.(1970)Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature 277，680-685.
(文獻23)Leader，P.，Tiemerier，D.and Enguist，L.(1977)EK2 derivatives ofbacterio-phage lambda useful in the cloning of DNA from higherorganisms.Science 196，175-177.
(文獻24)Maniaitis，T.，Frritsch，E，F.and Sambrock，J.(1982)MolecularCloningA Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor，NYCold SpringLaboratry)(文獻25)McNeil，J.B.(1988)Functional Characterization of a Pyrimidine-Rich Element in the 5’-Noncoding Region of the Yeast Iso-1-Cytochromec Gene.Mol.Cel.Biol.8，1045-1054。
(文獻26)Metlitsky，L.V.，Ozeretskovskaya，O.L.，Vasyukova，N.J.，Davydova，M.A.，Dorozhkin，N.A.，Remneva，Z.J.and Ivanyuk，V.G.(1970)Potatoresistance to Phytophthora infestans as related to leaf phytoalexin activity.Prikl.Biokhim.Mikrobiol.5，568-573.
(文獻27)田隆(1984)DNAの進化，＝ダイナミツクに進化する真核生物遺伝子＝，分子進化學入門，木村資生編，培風館，東京，pp.56-90。
(文獻28)Moesta，P.and Grisebach，H.(1982)L-O-Aminooxy-3-phenylpropionic acid inhibits phytoalexin accumulation in soybean withconcominant loss of resistance against Phythophthora megasperma f.sp.glycinea.Physiol.Plant Pathol.21，65-70。
(文獻29)Murai，A.，Sato，S.，Osada，A.，Katsui，N.and Masamune，T.(1982)Biosynthesis from solavetivone of the phytoalxin risitin in potato.J.Chem.Soc.Chem.Commun.，32(文獻30)Murray.M.G.and Thompsin，W.F.(1980)Rapid isolationh of high-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids.Res.8，4321-4325(文獻31)Narita，J.O.and Gruissem，W.(1989)Tomato hydroxy-methylglutaryl-CoA reductase is required early in fruit development butnot during ripening.Plant Cell 1，181-190。
(文獻32)Oba，K.，Kondo，K.，Doke，N.and Uritani，I.(1985)Induction of 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase in potato tu bers after slicing，fungal infection or chemical treatment，and some properties of the enzyme.Plant Cell Physiol.26，873-880。
(文獻33)Ren，D.，Yang，H.and Zhang，S.(2002)Cell death mediated by MAPKis associated with hydrogen peroxide production in Arabidopsis.J.Biol.Chem.277，559-565。
(文獻34)Rohwer，F.，Fritzemeier，K.H.，Scheel，D.，and Hahlbrock，K.(1987)Biochemical reactions of different tissues of potato(Solanum tuberosum)to zoospores or elicitors from Phytophthora infestans.Planta 170，556-561。
(文獻35)Romeis，T.，Piedras，P.，Zhang，S.，Klessig，D.F.，Hirt，H.and Jones，J.D.G.(1999)Rapid Avr9-and Cf-9-dependent activation of MAP kinasesin tobacco cell cultures and leavesconvergence of resistance gene，elicitor，wound，and salicylate responses.Plant Cell 11，237-287。
(文獻36)Reed，K.C.and Mann，D.A.(1985)Rapid transfer of DNA fromagarose gel to nylon membranes.Nucleic Acids Res.13，7207-7221。
(文獻37)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)MolecularCloningA Laboratory Mannual，2nd ed.Cold Spring Harbor，NYColdSpring Harbor Laboratory.
(文獻38)Sanger，F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1977)DNA sequencingchain-terminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467。
(文獻39)Starks，C.M.，Back，K.，Chappel，J.and Noel，J.P.(1997)Structurebasis for cyclic terpene biosynthesis by tabacco 5-epi aristolochenesynthase.Science 277，1815-1820。
(文獻40)Stermer，B.A.and Bostock，R.M.(1987)Involvement of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in regulation of sesquiterpenoidphytoalexin synthesis in potato.Plant Physiol.84，404-408。
(文獻41)Thomas，C.M.，Tang，S.，Hammond-Kosack，K.E.and Jones，J.D.G.(2000)Comparison of the hypersensitive response induced by the tomatoCf-4 and Cf-9 genes in Nicotiana spp.Mol.Plant-Microbe Interact.13，465-469。
(文獻42)Threfall，D.R.and Whitehead，I.M.(1988)Co-ordinated inhibition ofsqualene synthetase and induction of enzymes of sesquiterpenoidphytoalexin biosynthesis in cultures of Nicotiana tabacum。Phytochemistry 27，2567-2580。
(文獻43)Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTALWimproving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting，positions-specific gap penalties and weightmatrix choice.Nucleic Acids Res.22，4673-4680。
(文獻44)Tomiyama，K.(1968)Further observation on the time requirement forhypersensitive cell death of potatoes infected by Phytophthora infestansand its reaction to metabolic activity.Phytopathology 58，367-378。
(文獻45)Vance，C.P.and Sherwood，R.T.(1977)Lignified papilla formation asa mechanism for protection in reed canarygrass.Physiol.Plant Pathol.10，247-256。
(文獻46)VanEtten，H.D.，Matthews，D.E.and Matthews，P.S.(1989)Phytoalexin detoxyficationImportance for pathogenicity and practicalimplications.Annu.Rev.Phytopathol.27，143-164(文獻47)Van Loon，L.C.and Van Kammen，A.(1970)Polyacrylamide discelectrophoresis of the soluble leaf proteins from Nicotiana tabacum var。‘Samsun’and‘Samsun NN’.Virology 40，199-211。
(文獻48)Vgeli，U.and Chappel，J.(1988)Induction of sesquiterpene cyclaseand suppression of squalene synthase activities in plant cell cultutestreated with fungal elicitor.Plant Physiol.88，1291-1296。
(文獻49)Wilson，U.E.and Coffey，M.D.(1980)Cytological evaluation ofgeneral resistance to Phytophthora infestans in potato folia ge.Ann.Bot.45，81-90。
(文獻50)Yang，K.-Y.，Liu，Y.and Zhang，S.(2001)Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway is involved in disease resistance intobacco.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，741-746。
(文獻51)Yin，S.，Mei，L.，Newman，J.，Back，K.，and Chappell，J.(1997)Regulation of sesquiterpene cyclase gene expressioncharacterization ofan elicitor-and pathogen-inducible promoter.Plant Physiol.115，437-451。
(文獻52)Yoshioka，H.，Miyabe，M.，Hayakawa，Y.and Doke，N.(1996)Expression of genes for phenylalanine ammonia-lyase and 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase in aged potato tubers infected withPhytophthora infestans.Plant Cell Physiol.37，81-90。
(文獻53)Yoshioka，H.，Yamada，N.and Doke，N.(1999)cDNA cloning ofsesquiterpene cyclase and squalene synthase，and expression of the genesin potato tuber infected with Phytophthora infestans.Plant Cell Physiol.40，993-998。
(文獻54)Zook，M.N.and Kuc，J.A.(1991)Induction of sesquiterpene cyclaseand supression of squalene synthetase activity in elicitor treated or fungalinfected potato tuber tissue.Physiol.Mol.Plant Pathol.39，377-390。
(文獻55)Towbin，H.，Staehelin，T.and Gordon，J.(1979)Electrophoretictransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheetsprocedure and some applications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，4350-4354。
(文獻56)Bhattacharyya，M.K.，Paiva，N.L.，Dixon，R.A.，Korth，K.L.andStermer，B.A.(1995)Features of the hmg1 subfamily of genes encodingHMG-CoA reductase in potato.Plant Mol.Biol.28，1-15。
(文獻57)Asai，T.，Tena，G.，Plotnikova，J.，Willmann，M.R.Chiu，W.-L.，Gomez-Gomez，L.，Boller，T.，Ausubel，F.M.，and Sheen，J.(2002)MAPkinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity.Nature 415，977-983。
(文獻58)Cardinale，F.，Jonak，C.，Ligterink，W.，Niehausi，K.，Boller，T.andHirt，H.(2000)Differential activation of four specific MAPK pathways bydistinct elicitors.J.Biol.Chem.275，36734-36740。
(文獻59)Baulcombe，D.C.(1999)Fast forward genetics based on virus-inducedgene silencing.Curr.Opin.Plant Biol.2109-1l3。
(文獻60)
Gallagher，S.R.(1992)GUS ProtocolsUsing the GUS Gene as aReporter of Gene Expression.3.Quantitation of GUS activity byfluorometry.Gallagher，ed.San Diego，CA，Academic Press.pp.47-59。
(文獻61)Hellens，R.P.，Edwards，A.E.，Leyland，N.R.，Bean，S.，and Mullineaux，P.M.(2000)pGreenA versatile and flexible binary Ti vector forAgrobacterium-mediated plant transformation.Plant Mol.Biol.42819-832。
(文獻62)Kamoun，S.，van West，P.V.，Jung，A.J.，Vleeshouwers，V.G.A.A.，Groot，K.E.and Govers，F.(1997)A gene encoding a protein elicitorPhytophthora infestans is down-regulated during infection of tomato.Mol.Plant-Microbe Interact 1013-20。
(文獻63)Kamoun，S.，West，P.V.，Vleeshouwers，V.G.A.A.，Groot，K.E.andGovers，F.(1998)Resistance of Nicotiana benthamiana to Phvtophthorainfestans is mediated by the recognition of the elicitor protein INF1.PlantCell 101413-1425。
(文獻64)Katou，S.，Yamamoto，A.，Yoshioka，H.，Kawakita.，K.and Doke，N.(2003)Functional analysis of potato mitogen-activated protein kinasekinase，StMPK1.J.Gen.Plant Pathol.69161-168。
(文獻65)MAPK group(2002)Mitogen-activated protein kinase cascades inplantsa new nomenclature.Trends Plant Sci.7301-308。
(文獻66)Mitchell，P.J.and Tjian，R.(1989)Transcriptional regulation inmammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins.Science 245371-378。
(文獻67)Ratcliff，F.，Martin-Hernandez，A.M.and Baulcomb，D.C.(2001)Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing.Plant J.25237-245。
(文獻68)Reed，K.C.and Mann，D.A.(1985)Rapid transfer of DNA fromagarose gel to nylon mem branes.Nucleic Acids Res.137207-7221。
(文獻69)Samuel，M.A.and Ellis，B.，E.(2002)Double jeopardybothoverexpression and supression of a redox-activated plant mitogen-activated protein kinase render tobacco plants ozone sensitive.Plant Cell142059-2069。
(文獻70)Voinnet，O.(2001)RNA silencing as a plant immune system againstviruses.Trends genet.17449-459。
(文獻71)Yoshioka，H.，Numata，N.，Nakajima，K.，Katou，S.，Kawakita，K.，Rowland，O.，Jones，J.D.G.and Doke，N.(2003)Nicotiana benthamianagp91phoxhomologs NbrbohA and NbrbohB participate in H2O2accumulation and resistance to Phytophthora infestans.Plant Cell 15706-718。
(文獻72)Zhang，S.，Du，H.and Klessig，D.F.(1998)Activation of the tobaccoSIP kinase by both a cell wall-derived carbohydrate elicitor and purifiedproteinaceous elicitors from Phytophthora spp.Plant Cell 10435-449。
(文獻73)Zhang，S.and Liu，Y.(2001)Activation of salicylic acid-inducedprotein kinase，a mitogen-activated protein kinase，induces multipledefense responses in tobacco.Plant Cell 131877-1889。
(文獻74)Zuo，J.，Niu，Q.-W.and Chua，N.-H.(2000)An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression intransgenic plants.Plant J.24265-273。

發明內容
人們試圖利用植物所具備的抗性反應來增強抗病性。其中的一項研究是利用病害應答性啟動子在病害時特異性生成抗性誘導物質的方法。根據所述方法，病害時可特異地且迅速地生成抗性誘導物質，由此實現有效的防御。
過去發現了幾種病害應答性啟動子，但迄今為止，所報告的病害應答性啟動子不僅在病原菌感染時被誘導，大多在創傷或在生長階段也被誘導。因此，使用這樣的啟動子制備導入了抗性誘導物質生成相關基因的轉基因植物，在病原菌的感染部位以外(感染時以外)轉基因也表達，可以預想植物會因此而受害。本發明在以上背景下完成，其目的在于提供對于病原菌的感染特異性應答的啟動子(病原菌應答性啟動子)，以及利用該啟動子制備抗病原菌植物的方法等。
本發明人鑒于以上課題，嘗試從馬鈴薯植物中獲得對于作為病原菌代表的晚疫病菌具有特異應答性的啟動子。首先將研究集中于與植物抗毒素的生成有關的基因——馬鈴薯vetispiradiene合酶(PVS)，詳細地研究了晚疫病菌的主要的初次感染部位葉組織中各PVS成員(PVS1-PVS4)的表達情況。結果得知只有PVS3無論接種親和性小種或非親和性小種時都被強烈誘導。即表明PVS3的啟動子對于親和性小種感染也顯示應答性。
接下來，構建馬鈴薯基因組文庫，嘗試利用該文庫來了解PVS3的序列。經多次篩選，最終成功地確定了PVS3基因組DNA序列。在依據所確定的序列信息推定PVS3的啟動子區，研究其功能時，確認了對晚疫病菌的應答性。為了進一步詳細研究該推定啟動子區的功能，首先在GUS基因的上游連接該推定啟動子區，將其導入馬鈴薯，制備馬鈴薯轉化體。使用該轉化體進行各種試驗，結果未見葉組織切除(創傷)導致的GUS染色，而見到了接種晚疫病菌親和性小種導致的GUS染色，由此確認該啟動子區顯示晚疫病菌特異地、即病原菌特異性應答性。
如上所述，本發明成功地獲得了對病原菌感染顯示特異性應答的啟動子(病原菌應答性啟動子)。利用該啟動子可制備只在感染病原菌時使特定的基因表達的植物。即，導入連接有該啟動子的基因后所得的轉化體中，當病原菌感染時，導入的啟動子被特異性誘導，結果使轉基因表達。如果采用可激活防御應答的基因作為轉基因，則可以制備當病原菌的感染時，可特異性激活防御應答的植物，即，可制備對于病原菌感染具有高抗性的植物。
這里，通常的基因轉錄由被稱為轉錄活性因子的蛋白質因子結合到啟動子區內的被稱為順式序列的幾個堿基-十幾個堿基的序列而起始(文獻66)。因此，確定順式序列是闡明轉錄機理的第一步。鑒于此，本發明人將成功鑒定的上述推定啟動子的一部分依次去掉后所得的PVS3啟動子序列與GUS基因形成的嵌合基因(PVS3:GUS)通過根癌農桿菌(Agrobacterim tumefaciens)瞬時導入葉組織，研究PVS3啟動子活性。結果發現了啟動子活性的重要的區——50bp(SEQ ID No.23)的區。即，成功地鑒定出可能是PVS3啟動子活性表達所必須的50bp的區。但目前在該區中尚未發現已知的調控元件。
本發明人成功鑒定的病原菌應答性啟動子(PVS3啟動子)雖然是由馬鈴薯植物獲得的，但其適用對象不僅限于馬鈴薯植物。首先第一點，PVS3是催化馬鈴薯植物中植物抗毒素合成的酶，馬鈴薯植物與其它茄科植物中的植物抗毒素都是萜烯類化合物，這點是共同的，它們具有共同的植物抗毒素的合成途徑。如后所述，還已知本基因的誘導依賴于SIPK和WIPK，兩種酶通常不僅限于茄科植物，在很多植物中都是共同的，其與防御應答有關。考慮到這么多的共同點，可以預想本發明的啟動子(PVS3啟動子)不僅限于茄科植物，在已報告有SIPK和WIPK直向同源相關性的十字花科(參照文獻57)、豆科植物(參照文獻58)為中心的其它廣泛的植物中也同樣可作為病原菌應答性啟動子應用。
本發明是基于以上的研究結果而完成的，提供以下內容。
含有以下(a)-(c)中任意一項的DNA的病原菌應答性啟動子(a)含有SEQ ID NO.1所示堿基序列的DNA；(b)含有在SEQ ID NO.1所示堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(c)在嚴謹條件下與(a)或(b)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
含有以下(A)-(C)中任意一項的DNA的病原菌應答性啟動子(A)含有SEQ ID NO.2所示堿基序列的DNA；(B)含有在SEQ ID NO.2所示堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(C)在嚴謹條件下與(A)或(B)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
含有以下(1)-(3)中任意一項的DNA的病原菌應答性啟動子(1)含有SEQ ID NO.1所示堿基序列內連續的一部分，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(2)含有在(1)的DNA中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
(3)在嚴謹條件下與(1)或(2)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
含有以下(i)-(iii)中任意一項的DNA的病原菌應答性啟動子(i)含有SEQ ID NO.22所示堿基序列的DNA；(ii)含有在SEQ ID NO.22所示堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(iii)在嚴謹條件下與(i)或(ii)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
含有以下(I)-(III)中任意一項的DNA，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的病原菌應答性啟動子(I)含有SEQ ID NO.23所示堿基序列的DNA；(II)含有在SEQ ID NO.23所示的堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列的DNA；(III)在嚴謹條件下與(I)或(II)的DNA雜交的DNA。
[1]-[5]中任一項的病原菌應答性啟動子，其特征在于對病原菌感染特異性應答。
DNA，該DNA含有SEQ ID NO.23所示堿基序列。
DNA，該DNA含有SEQ ID NO.23所示堿基序列中連續10個或以上的堿基序列，具有病原菌應答性啟動子活性。
載體，該載體包含[1]-[6]中任一項的病原菌應答性啟動子。
載體，該載體含有[7]或[8]的DNA。
DNA構建體，該DNA構建體包括[1]-[6]中任一項的啟動子；與該啟動子相連并受其控制的、在植物體內表達并激活該植物的防御應答的基因。
DNA構建體，該DNA構建體包括[7]或[8]的DNA；與該DNA協同構成病原菌應答性啟動子的DNA；與所構建的病原菌應答性啟動子相連并受其控制的、在植物體內表達并激活該植物的防御應答的基因。
[11]或[12]的DNA構建體，其中上述基因具有其表達產物激活控制植物的防御應答的信息轉導途徑的功能。
[11]或[12]的DNA構建體，其中上述基因具有其表達產物激活SIPK或WIPK的功能。
[11]或[12]的DNA構建體，其中上述基因編碼組成型活性形式MEK的基因。
轉化體，該轉化體是用[11]-[15]中任一項的DNA構建體轉化宿主植物而得到的。
[16]的轉化體，其中上述宿主植物是茄科植物。
[16]的轉化體，其中上述宿主植物是馬鈴薯屬的植物。
轉基因植物的制備方法，包括用[11]-[15]中任一項的DNA構建體轉化宿主植物的步驟。
賦予宿主植物病原菌抗性的方法，包括用[11]-[15]中任一項的DNA構建體轉化宿主植物的步驟。
]植物，該植物外源導入了[1]-[6]中任一項的病原菌應答性啟動子。
植物，該植物外源導入了[7]或[8]的DNA。
本發明中，“病原菌應答性啟動子”是指對病原菌感染產生應答(被誘導)的啟動子。這里，“啟動子”是指調節在其控制下的基因轉錄起始的功能區。
本發明中的“外源導入”是指由外部導入。因此“外源導入的啟動子”是指由外部導入宿主細胞的啟動子，例如當宿主細胞原本保有與導入的啟動子相同的啟動子時，雖然構成相同，但只有導入的啟動子才被稱為外源導入的啟動子，以此區分兩者。
本發明中，術語“含有DNA”也包括“由DNA組成”的表達方式。因此例如對于“含有特定的DNA的啟動子”而言，其含義當然也包括“由該DNA組成的啟動子”。
本說明書中使用的各簡寫符號的含義如下。ATP腺苷5’-三磷酸、BPB溴酚藍、BSA牛血清清蛋白、CBB考馬斯亮藍、CTP胞苷5’-三磷酸、DEPC焦碳酸二乙酯、DTT二硫蘇糖醇、EDTA乙二胺-N，N，N’，N’-四乙酸、EGTA乙二醇雙(β-氨基乙醚)乙二胺-四乙酸、FPP法尼基二磷酸、GAP甘油醛-3-磷酸、GTP鳥苷-5’-三磷酸、HMG-CoA3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A、HMGR3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶、HWC菌絲壁組分、Ig免疫球蛋白、IPP異戊烯基二磷酸、IPTG異丙基-1-硫代-β-D-硫代半乳糖苷、KD千道爾頓、MOPS3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸、PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳、PBS磷酸鹽緩沖液、PCR聚合酶鏈式反應、PMSF苯甲基磺酰氟、PR病理相關、SDS十二烷基硫酸鈉、SHAM水楊異羥肟酸(salycylhydroxamic acid)、SSPE氯化鈉-磷酸鈉、EDTA、TBEtris-硼酸、EDTA、TBStris緩沖鹽溶液、TEtris-EDTA、Tris2-N-三(羥甲基)氨基甲烷、TTP5’-三磷酸硫胺素、X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。
如無特別說明，以下的基因工程操作可參考Molecular Cloning(ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)或Currentprotocols in Molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel等.，1987)進行。
本發明提供由病原菌感染而誘導的啟動子。利用本發明的啟動子進行基因導入，則可以在轉基因植物中使所需基因在病原菌感染時特異表達。因此，例如使用與防御應答有關的基因，可以制備在病原菌感染時可以迅速進行防御應答的抗病原菌植物。
附圖簡述圖1是表示馬鈴薯塊莖中刺激應答性類異戊二烯的生物合成途徑的圖。過敏性反應中，倍半萜烯植物抗毒素的合成活躍進行，創傷誘導性固醇和類固醇·配糖生物堿的合成受到抑制。
圖2是表示感染晚疫病菌后的陳化馬鈴薯片內的PVS(馬鈴薯vetispiradiene合酶)基因和PSS(馬鈴薯角鯊烯合酶)基因的表達狀態的圖。感染小種0(非親和性)、或感染小種1、2、3、4(親和性)(104游動孢子/片)或者水處理之前將馬鈴薯片陳化24小時。
圖3是表示使用由感染非親和性晚疫病菌或親和性晚疫病菌后(順序為非親和性、親和性)、或者水處理后(Mock)的陳化馬鈴薯片中提取的總RNA進行RT-PCR的結果圖。使用PVS1、PVS2、PVS3和PVS4各自的克隆特異性引物進行PCR。對于PVS1、PVS2、PVS3和PVS4分別得到了469bp、132bp、326bp和469bp的擴增產物。
圖4是表示使用由感染非親和性晚疫病菌或親和性晚疫病菌后(順序為非親和性、親和性)、或者水處理后(Mock)的陳化馬鈴薯片中提取的總蛋白進行Western印跡分析的結果圖。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，各分離10μg的總蛋白，使用抗PVS抗血清進行免疫印跡。檢測采用了HRP結合抗小鼠抗體和ECL檢測試劑盒。
圖5是表示使用從水處理后(Mock)、創傷處理后或感染非親和性晚疫病菌或者親和性晚疫病菌后(順序為非親和性、親和性)的馬鈴薯葉中提取的總RNA進行RT-PCR的結果圖。泳道T1使用由感染非親和性晚疫病菌6小時后的馬鈴薯塊莖中得到的RT-PCR產物的陽性對照。使用各成員(PVS1、PVS2、PVS3和PVS4)特異性引物。結果分別得到了176bp、132bp、326bp和131bp的產物。通過瓊脂糖凝膠電泳分離RT-PCR產物，轉印尼龍膜。使32P標記的各PCR產物與轉印后的膜雜交。
圖6表示PVS3基因組克隆的堿基序列和推定的氨基酸序列。圖6中給出了推定啟動子區和編碼區的一部分。氨基酸序列表示在編碼該序列的堿基下。非編碼區用小寫字母表示。終止密碼子用星號表示。
圖7表示PVS3基因組克隆的堿基序列和推定氨基酸序列。圖7中給出了編碼區的一部分以及與其相連的非翻譯區。氨基酸序列表示在編碼該序列的堿基下。非編碼區用小寫字母表示。終止密碼子用星號表示。
圖8表示PVS3基因組克隆以及PVS3cDNA克隆的限制酶圖譜和結構圖譜。編碼區用中空框表示。粗線表示內含子。豎線對應內含子的位置。
圖9是將煙草(Nicotiana tabacum)(TEAS)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)(PVS)、鈍天仙子(Hyoscyamus muticus)(HVS)和辣椒(Capsiumannum)(PEAS)的氨基酸序列的比對模式圖。使用與各外顯子對應的推定氨基酸。粗豎線表示煙草基因內、馬鈴薯基因內、鈍天仙子基因內和辣椒基因內的內含子位置。框格內的數字表示由外顯子編碼的氨基酸殘基數。百分數表示比較域之間的同源性得分，H、C和DDXXD(或DDXX)表示富含組氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸的(已知作為底物結合位點)的保守殘基。
圖10是用晚疫病菌絲壁成分處理后或水處理后的馬鈴薯原生質體內螢光素酶活性的測定結果。(A)表示用PVS3啟動子區進行瞬時表達測定時所使用的Luc基因的構建體。(B)中，35S表示使用CaMV 35S啟動子區時的螢光素酶活性，HWC表示使用推定啟動子區，用HWC處理時的螢光素酶活性，“水”表示用水代替HWC進行處理時的螢光素酶活性。
圖11是模式表示PVS3啟動子構建體的圖。GUS是報道基因。
圖12是表示應答創傷時PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。使用帶有PVS3啟動子的轉基因馬鈴薯葉組織。
圖13是表示應答晚疫病菌感染的PVS3啟動子的表達模式圖。使轉基因馬鈴薯葉組織(MayQueen)或作為染色對照區的非轉基因馬鈴薯葉組織(利尻)感染小種0(對于MayQueen為親和性，對于利尻為非親和性)。用GUS染色溶液檢測感染6小時、12小時、24小時和48小時后的GUS活性。在顯微鏡下進行觀察。
圖14表示轉基因馬鈴薯植物中，PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。使用GUS染色溶液檢測轉基因馬鈴薯植物的GUS活性。箭頭表示晚疫病菌感染區(GUS染色對照)。
圖15表示應答花生四烯酸(AA)的PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。將AA(5mM)或水注入轉基因馬鈴薯葉組織。用GUS染色溶液檢測注入6小時、12小時、24小時和48小時后的GUS活性。
圖16表示應答H2O2的PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。將H2O2(5mM)注入轉基因馬鈴薯葉組織。用GUS染色溶液檢測注入6小時、12小時、24小時和48小時后的GUS活性。
圖17表示應答葡萄糖/葡糖氧化酶的PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。將葡萄糖(5mM)和葡糖氧化酶(0.5U/ml)注入轉基因馬鈴薯葉組織。用GUS染色溶液檢測注入6小時、12小時、24小時和48小時后的GUS活性。
圖18表示應答水楊酸(SA)的PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。將SA(5mM)注入轉基因馬鈴薯葉組織。用GUS染色溶液檢測注入6小時、12小時、24小時和48小時后的GUS活性。
圖19表示應答Cf-9/Avr9相互作用或StMEKDD的PVS3啟動子誘導的GUS表達模式圖。將保有35s、Cf-9/Avr9、StMEKDD或空載體(對照)的農桿菌接種到轉基因馬鈴薯葉組織。用GUS染色溶液檢測接種農桿菌2天后的GUS活性。
圖20是表示引發物誘導信號轉導途徑的圖示說明。MAPKKK促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶；MAPKK促分裂原活化蛋白激酶激酶；MAPK促分裂原活化蛋白激酶；SIPK水楊酸誘導的蛋白激酶；WIPK創傷誘導的蛋白激酶；HMGR3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；PVS馬鈴薯vetispiradiene合酶圖21表示馬鈴薯植物的MEK基因(MEK)的編碼區序列及推定其所編碼的氨基酸序列。
圖22表示組成型活性形式MEK基因(stMEKDD)的編碼區序列及推定其所編碼的氨基酸序列。
圖23表示實施例中使用的引物序列的位置圖。與表示各引物位置的箭頭一起標記的編號表示SEQ ID NO(例如P9為具有SEQ ID NO.9的序列的引物)。實施例2中使用了P9、P10、P11、P14、P15、P16、P17和P18。而實施例4中使用了P11、P12、P13、P14、P15、P16、P19和P20。
圖24表示由pPVS3-1構建pPVS3-10缺失克隆時所使用的引物序列。F表示正向引物，R表示反向引物，下劃線表示限制酶的位置。
圖25表示瞬時表達測定中使用的含有PVS啟動子區的雙元載體結構。GUS基因包含內含子。
圖26表示對于INF1處理或StMEK1DD表達的PVS3啟動子活性的研究方法。對于INF1，是將保有PVS3GUSint的農桿菌注入葉中；對于StMEK1DD，是將保有PVS3GUSint和XVEStMEK1DD的農桿菌混合液注入葉中，靜置一天(A)。然后，對于INF1，將INF1溶液注入葉中；對于StMEK1DD，注入β-雌二醇后(B)再靜置一天，使StMEK1DD表達，研究GUS活性(C)。
圖27表示病毒誘導型基因沉默的過程。(A)表示沉默載體pGR106的結構。將待沉默的基因片段，此時為SIPK和WIPK的cDNA片段插入pGR106。(B)是表示通過接種含有載體的農桿菌來感染病毒的模式圖。
圖28表示對于INF1處理的PVS3啟動子活性。與對照區相比，對-1337(pPVS3-2)中注入INF則誘導GUS活性。另一方面，使-1287(pPVS3-3)之前的PVS3啟動子缺失，則經INF1處理而誘導的GUS活性顯著減少。
圖29表示PVS3啟動子的堿基序列和由pPVS3-1至pPVS3-10的缺失位置。將可能存在順式序列的-1337和-1287之間的序列用粗字體表示，將推定的TATA框和CAAT框用方框包圍。
圖30表示應答StMEK1DD表達的PVS3啟動子活性。與對照區相比，對-1337(pPVS3-2)注入β-雌二醇則誘導GUS活性。另一方面，使-1287(pPVS3-3)之前的PVS3啟動子缺失，則經β-雌二醇處理而誘導的GUS活性顯著減少。
圖31表示WIPK或SIPK對由StMEK1DD表達而誘導的PVS3啟動子活性的影響的研究方法。將保有PVS3:GUSint和XVE:StMEK1DD的農桿菌混合液注入沉默葉中，靜置一天(A)。注入β-雌二醇后(B)再靜置一天，使StMEK1DD表達，研究GUS活性(C)。
圖32表示WIPK或SIPK對由StMEK1DD表達而誘導的PVS3啟動子活性和TEAS基因表達的影響。使WIPK或SIPK沉默，則StMEK1DD誘導的PVS3啟動子活性顯著受到抑制(A)。并且，提取總RNA進行Nortern印跡分析時，只在使WIPK或SIPK沉默的區中，本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)的倍半萜環化酶基因表達受到抑制(B)。
實施發明的最佳方式(啟動子)本發明的第一方面涉及病原菌應答性啟動子，其中一個方案是包含由SEQ ID NO.1所示堿基序列形成的DNA。如后述實施例所說明的那樣，該DNA被鑒定為馬鈴薯PVS3基因的啟動子區的序列，其具有對作為病原菌的一種的晚疫病菌的特異應答性。進一步研究的結果表明，即使是該DNA的上游缺失的，含有約1,300bp的DNA(SEQ ID NO.22)也可以保持目標啟動子活性。考慮到上述情況，本發明的一個優選的方案是包含由SEQ ID NO.22所示堿基序列的DNA的病原菌特異性啟動子。另一方面，如果使該DNA序列(SEQ ID NO.22)的上游進一步缺失50bp(SEQ ID NO.23)，則啟動子活性急劇降低。由此可以推測該缺失的50bp(SEQ ID NO.23)是對于該啟動子活性的發揮極為重要的區，即包含PVS3基因啟動子的順式序列的區域。因此，該區(以下也稱為“第1DNA序列”)對于病原菌應答性啟動子的構建極為有用，另外通過使用該區，可以以高自由度設計并構建結合有病原菌應答性啟動子的DNA構建體(例如用于賦予植物病原菌抗性的重組載體。具體參照后述DNA構建體一項的內容)。這樣，作為另一種方案，本發明提供可用于構建病原菌應答性啟動子的DNA序列。這里，如果考慮到通常順式序列大多是含有十幾個堿基的序列，則第1DNA序列的一部分可能是順式序列。這意味著即使是含有第1DNA序列的一部分區的DNA，當它包含順式序列時，即成為可用于構建對病原菌應答性啟動子有用的DNA。可以推測這樣的DNA例如含有第1DNA序列中連續10個或以上堿基的堿基序列、優選含有連續15個或以上堿基的堿基序列、進一步優選含有連續20個或以上堿基的堿基序列的DNA。
使用第1DNA序列(或者其連續的一部分，或者如后所述，在保持其功能的條件下對第1DNA序列或其連續的一部分實施所希望的修飾而得到的DNA(修飾體))時，通過與其它DNA序列組合，可以構建病原菌應答性啟動子。這里所述其它的DNA序列可以使用通過與第1DNA序列(或其修飾體)協同作用而可以構建病原菌應答性啟動子的DNA序列。具體來說，作為其它的DNA序列，例如可使用SEQ ID NO.24所示的DNA序列。該DNA序列是在PVS3基因中，夾在第1DNA序列和編碼區之間的區的DNA序列(參照圖29)。該區中存在CAAT框或TATA框，使用該區還可以構建原本的PVS3啟動子區，因此通過這樣的方案，可以獲得具有高啟動子活性的病原菌應答性啟動子。另外，并不限于該例子，只要采用含有CAAT框或TATA框等的DNA序列，則通過與這些轉錄起始或轉錄調控相關的序列的協同作用，預期可以發揮良好的啟動子功能。這里的其他的DNA序列可直接或經由其他序列與第1DNA序列連接。
這里所述的“病原菌”是指感染植物使其受創傷的任何菌類，除晚疫病菌等病原絲狀菌外，當然也包括病原性細菌。這里所述的，“晚疫病菌”是指屬于疫霉屬(Phytophthora)的菌類，按照感染對象植物進行分類。晚疫病菌的具體例子有馬鈴薯晚疫病菌(致病疫霉(Phytophthorainfestans))、煙草晚疫病菌(煙草疫霉(Phytophthora nicotianae))、大豆莖晚疫病菌(大雄疫霉大豆變種(Phytophthora megasperma var.sojae))、蘋果晚疫病菌(惡疫霉(Phytophthora cactorum)和栗黑水疫霉(Phytophthoracambivora))。另一方面，除晚疫病菌之外的病原絲狀菌有馬鈴薯菌核病菌(核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum))、稻瘟病菌(Magnaprothe grisea)、大豆銹病菌(大豆銹菌(Phakopsora pachyrhizi))。另外病原性細菌可以例舉番茄青枯病菌(青枯雷爾氏菌((Ralstonia solanacearum)、細菌)。
這里，本發明的啟動子(包含對病原菌應答性啟動子的構建有用的DNA。如無特別說明，以下也同樣)優選對病原菌的感染具有特異應答性。這里所述的“特異性”是指特異性高。因此，本發明的啟動子優選為對病原菌感染具有高的特異性，即對病原菌感染具有應答性，且對病原菌感染以外的病害基本上不具應答性的啟動子。
(啟動子的獲得方法)本發明的啟動子可如下制備例如按照常規方法從男爵馬鈴薯(Splanum tuberosum L.)等馬鈴薯植物中提取基因組DNA，然后使用本發明的啟動子特異性引物，利用PCR法等基因擴增反應來制備。具體來說，例如可按照以下的過程制備本發明的啟動子。首先，將取樣后冷凍處理的馬鈴薯植物的葉或塊莖在乳缽中磨碎。接著，加入適量提取緩沖液(例如含SDS的Tris-HCl緩沖液)，以此作為提取液。接著通過苯酚提取、乙醇沉淀等進行基因組DNA的提取、純化。以這樣得到的基因組DNA為模板，使用SEQ ID NO.1的啟動子特異性引物進行PCR，得到作為擴增產物的目標DNA(啟動子)。引物例如可使用具有以下序列的引物對。
有義引物TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG(SEQ ID NO.15)反義引物TCTCCATGAGTCCTTACATG(SEQ ID NO.16)引物設計為可特異性擴增目標DNA。以下表示可特異性擴增SEQ IDNO.22的DNA的引物對。
有義引物CGGAATTCGTCCGCCCTTACTATTCCCATC(SEQ IDNO.26)反義引物CCATCGATTCCTCTTCATTGTTAAAGGGGA(SEQ IDNO.35)本發明的啟動子的制備方法并不限于上述，例如可以利用市售的馬鈴薯基因組文庫(例如馬鈴薯品種Desiree基因組文庫(Clontech))來制備。由這樣的馬鈴薯基因組文庫分離目標啟動子時，可以根據文庫的種類，利用噬菌斑雜交法或菌落雜交法(參照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York等)。例如當為使用噬菌體構建的文庫時，舉例來說，可以利用噬菌斑雜交法。選擇保有目標啟動子區的克隆時，可以使用具有本發明的啟動子特異性序列為探針。
選擇好目標克隆后，可以以該克隆所保有的DNA為模板，使用SEQ IDNO.1序列特異性引物進行PCR，由此得到作為擴增產物的本發明的啟動子。
可將得到的克隆所保有的DNA亞克隆到適當的載體中，用于以后的應用。由此，例如可用于轉化用重組載體的構建(參照后述本發明的第二方面)，或者構建用于解讀堿基序列的質粒。
本發明的啟動子的制備方法并不限于上述，例如可以利用市售的DNA合成儀等合成本發明的啟動子。
(修飾啟動子)SEQ ID NO.1的序列大約為2600bp，作為啟動子區是相當大的，因此推測與啟動子活性有直接關系的只是其中的一部分區。基于該考慮，如果能夠確認即使含有SEQ ID NO.1序列內連續的一部分的區，只要其可發揮病原菌應答性啟動子功能，則可構建本發明的病原菌應答性啟動子。考慮到通常啟動子的功能區大多位于緊鄰結構基因的前面，例如圖6和7所示的PVS3基因序列中，包含-2000位至-1位的堿基的區(SEQ IDNO.2)、優選包含同一區域中-1500位至-1位的堿基的區(SEQ ID NO.3)、進一步優選包含同一區域中-1000位至-1位的堿基的區(SEQ ID NO.4)就是功能區的有力的候選物。實際上，如后述的實施例所示，使用位于緊鄰結構基因的前面的約1300bp的區(SEQ ID NO.22)時，就可確認其具有啟動子活性。而使該約1300bp的區的上游區50bp(SEQ ID NO.23)進一步缺失，則可見啟動子活性急劇降低。即，由此可確定PVS3啟動子的至少一個功能區存在于該50bp內。考慮到該事實，本發明的啟動子中優選包含SEQ ID NO.23所示的序列。這樣的啟動子的具體例子有SEQ ID NO.22所示的DNA(PVS3基因的-1337位至-1位)。
另一方面，通常，即使對具有特定功能的DNA的一部分進行修飾也可以保持其功能。基于該考慮，即使是具有使構成以上本發明的啟動子的DNA(即SEQ ID NO.1所示的DNA或含有上述功能區(SEQ ID NO.23)的DNA(例如SEQ ID NO.22所示的DNA))的一部分經過修飾的堿基序列的DNA(以下也稱為“修飾DNA”)，只要其具有作為病原菌應答性啟動子的功能，即可構成本發明的病原菌應答性啟動子。換言之，只要保持病原菌應答性啟動子功能，一部分序列的修飾是可接受的。這里的“一部分修飾”的典型的情形有SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.2-4中任意一項的)所示的堿基序列、或SEQ ID NO.22所示的堿基序列中，1或多個堿基取代、缺失、插入或附加。這樣的修飾可以在多個位點發生。這里的“多個”因進行修飾的位置或修飾的種類而不同，例如為2-100個，優選2-50個，更優選2-10個。如上所述的修飾的DNA例如可通過限制酶處理、經外切核酸酶或DNA連接酶等的處理、導入定點誘變(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)或導入隨機誘變(Molecular Cloning，ThirdEdition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)等導入突變的方法獲得。
可以將與具有SEQ ID NO.1(或SEQ ID NO.2-4中任意一項的)的序列的DNA、或具有SEQ ID NO.22的序列的DNA在嚴謹條件下雜交、且在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA作為構成本發明的啟動子的DNA使用。還可以使用與具有在SEQ ID NO.1的序列上施加上述部分修飾而得到的序列(或在SEQ ID NO.2-4中任意一項的序列上施加上述部分修飾而得到的序列)的DNA、或者在SEQ ID NO.22的序列上施加上述部分修飾而得到的序列在嚴謹條件下雜交、且在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。這里所述的“嚴謹的條件”是指形成所謂的特異性雜合體，但不形成非特異性雜合體的條件。嚴謹的條件根據序列長度或構成堿基的種類而變動，例如以下條件使用雜交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml變性鮭精DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7.5))，在42℃孵育，然后在68℃用0.1×SSC、0.1％SDS洗滌。進一步優選的嚴謹條件有使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml變性鮭精DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7.5)作為雜交液的條件。
(DNA構建體)通過連接在本發明的啟動子控制下，任何通過表達而激活植物的防御應答的基因(轉基因)，均可以構建可使植物具有病原菌抗性的DNA構建體。作為轉化用的DNA構建體，優選將本發明的啟動子和轉基因摻入適當的載體(例如，質粒、細菌噬菌體、病毒)。
(轉基因)轉基因使用具有以下功能的基因通過在所導入的植物內表達，激活該植物的防御應答。例如可以將具有激活信息轉導途徑的功能的基因作為轉基因，其中所述信息轉導途徑是控制植物的防御應答的信息轉導途徑。這樣的基因的具體例子有具有激活促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的一種SIPK(水楊酸誘導的蛋白激酶)或WIPK(創傷誘導的蛋白激酶)的功能的MEK基因。作為MEK基因的一個例子，馬鈴薯植物的MEK基因(StMEK)的編碼區序列(SEQ ID NO.5)以及其所編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)如圖21所示。
特別優選采用編碼組成型活性形式蛋白質的基因作為轉基因。這些基因可以從原本即在轉化體內生成的激活防御應答的蛋白質原本的活性形式，其可迅速且確實地進行防御反應。編碼組成型活性形式蛋白質的基因可如下制備以編碼野生型蛋白質的基因的序列為基礎，實施部分修飾，使其所編碼的氨基酸序列的一部分發生變異。馬鈴薯植物中，制備了具有修飾的MEK的組成型活性形式MEK(StMEKDD)，本發明中，可利用編碼該StMEKDD的基因作為轉基因。StMEKDD基因的編碼區序列(SEQ ID NO.7)以及其所編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)如圖22所示。
這里，上述“防御應答”的種類沒有特別限定，例如植物抗毒素的生成、PR(病理相關)蛋白的表達、活性氧的生成、乳突毛的形成、木質化等均在其列。
(載體)上述DNA構建體的構建中所用的載體只要可將本發明的啟動子以及其控制下設置的轉基因導入目標細胞(宿主細胞)、且可使轉基因在目標細胞內表達的載體即可，對其并沒有特別限定，可以根據相應的目的利用適當的質粒載體、λ噬菌體載體等。在構建后述的利用農桿菌轉化中所使用的載體時，例如可以利用具有T-DNA邊界序列的Ti質粒載體、Ti質粒雙元載體。另一方面，在使用無需經由農桿菌的轉化方法(電穿孔法、基因槍法等)時，可以利用各種pUC系質粒載體、各種λ噬菌體載體(ZAPII等)等構建重組載體。很多載體市場都有售，本發明可以根據目的從其中適當選擇使用。
首先構建含有本發明的啟動子的載體，之后可進行轉基因的連接。即，可構建可插入所需轉基因的通用性高的載體，利用其制備轉化用重組載體。
典型的轉化用重組載體中，除本發明的啟動子之外還可含有轉基因和適當的終止子。由上游向下游依次設置啟動子、轉基因以及終止子，以通過啟動子實現轉基因的適當的轉錄。重組載體內可以含有選擇性標記或具有增強子功能的序列、編碼信號肽的序列等。
(終止子)終止子是作為使mRNA的合成終止的信號而被識別的序列。使用在植物細胞內適當發揮功能的終止子。例如可以使用Nos終止子。
(選擇性標記)選擇性標記用于識別或選擇轉化的細胞、組織、愈傷組織等。各種選擇性標記都是眾所周知的，例如可根據所使用的載體-宿主系統或使用目的，適當選擇對卡那霉素等具有抗性的npt基因(Herrera Estrella、EMBO J.2(1983)、987-995)或nptII基因(Messing & Vierra.Gene 19259-268(1982))、對潮霉素具有抗性的hph基因(Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 42929-2931)、對氨甲蝶呤具有抗性的dhfr基因(Bourouis等.，EMBO J.2(7))、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、GFP基因(Gerdes、FEBS Lett.389(1996)、44-47)、螢光素酶(Giacomin、p1.Sci.116(1996)、59-72；Scikantha、j.Bact.178(1996)、121)等使用。
啟動子或轉基因向載體的插入可以使用限制酶和DNA連接酶的方法等常規方法進行(例如參照Molecular Cloning，Third Edition，1.84，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。
(轉化方法)可將本發明的DNA構建體或重組載體用于植物的轉化。轉化方法(基因導入方法)可以使用利用農桿菌的方法(農桿菌法)、利用聚乙二醇轉基因的方法、利用電刺激轉基因的方法(電穿孔法)以及將結合有基因的金屬離子射入植物組織(細胞)的方法(基因槍法)等。各方法的詳細內容在各種文獻和出版書籍中均有記載，例如農桿菌法可參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，8467-8471或Plant Mol.Biol.20(1992)，963-976等。
轉化馬鈴薯植物時，可以采用Jefferson(1987)的方法(參照文獻19)。
導入包含本發明的啟動子和轉基因的DNA構建體而得到的轉化體中，因病原菌感染而使啟動子受到誘導，結果，其控制下的轉基因表達。因此，如果采用對病原菌感染的防御有效的基因作為轉基因，則可得到具有病原菌抗性的植物(轉化體)。
使用轉化得到的植物細胞可以再生轉基因植物。這樣的再生方法可以根據植物的種類，按照常規方法進行。
(目標植物)使用本發明的DNA構建體或重組載體轉化的植物(目標植物)并沒有特別限定，可以是任意的單子葉植物或雙子葉植物。雙子葉植物例如有被分類為茄科(馬鈴薯屬、煙草屬、番茄屬等)、薔薇科(梅屬、桃屬、蘋果屬等)、豆科(大豆屬、豌豆屬等)、十字花科(蘿卜屬等)、芝麻科等的植物，而單子葉植物例如有被分類為禾本科(稻屬、小麥屬、黑麥屬、大麥屬、燕麥屬、玉米屬、甘蔗屬等)、百合科(大蔥屬、大蒜屬)等的植物。
以下利用實施例對本發明進一步詳細說明。
以下的實施例1-8中所使用的生物學材料、試劑、實驗方法等如下。
1.供試植物使用不具真正抗性基因R1的栽培品種男爵馬鈴薯和具有真正抗性基因R1的品種利尻(Solanum tuberosum L.與野生品種S.demissum L.的種間雜交種)作為馬鈴薯植物。品種男爵采用名古屋大學農學部附屬農場栽培并于7月收獲的塊莖，品種利尻采用農林水產省北海道農業試驗場苗圃中栽培并于10月收獲的塊莖，均在4℃保存，用于試驗。制備轉基因植物時，使用不具真正抗性基因的MayQueen。
2.供試菌使用保存于名古屋大學大學院生命農學研究科資源生物功能學講座病理學研究室的馬鈴薯晚疫病菌[Phytophthora infestan(Mont.)de Bary]小種0和小種1、2、3、4。另外，使用該研究室保存的馬鈴薯晚疫病菌[Phytophthora infestan(Mont.)de Bary]小種1、2、3、4，作為制備馬鈴薯晚疫病病菌菌絲壁成分(HWC)引發物所使用的菌。
3.菌接種物的制備馬鈴薯晚疫病菌的游動性孢子懸浮液如下制備。將保存于4℃的馬鈴薯(品種男爵)的塊莖用自來水充分洗凈，然后在1％次氯酸鈉中浸泡約10分鐘。將馬鈴薯塊莖切片(厚度約10mm)，水洗后涂布接種濃度為約104孢子/ml游動孢子懸浮液，在20℃的濕暗條件下培養6天。用鑷子取下切片表面生長的菌，懸浮于冷蒸餾水(4℃)中。將孢子懸浮液用金屬篩(356篩號)過濾，除去菌絲，用濾紙(ADVANTEC No.5B)進行吸濾。用冷蒸餾水洗滌濾紙上收集的游動孢子囊，然后再懸浮于冷蒸餾水中，在10℃靜置2小時。用紫外可見光分析系統(DU系列600、Beckman)測定游動孢子懸浮液的吸光度，將濃度調節為500nm波長下的吸光度為0.068(105孢子/ml)，以此作為接種物使用。
4.菌絲壁成分引發物的制備按照Doke和Tomiyama，(1980)的方法(參照文獻14)，如下制備晚疫病菌菌絲壁成分(HWC)。將馬鈴薯晚疫病菌置于裝有30ml黑麥培養基的100ml三角燒瓶中，在20℃靜置培養2周。用自來水將回收的菌絲叢洗凈，通過吸濾除去水分，在-80℃冷凍保存。將冷凍菌絲體在乳缽中磨碎，懸浮于菌絲體重5倍量的50mM乙酸緩沖液(pH4.5)中。用超聲波破碎儀(W-225R Heat System-Ultrsonics inc.)，以45W的輸出對該懸浮液超聲波處理5分鐘，然后用14,000×g離心30分鐘。將所得沉淀懸浮于與之前等量的50mM乙酸緩沖液(pH4.5)中，再在與之前相同的條件下進行超聲波處理和離心。將所得沉淀懸浮于與菌絲體等重量的0.1M硼酸緩沖液(pH8.8)中，在與上述同樣的條件下進行超聲波處理，然后經120℃高壓釜處理20分鐘，14,000×g離心30分鐘，回收上清。另一方面，將沉淀再懸浮于0.1M硼酸緩沖液(pH8.8)中，超聲波處理和高壓釜處理后離心。將所得上清與之前得到的上清合并，使用透析管(排阻限分子量為12,000)，在4℃用水透析24小時。用分液漏斗將透析后的溶液與等量的二乙醚混合，靜置。回收乳濁液層，用旋轉蒸發干燥器減壓干燥醚，向濃縮物中加入適量的水，冷凍干燥。所得干燥標品為HWC，用于以后的實驗。使用HWC時，用超聲波儀、以45W的輸出進行3分鐘超聲波處理，懸浮于水中。
5.馬鈴薯塊莖片的制備馬鈴薯塊莖片如下制備。將保存于4℃的馬鈴薯(品種利尻)的塊莖用自來水充分洗凈，然后在1％次氯酸鈉中浸泡約10分鐘。用木塞鉆孔器(直徑20mm)將塊莖沿莖軸方向鉆入，取柔軟組織部分制備圓柱狀的組織柱。用切片機由該柱制備2mm厚度的片。制備的片立即用冷蒸餾水(約4℃)洗凈，排列在塑料盤中，在濕暗條件下靜置，陳化21小時。該操作完全在黑暗條件下進行。
6.HWC處理及菌的接種對根據上述5.的方法制備的馬鈴薯塊莖片，每一片分別用100μl蒸餾水進行前處理，靜置3小時。然后將各片用1mg/ml HWC或作為對照的100μl蒸餾水處理。將馬鈴薯晚疫病菌游動性孢子接種在片上時，為了使游動性孢子濃度保持均勻，一邊攪拌懸浮液(105孢子/ml)一邊接種100μl。對馬鈴薯的葉組織接種菌時，每一片各用500μl蒸餾水進行前處理，靜置3小時。然后為了使游動性孢子濃度保持均勻，一邊攪拌懸浮液一邊對各葉組織接種500μl。
將處理和接種的片、葉組織再在20℃濕暗條件下靜置，靜置規定的時間。處理后，以3片靜置的馬鈴薯塊莖片為一組，以8片葉組織為一組，包在鋁箔中，在液氮中冷凍固定，在-80℃保存。
7.由馬鈴薯葉或塊莖提取總RNA總RNA的提取按照Yoshioka等(1996)的方法(參照文獻52)進行。將各2g馬鈴薯葉或塊莖片在乳缽中一邊加入液氮一邊磨碎，加到裝有5ml提取緩沖液[100mM Tris-HCl(pH9.0)、100mM NaCl、1％SDS]、1ml 2-巰基乙醇、2.5ml 1M Tris(pH9.0)飽和苯酚、2.5ml氯仿異戊醇(24∶1；v/v)并經DEPC處理過的滅菌離心管中，充分懸浮，然后離心(8,000rpm、15分鐘)。向回收的上清中加入二十分之一量的5M氯化鈉、5ml異丙醇，在-20℃靜置1小時。向離心(8,000rpm、15分鐘)得到的沉淀中加入5ml胍鹽緩沖液[4M硫氰酸胍、25mM乙酸鈉(pH7.0)、0.5％N-月桂酰基肌氨酸、20mM 2-巰基乙醇]、500μl 2M乙酸鈉(pH4.0)、5ml水飽和苯酚、1ml氯仿·異戊醇(49∶1；v/v)中，充分懸浮，離心(8,000rpm、15分鐘)。向回收的上清中加入5ml異丙醇，在-20℃靜置1小時。將離心(8,000rpm、15分鐘)得到的沉淀懸浮于300μl胍鹽緩沖液，加入等量的異丙醇，在-20℃靜置1小時。在室溫下，將離心(12,000rpm、15分鐘)得到的沉淀用500μl 3M乙酸鈉(pH5.2)洗滌，離心(12,000rpm、15分鐘)。將該洗滌操作重復2次，再用500μl 70％乙醇洗滌，離心(15,000rpm、15分鐘)分離。所得的沉淀真空干燥后溶解于100μl DEPC處理水，以其作為總RNA樣品。
8.Nortern印跡分析用甲醛瓊脂糖凝膠電泳(參照文獻37)對總RNA進行分級，通過堿印跡法(alkaline blotting)(參照文獻36)轉印Hybond-N+尼龍膜(Amersham)并固定。采用葉PVS1cDNA作為探針。
將吸附有RNA的尼龍膜在42℃的預雜交溶液[50％甲酰胺、5×Denhartz溶液(參照文獻37)、5×SSPE(參照文獻37)、0.5％SDS、100μg/ml熱變性鮭精DNA(Pharmacia)]中放置1小時或以上，然后添加32p標記DNA探針，在42℃下雜交16小時或以上。將該膜在含有0.1％SDS的4×SSPE中、在室溫下洗滌15分鐘(2次)；在含有0.1％SDS的4×SSPE中、在60℃下洗滌15分鐘；再在含有0.1％SDS的2×SSPE中、在60℃下洗滌15分鐘(1次)。使用X射線膠片OMAT-AR(Kodak)和增感紙Lighting Plus(Dupont)，在-80℃下進行放射自顯影。
9.RT-PCRRT-PCR使用RT-PCR high-Plus(TOYOBO)進行。cDNA的合成如下進行使用1.0μg總RNA、10pmol/μl反義引物和10pmol/μl反義引物，將包括94℃(1分鐘)、47℃(1分鐘)的擴增反應進行25個循環。使用的引物如下，圖23中表示了各cDNA退火的位置。
PVS15’-AGGAGATTGTTCGCCCCATA-3’(SEQ ID NO.9)和5’-TCTCCATGAGTCCTTACATG-3’(SEQ ID NO.10)(469bp)、或者5’-CATCGATTGTTTTGTACATCTG-3’(SEQ ID NO.11)和5’-AATAATGATACAAAAAAAAATTAAGG-3’(SEQ ID NO.12)(176bp)PVS25’-TATCAATTCACCAAGGAACACT-3’(SEQ ID NO.13)和5’-GAAGTAATTAAATTTAAATATTATCAA-3’(SEQ ID NO.14)(132bp)PVS35’-TTGTCTGCTGCTGCTTGTGG-3’(SEQ ID NO.15)和5’-TCTCCATGAGTCCTTACATG-3’(SEQ ID NO.16)(326bp)PVS45’-AGGACATTGTTCGACCTGTT-3’(SEQ ID NO.17)和5’-TCTCCATGAGTCCTTACATG-3’(SEQ ID NO.18)(469bp)、或者5’-CATCCCTTAAAATTATAAGTATTC-3’(SEQ ID NO.19)和5’-AATAATGATACAAAATAAATTAAGG-3’(SEQ ID NO.20)(131bp)通過2％瓊脂糖凝膠電泳對合成的cDNA分級，用溴化乙錠染色，確認條帶的有無(參照文獻37)。
10.由馬鈴薯塊莖制備可溶性組分由馬鈴薯塊莖片制備可溶性組分的方法可對Dixon和Fuller，(1978)的方法(參照文獻13)進行部分變化來進行。
將3片馬鈴薯塊莖片作為1組，包在鋁箔中，在液氮中冷凍固定，在-80℃保存。將冷凍的馬鈴薯塊莖片在乳缽中一邊加入液氮一邊研磨棒粉碎。向所得的馬鈴薯塊莖粉末中加入2g酚吸附劑polycra AT，用研磨棒攪拌。之后加入7ml提取緩沖液
，懸浮后冷卻離心(14,000rpm、20分鐘、4℃)，將得到的上清在-80℃下保存。
11.大腸桿菌中融合蛋白的表達及其提取為了獲得用于制備抗體的抗原，將馬鈴薯PVS在大腸桿菌中表達。將全長的PVS1 cDNA的可翻譯區插入由EcoRI和XhoI酶切的表達載體pET-32b(+)(寶酒造)，將所得載體導入大腸桿菌(BL21，Novagen)。將該大腸桿菌接種于含有50μg/ml carvenicilin的LB瓊脂培養基上，在37℃培養過夜。準備四只裝有50ml含200μg/ml carvenicilin的LB液體培養基的500ml燒瓶，從培養基上挑單一菌落，分別懸浮于各燒瓶中。在37℃振蕩培養(140rpm)，直至A600＝0.6。將其中的250μl作為誘導前蛋白質樣品，用于確認融合蛋白的表達。之后添加IPTG，使終濃度為1mM，誘導蛋白質表達，再在37℃振蕩培養3小時(140rpm)。在冰上冷卻5分鐘，然后將培養液離心(5,000rpm、10分鐘)。除去上清，將沉淀再懸浮于5ml大腸桿菌懸浮溶液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM EDTA]，將其中的100μl作為誘導后蛋白質樣品，用于確認對融合蛋白的誘導表達。將培養液再次離心(5,000rpm、10分鐘)，除去上清，將大腸桿菌的沉淀用于確認融合蛋白的可溶性。
對誘導融合蛋白表達的確認和對可溶性的確認如下進行。將如上取樣的誘導前和誘導后蛋白質樣品離心(5,000rpm、30秒)，除去上清，將沉淀再懸浮于100μl大腸桿菌懸浮溶液。由各懸浮液各取樣10μl，進行SDS-PAGE、Western印跡分析。SDS-PAGE和Western印跡分析按照14.SDS-PAGE和Western印跡分析項的內容進行。確認誘導表達后，將誘導融合蛋白表達的大腸桿菌的沉淀充分懸浮于預先冰冷卻的5ml結合緩沖液[5mM咪唑、0.5M氯化鈉、20mM Tris-HCl(pH7.9)]。將懸浮液移入透明的離心管中，一邊將離心管冰冷卻一邊用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌。將菌體懸浮液離心(12,000rpm、10分鐘)，將上清作為可溶解組分。向沉淀中加入5ml含尿素的結合緩沖液(將6M尿素加入結合緩沖液所得)，再懸浮，然后將懸浮液離心(12,000rpm、10分鐘)，將上清作為尿素組分。分別從可溶解組分、尿素組分取樣10μl，進行SDS-PAGE、Western印跡分析。SDS-PAGE和Western印跡分析按照14.SDS-PAGE和Western印跡分析項的內容進行。
在尿素組分中確認有融合蛋白，因此逐步去除尿素，并且再生所生成的蛋白質的結構。蛋白質的再生操作如下進行。將尿素組分轉移至透析管，在4℃用200ml 4M尿素透析液[4M尿素、10mM Tris-HCl(pH7.0)、5mM DTT]透析1小時。將透析液換為200ml 2M尿素透析液[4M尿素透析液中尿素濃度改為2M]，在4℃透析1小時。再將透析液換為200ml無尿素透析液[4M尿素透析液中除掉尿素所得]，在4℃透析1小時。再次將透析液換為200ml無尿素透析液[4M尿素透析液中除掉尿素所得]，在4℃透析過夜。將該溶液移入Eppendorf管中，離心(15,000rpm、10分鐘)，然后將上清移入新的管中。將該組分作為再生組分，作為用于制備抗體的抗原。通過以上的操作，得到了4ml 8mg/ml的融合蛋白。
12.抗PVS抗體的制備將小鼠(BALB/c、雌性、4周齡)飼養5天，將含有100μg在大腸桿菌中表達的融合蛋白的溶液和完全弗氏佐劑(DIFCO)等量混合，將100μl所得乳液進行腹膜注射。1周后，將100μg融合蛋白和不完全弗氏佐劑(DIFCO)等量混合，將100μl所得乳液進行腹膜注射。10天后切取小鼠的尾部采血，用Western印跡分析法研究是否產生抗HMGR抗體。確認發生了抗原抗體反應，因此再將100μg融合蛋白和不完全弗氏佐劑(DIFCO)等量混合，將100μl所得乳液進行腹膜注射。一周后采血，在4℃靜置過夜，沉淀出血凝塊。將該血液離心(10,000rpm、15分鐘)，將上清作為抗血清，分成小份注入Eppendorf管中，在-80℃保存。
13.蛋白質定量樣品的蛋白質濃度測定使用根據Bradford(1976)方法制成的蛋白質定量試劑盒(BIO-RAD)進行。校正曲線使用BSA制作。
14.SDS-PAGE和Western印跡分析蛋白質樣品的SDS-PAGE按照Laemmli(1970)的方法進行。將10μl樣品與10μl樣品緩沖液[含2％SDS、10％巰基乙醇、0.002％BPB、20％甘油的50mM Tris-HCl(pH8.5)]混合，煮沸5分鐘后冰冷卻，用10％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。
Western印跡分析按照Towbin等(1979)的方法(參照文獻55)進行。將SDS-PAGE后的凝膠、濾紙、硝基纖維素膜(PROTPRAN，Schleicher和Schuell)分別在轉印用緩沖液(0.1M Tris、0.192M甘氨酸、20％甲醇、0.1％SDS)中浸泡30分鐘，然后置于半干印跡儀(ATTO)的載物臺上，用2mA/cm2的恒定電流通電60分鐘，將凝膠中的蛋白質轉印到硝基纖維素膜上。將該硝基纖維素膜在含有5％脫脂乳的TBS-T[含137mM氯化鈉、0.1％吐溫20的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.6)]中振蕩過夜，進行封閉。將該膜在TBS-T中洗滌15分鐘一次；再洗滌兩次，每次洗滌5分鐘，然后在含有作為第一抗體的抗馬鈴薯PVS抗體(稀釋2,000倍)的TBS-T中振蕩1小時。再將膜在TBS-T中洗滌，然后在含有作為第二抗體的抗小鼠Ig抗體(Amersham)的TBS-T中振蕩30分鐘。將膜在TBS-T中洗滌，然后用ECL檢測試劑盒(Amersham)在Hyper Film(Amersham)上進行信號的檢測。
15.探針的制備以摻入了馬鈴薯的PVS1-4cDNA的質粒作為模板，使用圖23所示的引物，通過PCR對各基因的堿基序列進行特異性擴增。使用2ng摻入TaKaRa TaqTM(寶酒造)和插入片段DNA的質粒，在DNA熱循環儀PJ 2000(Perkin Elmer Cetus)上，以94℃-1分鐘(熱變性)、53℃-45秒(退火)、72℃-2分鐘(DNA延伸反應)為一個循環，進行25個循環的反應。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認擴增的DNA片段的大小。使用QIAquickGel提取試劑盒(QIAGEN)從凝膠中純化DNA片段。
16.馬鈴薯基因組文庫的篩選基因組文庫使用已有的馬鈴薯基因組文庫(馬鈴薯品種Desiree，Clontech)。
根據噬菌斑雜交法篩選噬菌體克隆(參照文獻37)。將每個培養皿調節為30,000噬菌斑，將該噬菌體溶液與200μl宿主大腸桿菌XL1-BlueMRA(P2)菌株(10mM硫酸鎂、A600＝2)混合，在37℃靜置20分鐘，然后將其與3ml NZYM頂層瓊脂糖(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、10mM硫酸鎂、0.5％氯化鈉、0.6％瓊脂糖)混合，重疊接種于NZYM瓊脂培養基(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、10mM硫酸鎂、0.5％氯化鈉、1.5％瓊脂粉末)上。在37℃下培養至噬菌斑直徑約0.5mm，然后在4℃靜置1小時。使培養基上的噬菌斑吸附在Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上，用變性溶液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)處理7分鐘，用中和溶液[1.5M氯化鈉、0.5mM Tris-HCl(pH7.2)、1mM EDTA]處理3分鐘，然后用2×SSPE洗滌。再通過0.4M氫氧化鈉將DNA固定在膜上，然后用5×SSPE洗滌(2次)。從合計6.0×105個克隆中篩選目標克隆。
初次篩選后，使用PVS1-4各成員特異性引物進行PCR，選擇具有推定大小的條帶的PVS1、PVS2和PVS4，再進行二次、三次篩選。
探針的制備、雜交、洗滌和放射自顯影與18.中所述的Southern雜交的情形相同。
17.噬菌體DNA的分離·純化噬菌體DNA的分離·純化根據液體培養法(參照文獻23)和聚乙二醇(PEG)沉淀法(參照文獻37)，按照以下的方法進行。從瓊脂中回收目標噬菌斑，轉移至含有100μl SM溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1M氯化鈉、7mM硫酸鎂、0.01％明膠]和1μl氯仿的1.5ml管中，在4℃靜置過夜，然后充分懸浮。用200ml燒瓶將宿主大腸桿菌[XL1-BlueMRA(P2)菌株]在80ml NZYM(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、10mM硫酸鎂、0.5％氯化鈉)中、在30℃下振蕩培養過夜。通過離心(8,000rpm、3分鐘、4℃)回收沉淀的宿主大腸桿菌，然后懸浮于10mM硫酸鎂溶液中，調整為A600＝2。將這樣制備的500μl宿主大腸桿菌懸浮液與50μl噬菌體懸浮液混合，在37℃下靜置20分鐘，然后用50ml NZYM在37℃下振蕩培養，確認溶菌。加入2.9g氯化鈉和0.4ml氯仿，再振蕩10分鐘。通過離心(10,000rpm、10分鐘、4℃)回收上清，與相當于上清的五分之一量的50％PEG 6000混合，然后在冰中靜置1小時。通過離心(12,000rpm、20分鐘、4℃)回收沉淀，懸浮于400μl Tris-Mg-NaCl[10mMTris-HCl(pH7.5)、49.6mM氯化鈉、4.9mM氯化鎂]。向該溶液中添加4μl 10mg/ml RNase A(Sigma)和4μl 10mg/ml DNase I(Sigma)，在37℃下處理1小時，然后氯仿提取三次。添加與回收的上層等量的2×STE[80mM Tris-HCl(pH7.5)、2％SDS、0.5M EDTA]和五分之一量的10mg/ml蛋白酶K，在65℃處理10分鐘，然后用相同容量的Tris飽和苯酚、苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)、氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)依次提取。向回收的上層中加入2倍量的冷乙醇，在-20℃下靜置30分鐘，然后通過離心(12,000rpm、10分鐘、4℃)回收沉淀。將沉淀用70％乙醇洗滌，然后減壓干燥，溶解于100μl水中。
18.Southern印跡分析用選定的限制酶(寶酒造)消化目標克隆的總DNA，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行分級(參照文獻37)。通過堿印跡法(參照文獻36)將分級的DNA片段轉印到Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上。
32P標記DNA探針根據隨機引物法(Feinberg和Vogelstein，1983)，使用[α-32P]dCTP(ICN Biochemicals)和Megaprime DNA Labellingsystems(Amersham)制備。
將吸附有DNA的尼龍膜在42℃的預雜交溶液[5×Denhardt溶液(參照文獻37)、5×SSPE(參照文獻37)、0.5％SDS、100μg/ml熱變性鮭精DNA(Pharmacia)]中放置1小時或以上，然后添加32P標記DNA探針，在42℃下雜交16小時或以上。將該膜在含有0.1％SDS的2×SSPE中洗滌10分鐘(2次)，再在含有0.1％SDS的1×SSPE中洗滌10分鐘(1次)。洗滌全部在室溫下進行。使用X射線膠片OMAT-AR(Kodak)和增感紙Lighting Plus(Dupont)，在-80℃下進行放射自顯影。
19.質粒的制備為了確定堿基序列，使用pBluescript KS+(Stratagene)對目標DNA片段進行亞克隆。
用選定的限制酶(寶酒造)消化目標克隆的總DNA，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行分級(參照文獻37)，用QIAquick Gel提取試劑盒(QIAGEN)純化含有目標DNA片段的瓊脂糖凝膠。經限制酶消化的載體通過堿性磷酸酶E.coli C75(寶酒造)進行脫磷酸處理(37℃、1小時)后，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)、氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)依次提取。向回收的上層中加入2倍量的冷乙醇和二十分之一量的3M NaCl，在-20℃下靜置30分鐘，然后通過離心(12,000rpm、10分鐘、4℃)回收沉淀。將沉淀用70％乙醇洗滌，然后減壓干燥，溶解于20μl TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]。將如上制備的載體及其插入片段調整為載體插入片段的摩爾比為1∶1，用DNA連接試劑盒ver.2(寶酒造)連接，用連接的質粒DNA轉化E.coli JM109感受態細胞(寶酒造)，然后接種于LB/Amp/X-gal/IPTG瓊脂培養基上(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化鈉、0.1mg/ml氨芐青霉素溶液、0.004％X-gal溶液、0.5mM IPTG溶液、1.5％瓊脂粉末)，在37℃下培養過夜。將進行了藍白菌落篩選的單一菌落在LB/Amp液體培養基(2ml LB、0.1mg/ml氨芐青霉素)中培養過夜，分離質粒DNA。使用Flexiprep Kit(AmershamPharmacia Biotech)進行質粒DNA的提取和純化。
20.DNA堿基序列的確定和數據庫分析堿基序列的確定使用基于脫氧終止法(參照文獻38)的PRISM DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(AppliedBiosystem)進行。使用ABI 373S DNA測序儀·DNA序列自動分析裝置(Applied Biosystem)進行反應產物在變性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳和堿基序列的讀取。使用日本國立遺傳學研究所日本DNA數據庫(DDBJ)的大型計算機BLAST程序(參照文獻1)對堿基序列的連接、閱讀框的氨基酸序列、以及與已知基因的同源性進行分析。氨基酸序列的比對采用CLUSTALw程序(參照文獻43)。
21.使用馬鈴薯塊莖原生質體進行的瞬時表達測定使用馬鈴薯塊莖原生質體進行的瞬時表達測定參考Hashimoto等。(1992)的方法(參照文獻18)如下進行。在800μl含有1×106個來自馬鈴薯培養細胞的原生質體的溶液(0.5M甘露糖醇、0.1mM MgSO4、pH7.0)中加入25μg轉基因，通過移液管輕輕地吹吸混合，在冰上靜置10分鐘。將該溶液移至預先冷卻的杯中，使用基因導入裝置CUY 21(TokiwaScience)，在恒定電流條件下實施電穿孔(6v，50pon，75poff，4次)。將溶液移至離心管。在冰上靜置10分鐘，然后去除上清，加入900μl培養液，移至12孔培養板，在20℃的暗處靜置1小時。之后向經電穿孔導入了含有PVS3推定啟動子區的載體的原生質體中加入100μl滅菌水或者100μl 1mg/ml HWC，靜置12小時。陽性對照為經電穿孔導入了含有CaMV 35S啟動子區的載體的原生質體，將其靜置12小時。除去上清，用1×PBS洗滌原生質體，然后用雙螢光素酶報道檢測系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)測定螢光素酶活性。
22.轉基因植物的制備和GUS染色轉基因植物的制備和GUS染色按照Jefferson(1987)的方法(參照文獻19)進行。轉基因植物的制備使用無菌培養的MayQueen的莖。使轉化載體pBI121(Clonetech)的CaMV35S啟動子缺失，使翻譯起始密碼子上游2648bp的PVS3推定啟動子區經由BamHI與GUS基因的上游連接，使得GUS可以框內翻譯(圖11)。通過電穿孔法將該載體導入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(Clonetech)。將切取的莖在根癌農桿菌的培養液中浸泡2分鐘，使其感染，于20℃下、在培養皿中的3C5ZR培養基[30g蔗糖、2g吉蘭糖膠、100ml MS礦物質(10×)、5mlFe-EDTA、100ml肌醇、2.4ml 3C5ZR維生素(1ml的1mg/ml鹽酸硫胺素，0.5ml的1mg/ml煙酸，0.5ml的1mg/ml鹽酸維生素B6、0.4ml的1mg/ml天冬氨酸)、5.3ml IAA(0.1mg/ml)、17.5ml玉米素核苷(0.1mg/ml)，pH5.9，每1000ml]中靜置3天。然后移至含有卡那霉素(100μg/ml)和氨噻肟頭孢霉素(300μg/ml)的3C5ZR培養基上。該步驟每周重復一次，生出苗后，移至S1再生培養基(15g蔗糖、3g吉蘭糖膠、100mlS1礦物質(10×)、5ml Fe-EDTA、2.0ml V2維生素、pH5.7，每1000ml)上，確認根的再生。
GUS染色時，將植物組織在GUS染色液中[100μl X-Gluc(50mg/mlDMF中)、1ml 500mM磷酸緩沖液(pH7.0)、2ml100％甲醇、7.9ml 0.5％triton X-100，每10ml]減壓滲透，在37℃的黑暗條件下染色一晝夜。之后，將染色組織在乙酸∶乙醇∶甘油(1∶3∶1)的脫色液中煮沸脫色并觀察。顯微鏡觀察接種的馬鈴薯晚疫病菌時，將脫色的組織在乳酚溶液中(10ml乳酸、10g苯酚、10ml甘油、10ml水、40ml乙醇)煮沸，反復進行。之后在浸有水合氯醛(2.5g/ml)的濾紙上、在4℃的黑暗條件下脫色2天并觀察(參照文獻49)。
23.馬鈴薯葉組織中經由根癌農桿菌的瞬時表達測定經由根癌農桿菌的瞬時表達測定按照Chang等人.(2002)的方法(參照文獻7)進行。在通過電穿孔導入了含有Cf-9/Avr9或StMEKDD(SEQ IDNO.7)的雙元載體的根癌農桿菌LBA4404中加入利福平(50μg/ml)和選定抗生物質，進行培養。將根癌農桿菌離心(3,000rpm、15分鐘)收集菌體，在導入緩沖液[1×10x Murashige-Skoog鹽、1/10x維生素B5、2％蔗糖、1％葡萄糖、150μM乙酰丁香酮、20mM MES pH5.4]中懸浮，將濃度調解為OD600＝0.1。使用1ml的注射筒，由葉的背面注入懸浮液，2天后GUS染色。
<實施例1>接種晚疫病菌的馬鈴薯塊莖組織中PVS mRNA的蓄積情況對馬鈴薯塊莖進行親和性、非親和性小種接種以及水處理，然后在不同時間由3片馬鈴薯塊莖提取總RNA，使用PVS1 cDNA進行Nortern印跡分析。分析結果如圖2所示。在親和性菌處理區、非親和性菌處理區都見到PVS mRNA的蓄積。
<實施例2>接種晚疫病菌的馬鈴薯塊莖組織中PVSl-4各成員特異性RT-PCR為了研究馬鈴薯塊莖組織中PVS1-4各成員是否表達，從進行了親和性、非親和性小種接種以及水處理后經過3、6小時后冷凍的馬鈴薯塊莖中提取總RNA，使用PVS1-4各成員特異性引物(SEQ ID NO.9、10、13、14、15、16、17和18)進行RT-PCR。親和性菌處理區、非親和性菌處理區中都檢出了相應于PVS1-4的預計大小為469bp、132bp、326bp和469bp的條帶(圖3)。
<實施例3>接種非親和性小種和親和性小種的馬鈴薯塊莖組織中的PVS蛋白的Western印跡分析為了研究PVS mRNA的蓄積情況是否反映到實際的蛋白質合成中，制備了抗馬鈴薯PVS抗體，進行Western印跡分析。為了獲得用于制備抗體的抗原，以推定氨基酸序列為基礎，在大腸桿菌內表達。將通過PCR制備的PVS1 cDNA翻譯區插入表達載體，作為與硫氧還蛋白的融合蛋白在大腸桿菌內表達。對誘導表達前后的大腸桿菌總蛋白質進行SDS-PAGE，用CBB溶液染色凝膠。尿素組分中檢測出約83kD的條帶，因此由該組分透析除去尿素，作為用于制備抗體的抗原。
使用制備的抗體研究抗體的效價，稀釋1,000倍使用時，可以檢測10ng的抗原。由此判斷該抗體具有足夠的效價以進行之后的Western印跡分析，因此進行24小時陳化后，從馬鈴薯塊莖片中制備可溶性組分在接種水處理、非親和性小種或親和性小種24小時內，使用抗馬鈴薯PVS抗體進行Western印跡分析(圖4)。6小時以后，在非親和性和親和性小種的接種區都可見PVS蛋白的蓄積。而在水處理區則未見PVS蛋白質的蓄積。這些結果支持了圖2中PVS mRNA的蓄積在接種6-9小時出現峰的結果。
<實施例4>接種晚疫病菌的馬鈴薯葉組織中PVS1-4各成員特異性RT-PCR為了研究馬鈴薯葉組織中PVS1-4的各成員是否表達，在進行了親和性、非親和性小種接種以及水處理、創傷處理后12小時內不同的時間，從3片馬鈴薯葉中提取總RNA，使用PVS1-4各成員特異性引物(SEQ IDNO.11、12、13、14、15、16、19和20)進行RT-PCR。然后使用PVS1-4各成員特異性cDNA探針進行Southern印跡分析。親和性菌接種區、非親和性菌接種區中，只檢測出顯示顯著的m RNA蓄積的一條條帶，它是代表PVS3的預計大小為326bp的條帶(圖5)。使用作為陽性對照的來自塊莖組織的RNA時，檢測出分別相應于PVS1-4的預計大小為176bp、132bp、326bp和131bp的條帶(圖5)。
<實施例5>馬鈴薯基因組文庫的篩選考慮到單倍體馬鈴薯基因組大小為1.6-1.8×109bp(Arumuganathan和Earle，1991)，馬鈴薯基因組文庫的大小平均值是每個噬菌斑為1.5×104bp，并且馬鈴薯為四倍體植物，為了篩選馬鈴薯的全部染色體，必須至少篩選5.2×105個噬菌斑。因此，以PVS1 cDNA的全長為探針，篩選了6.0×105個噬菌斑。初次篩選的結果確認了87個克隆。為了區分PVS1-4，同時獲得推定啟動子區，從該87個克隆中，分別利用PVS1-4各個成員特異性位點構建引物，對其PCR產物進行電泳。對PVS1、PVS2、PVS3和PVS4分別選擇3個克隆，進行二次、三次篩選。
將篩選所得克隆分別用EcoRI、HindIII或XhoI單獨進行消化，通過所述引物篩選得到PCR產物為探針進行Southern印跡雜交。結果檢測出與該探針雜交的條帶。由于已確認獲得了目標克隆，因此將雜交的、經EcoRI、HindIII消化的DNA片段亞克隆到pBluescript KS+載體，確定堿基序列。
<實施例6>DNA堿基序列的確定和數據庫分析對亞克隆的PVS1、PVS3和PVS4的DNA片段進行全堿基序列的確定(圖6、7、8、9)。圖6和圖7表示PVS3的啟動子區(SEQ ID NO.1)和編碼區(SEQ ID NO.21)。為了對PVS3cDNA和PVS3的基因組結構進行研究，將已經分離的PVS3 cDNA(參照文獻53)和本實施例所得的PVS3基因組DNA序列進行了比較。可知對于PVS3，除了3’-非翻譯區，全部的堿基序列以及推定的氨基酸序列均一致，由六個內含子分隔(圖8)。而與PVS3不同，PVS1和PVS4兩者均由5個內含子分隔，(圖9)。已知馬鈴薯植物的栽培品種是四倍體，在基因組中存在多個同源基因(文獻56)。本實施例中得到的PVS3基因組克隆只有3’-非翻譯區與PVS3cDNA不同，因此可以認為這是編碼PVS3亞家族之一的基因。
Back和Chappel(1996)報道了倍半萜環化酶中的功能分化(參照文獻4)。對煙草(TEAS)、辣椒(PEAS)的倍半萜環化酶——5-表-馬兜鈴堿合酶，以及天仙子(HVS)、馬鈴薯(PVS)的vetispiradiene合酶的推定氨基酸序列進行了比較。得知都為VS的HVS和PVS3或PVS4之間，在vetipiradiene專一性域中，可見90％或以上的同一性(圖9)。而PVS3和PEAS之間的同一性則為80％或以下。存在底物結合位點的馬兜鈴堿專一性域中，PVS與TEAS，或者PVS與PEAS之間，同一性為78％-89％，而PVS與HVS之間可見98％或以上的高的同一性。在葉組織中表達的倍半萜環化酶含有被六個內含子分隔的七個外顯子；而在馬鈴薯塊莖組織中表達的PVS1和PVS4含有被五個內含子分隔的六個外顯子(圖9)。
<實施例7>通過使用原生質體的瞬時表達測定，研究PVS3啟動子對HWC的應答性將PVS3推定啟動子區連接到螢光素酶的上游，制備pGL3載體，通過電穿孔將其導入原生質體，研究對于HWC的應答性(圖10)。與水處理區比較，HWC處理區可見顯著高的螢光素酶活性，表明本實驗中使用的翻譯起始密碼子上游的2,648bp的區產生引發物應答。
<實施例8>轉基因植物中PVS3基因的表達情況為了詳細地研究PVS3的表達情況，將PVS3推定啟動子區連接到GUS基因的上游，制備雙元載體(圖11)，將該雙元載體導入對馬鈴薯晚疫病菌沒有真正抗性基因的MayQeen，制備轉化體。為了研究PVS3基因對于創傷的應答，將轉基因馬鈴薯葉組織的一部分切除，在不同時間進行GUS染色(圖12)。結果切除部位在48小時后仍未染色。由此顯示本啟動子不對創傷產生應答。
為研究對晚疫病菌的應答，接種晚疫病菌親和性小種并進行顯微鏡觀察，6小時以內可在入侵細胞內見到GUS染色(圖13)。接種48小時后，在整個接種葉上可見強烈的表達。這顯示本啟動子應答晚疫病菌親和性小種的感染。
為了研究是否存在本啟動子可恒定表達的器官，將整株轉基因馬鈴薯植物進行GUS染色(圖14)。除了作為GUS染色的陽性對照使用的晚疫病菌接種葉組織，在生長點或根等部位未見染色。該結果顯示本啟動子為病原菌特異性應答。
為了研究本啟動子是否對任何病害信號都應答，將葉組織用各種引發物處理并進行GUS染色(圖15、16、17、18)。用馬鈴薯晚疫病菌膜的構成脂肪酸——花生四烯酸進行處理時，24小時后可見GUS染色(圖15)。而對于活性氧的一種的過氧化氫處理或生成過氧化氫的葡萄糖·葡糖氧化酶處理、或者與整株獲得性抗性有關的水楊酸等任何的處理都未見GUS染色(圖16、17、18)。
番茄品種的抗性基因產物Cf-9對番茄葉霉病菌(番茄葉霉菌(Cladosporium fulvum))的專一性引發物Avr9應答，則信息轉導機制起作用，誘導過敏性反應，這是眾所周知的(參照文獻41)。經由農桿菌，Cf-9/Avr9在葉組織中瞬時表達，此時可以GUS染色(圖19)。并且，使組成型活性突變酶StMEKDD(SEQ ID NO.7、8)同樣表達，結果可見GUS活性(圖19)。其中所述StMEKDD用于使已知存在于上述抗性基因的下游、控制各種防御反應的水楊酸誘導的蛋白激酶(SIPK)和創傷誘導的蛋白激酶(WIPK)磷酸化并激活。而在接種了作為對照使用的農桿菌的葉組織中未見GUS染色，其中所述對照農桿菌含不具插入片段的雙元載體。
在日齊素合成中起重要作用的HMG-CoA還原酶(HMGR)基因形成多基因家族(圖1)。已知HMG1應答創傷，作用于類固醇配糖生物堿的生成；而HMG2和HMG3受病害信號誘導，作用于日齊素的合成(參照文獻9)。有報道指出馬鈴薯植物的PVS基因也同樣形成多基因家族，存在PVS1-4的成員(參照文獻53)。本研究中，為了研究馬鈴薯塊莖組織和葉組織中PVS1-4各成員的表達情況，使用各成員特異性引物進行了RT-PCR。晚疫病菌的親和性和非親和性小種接種的馬鈴薯塊莖片中提取總RNA，以此為模板進行RT-PCR(圖3)。接種任意小種都檢測出相應于PVS1-4各成員的預計大小的條帶。這些結果顯示至少在塊莖組織中，PVS的成員對于應答刺激的代謝變化可能沒有不同的作用。
為了研究PVS mRNA的蓄積情況是否反映到馬鈴薯塊莖組織的PVS蛋白質合成中，制備了抗馬鈴薯PVS抗體，進行Western印跡分析(圖4)。通過接種非親和性小種和親和性小種，在接種后6小時至24小時期間可見PVS蛋白的蓄積。有報道使用由馬鈴薯塊莖組織提取的總RNA進行Nortern印跡分析，結果在非親和性小種和親和性小種接種區，PVSmRNA在接種后6-9小時出現瞬時蓄積的峰(圖2、文獻53)。考慮到PVSmRNA的蓄積情況，可以認為PVS蛋白質的半衰期長。另外，有報道接種了非親和性小種和親和性小種的馬鈴薯塊莖組織中制備可溶性組分中的PVS酶活性均有所增加(參照文獻54)。但也有報道只有接種非親和性小種，植物抗毒素才蓄積，上述報告與該報道矛盾(參照文獻40)。可以認為馬鈴薯的植物抗毒素的生物合成中，由3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)生物合成3-羥-3-甲戊醛酸的酶HMGR和由法尼基二磷酸生物合成vetispiradiene的PVS兩種蛋白質發揮著重要的作用(參照文獻29、54和9)(圖1)。有報道指出HMGR活性只在非親和性小種接種區顯著增加，在親和性小種接種區隨時間減少(參照文獻52)。考慮到HMGR的活性情況，可認為馬鈴薯品種-晚疫病菌小種之間的特異性植物抗毒素的合成控制的關鍵在于3-羥-3-甲戊醛酸的供應。為了驗證該可能性，有必要對接種了親和性小種的塊莖組織，通過由外部供給法尼基二磷酸，研究植物抗毒素lubimin和日齊素是否蓄積。
馬鈴薯晚疫病菌的實際第一感染組織是葉組織。本研究中，為了研究接種晚疫病菌后PVS1-4各成員是否表達，在接種親和性、非親和性小種以及水處理后，在不同的時間從葉組織中提取總RNA，以此為模板進行了RT-PCR(圖5)。在親和性、非親和性小種接種區，都可見只有PVS3被顯著誘導。已知通常在馬鈴薯葉組織中日齊素不蓄積(參照文獻34)。但是，有觀察例顯示日齊素在葉組織中也瞬時合成(參照文獻26)。葉組織中，日齊素在防御應答中的作用至今尚未明確，但接種親和性小種后PVS3被誘導，由此可以利用本啟動子制成抗病害作物。因此，為了獲得PVS3啟動子序列，分離了基因組克隆。篩選得到了PVS1、PVS3和PVS4(圖6、7、8、9)。將本次分離的PVS3基因組克隆與已經分離出的PVS3cDNA相比較，全部與推定氨基酸序列一致。外顯子區的限制酶位點一致，各自對應(圖8)。
煙草和辣椒的植物抗毒素——辣椒二醇、以及天仙子和馬鈴薯所生成的日齊素兩者均通過類似的合成途徑合成(參照文獻4和29)(圖1)。與前者的合成有關的倍半萜環化酶5-表-馬兜鈴堿合酶(EAS)，煙草(TEAS)和辣椒(PEAS)的EAS在氨基酸水平上極其類似(參照文獻35)。Back和Chappell使用TEAS和天仙子的HVS cDNA構建了各種嵌合基因，由嵌合基因在大腸桿菌內合成了蛋白質(參照文獻4)。在菌體可溶組分中加入EAS和AS的底物法尼基二磷酸，通過對5-表-馬兜鈴堿或vetispiradiene的生成比例進行定量，即可推定控制兩種酶的活性的區。根據他們的研究報告，對通過各外顯子定義的活性域的推定氨基酸序列進行了比較，vetispiradiene專一性域中，天仙子的HVS與PVS4或PVS3之間可見90％或以上的同一性。存在底物結合位點的馬兜鈴堿專一性域中，PVS與TEAS或PEAS之間的同一性為78％-89％，而PVS與HVS之間可見98％或以上的高的同一性(圖9)。該結果支持了Back和Chappell提出的假說(參照文獻4)。PVS1和PVS4含有被五個內含子分隔的六個外顯子，而在葉組織中表達的PVS3或其它的倍半萜環化酶含有被六個內含子分隔的七個外顯子(圖9)。宮田(1984)推斷在線粒體基因組高效復制中不具有功能的內含子在進化過程中被除去，DNA縮短。根據該假說，在塊莖中表達的PVS1和PVS4的第5內含子可能在進化過程中被除去，縮短。
如果利用啟動子制備抗病害植物，則必須進行PVS3啟動子區的分析、鑒定。本實施例中，使GUS基因連接到PVS3的推定啟動子下游，制備轉基因馬鈴薯植物，由此對本啟動子的應答性進行了詳細的研究。值得關注的是本啟動子不僅不對創傷應答(圖12)，在生長點或根等部位也未見染色(圖14)。同樣在煙草植物的倍半萜環化酶TEAS的啟動子下游連接GUS，制備轉基因煙草植物，其表達情況已有報道(參照文獻51)。但他們報告了對創傷的低水平應答，并且在根或莖中可見GUS活性。根據該報告，可以認為馬鈴薯葉組織中的PVS3啟動子與煙草葉組織中的TEAS啟動子的應答方式不同。煙草葉中，對病原菌的攻擊或對引發物處理應答，植物抗毒素辣椒二醇高濃度蓄積。而馬鈴薯葉組織中未見日齊素的蓄積，PVS3 mRNA蓄積只是可由RT-PCR檢測出這樣的低水平程度(圖5)。考慮到該結果，PVS3啟動子的特異應答性可能是緣于低的表達水平。
最近，有報道指出HMGR基因表達受促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的一種——SIPK的控制(參照文獻33)。本研究中，使組成型活性突變酶StMEKDD(參照文獻50)同樣地表達，結果可見GUS活性(圖19)。其中所述StMEKDD使SIPK和WIPK磷酸化并被激活。并且經由農桿菌，使番茄葉霉病菌的特異性引發物Avr9和番茄品種的抗性基因產物Cf-9在葉組織中瞬時表達，此時可以GUS染色(圖19)。Romeis等人報道用Avr9處理轉化了Cf-9的煙草植物和培養細胞，則SIPK和WIPK被激活(參照文獻35)。可由這些結果推斷PVS3啟動子也與HMGR基因同樣，受SIPK控制。用HWC或花生四烯酸處理馬鈴薯塊莖組織，則相當于SIPK的MAP激酶被激活，這也支持了上述推測(參照文獻20)。該推斷的信息轉導途徑如圖20所示。
MAPK級聯是植物信號轉導途徑中重要的控制因子之一，近年受到人們的關注(文獻65)。其中，已經清楚SIPK和WIPK在植物的病害抗性表達中發揮著重要的作用(文獻57)。已知位于MAPK級聯的上游的MAPKKK通過使MAPKK磷酸化并激活，并且MAPKK使MAPK磷酸化，引發各種防御反應。最近，使煙草的一種本塞姆氏煙草(Nicotianabenthamiana)中的MAPKK——StMEK1的組成型活性形式突變酶StMEK1DD過量表達，則顯示SIPK和WIPK被激活，煙草植物的倍半萜環化酶——5-表-馬兜鈴堿合酶(TEAS)被誘導(文獻64)。可以容易地預想到與煙草植物同樣，馬鈴薯的PVS基因調控也與MAPK級聯相關。以下的實施例中，采用病毒誘導的基因沉默(VIGS)的方法，對其可能性進行了探討。近年來，VIGS作為在分析植物基因功能方面有效的基因敲除方法而受到人們的關注(文獻59)。VIGS原本是針對病毒的生物體防御系統，是與病毒內的基因同源性高的寄主基因的轉錄產物被特異性分解的現象。通常，與導入病毒內的植物基因片段顯示80％或以上的同源性的mRNA被分解，不僅是1個基因，對敲除多基因家族的基因也有效。該方法與制備轉化體或突變體相比簡便且迅速。其中，作為回顧性遺傳學功能分析方法，目前對于馬鈴薯X病毒(PVX)和本塞姆氏煙草體系已經積累了很多的研究成果(文獻67、文獻70)。這里，由VIGS敲除SIPK或WIPK，通過農桿菌將上述的PVS3GUS瞬時導入葉組織，以此研究PVS3啟動子活性。
以下的實施例9-12中所使用的生物學材料、試劑、實驗方法等如下。沒有特別說明，材料等與上述實施例中所使用的相同。
1.供試植物使用由日本煙草株式會社提供的本塞姆氏煙草作為供試植物。將本塞姆氏煙草種子播種于裝有Kureha土壤(吳羽化學)的聚乙烯花盆，在25℃的恒溫室中、24小時照明條件下使其生長。使用播種第30-35天時植物體的第6-8片葉進行經由農桿菌的瞬時表達測定。
2.INF1的制備對本塞姆氏煙草進行處理的Infestin(INF1)使用在大腸桿菌(大腸桿菌菌株pBF53)中表達的融合蛋白，其中所述大腸桿菌中導入了含有inf1基因的FLAG-ATS載體(FLAG-INF1)(文獻62)。融合蛋白的制備如下進行。
將大腸桿菌在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中、在37℃振蕩(140rpm)培養過夜。將大腸桿菌培養液加入到100倍量，即含有50ppm氨芐青霉素的LB液體培養基中，在37℃振蕩(140rpm)培養，直至OD600＝0.6。添加IPTG，使終濃度為1mM，誘導蛋白質的表達，再在37℃振蕩培養3小時(140rpm)，然后將培養液離心(5,000×g、10分鐘)。上清用過濾器過濾，轉移至透析管(排阻限分子量為3,500)，在4℃用滅菌蒸餾水透析24小時。將以上操作得到的組分調節為蛋白質濃度10mg/ml，制成FLAG-INF1溶液。對植物進行處理時，使用用蒸餾水稀釋為3倍的INF1溶液。
3.插入有連接GUS基因的PVS3啟動子的雙元載體的構建MUG測定所使用的表達載體如下構建。以PVS3基因組克隆為模板，使用附加有限制酶切位點(EcoRI或ClaI)的引物(圖24)，通過PCR擴增含有推定啟動子區和PVS3基因編碼區起始位點的堿基序列。PCR如下進行使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)，以55℃的退火溫度，根據所附說明進行反應。將該PCR產物用EcoRI和ClaI消化，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分級，然后用QIAquick Gel提取試劑盒(qiagen)純化目標DNA片段，作為插入片段使用。載體使用含有GUS基因的pGreen 0229(Hellens等。2000)，其中所述GUS基因含有內含子。與插入片段同樣地用EcoRI和ClaI消化，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分級。用QIAquick Gel提取試劑盒純化目標DNA片段，做為載體使用。將如上所述制備的載體和插入片段調整為載體插入片段摩爾比為1∶3，用DNA連接試劑盒ver.2(Takara)連接，用連接好的質粒DNA轉化E.coli JM109感受態細胞(Takara)，然后接種于LB瓊脂培養基上[1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、1％NaCl、50μg/ml卡那霉素、1％瓊脂糖]，在37℃下培養過夜。挑取單一菌落在含有卡那霉素溶液(50μg/ml)的2ml LB液體培養基[1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、1％NaCl、1％瓊脂糖]上、在37℃下培養過夜。回收質粒DNA。圖25表示插入了PVS3啟動子的雙元載體的圖譜。
4.用于在本塞姆氏煙草葉中瞬時表達測定的缺失克隆的構建以上述3.中制備的GUS表達載體為模板，使用由目標缺失點開始的、附加有限制酶切位點(EcoRI或ClaI)的引物(圖24)，通過PCR擴增含有推定啟動子區和PVS3基因編碼區起始位點的堿基序列。PCR如下進行使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)，以55℃的退火溫度，根據所附說明進行反應。雙元載體的制備按照上述3.的操作進行，按照6.所述的方法導入農桿菌。確認所得缺失克隆的堿基序列沒有錯誤。
5.StMEK1DD表達載體的構建本塞姆氏煙草葉MUG測定所使用的表達載體如下構建。使用附加有限制酶切位點(ApaI或SpeI)的引物(5’-TTGGGCCCATGCGACCTCTTCAACCACC-3’SEQ ID NO.36，5’-GACTAGTACAAAAGAGTGTGGAATTAC-3’SEQ ID NO.37)，通過PCR擴增5’一側含有非翻譯區的StMEK1DD(文獻64)的堿基序列。PCR反應如下進行使用KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)，以55℃的退火溫度，根據所附說明進行反應。將該PCR產物用ApaI和SpeI消化，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分級，然后用QIAquick Gel提取試劑盒(qiagen)純化目標DNA片段，作為插入片段使用。載體使用由β-雌二醇誘導轉基因的表達的pER8(文獻74)，與插入片段同樣地用ApaI和ApeI消化，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分級。用QIAquick Gel提取試劑盒純化目標DNA片段，做為載體使用。以后按照上述3.的連接操作進行。
6.轉化農桿菌將要導入的載體用TE調節為10ng/μl，用于轉化農桿菌。將80μl農桿菌GV3101菌株的感受態細胞在冰上溶解，加入2μl載體溶液，用移液管混合，在冰上靜置30分鐘。將該溶液移入杯中，通過Micro PulserTM(BioRad)實施電穿孔(V＝1.44kV、T＝2.5kV/電阻、C＝all out、R＝R5 129)，進行轉化。將溶液轉移至1.5ml Eppendorf管中，加入1ml SOC培養基[2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、0.05％NaCl、10mM MgCl2、10mMMgSO4]，在室溫下靜置1小時。然后接種于LB瓊脂培養基[1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉、1％NaCl、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平、1％瓊脂糖]，在28℃培養兩天。回收單一菌落，用于下述7.的土壤桿菌浸潤(Agroinfiltration)試驗。
7.使用本塞姆氏煙草通過土壤桿菌浸潤法轉基因根據Thoma等人(2000)的方法(文獻41)，如下進行土壤桿菌浸潤試驗。將導入有雙元載體的農桿菌在含有規定抗生物質的LB液體培養基中、在28℃振蕩培養2天。將2ml培養液懸浮于8ml含有抗生物質的LB液體培養基中，再在28℃振蕩培養3小時。使用紫外可見光分析系統(DU系列600、Beckman)測定懸浮液中農桿菌的密度，測定600nm波長下的吸光度。將懸浮液在室溫下離心(3,000×g、15分鐘)，將沉淀再懸浮于含有150μM acetonitocilingon、10mM MgCl2的10mM MES(pH5.6)中，使OD600＝0.5。
將保有PVS:GUSint的農桿菌單獨進行土壤桿菌浸潤試驗時，將OD600＝0.5的懸浮液注入葉中，一天后注入10μg/ml的INF1溶液，誘導PVS3啟動子(圖26)。另一方面，將用pER8載體對保有XVE:StMEK1DD或PVS:GUSint的農桿菌進行土壤桿菌浸潤試驗時，分別稀釋為OD600＝0.005和OD600＝0.25，通過20μM的β-雌二醇誘導在G10-90啟動子的下游連接的XVE(LexA、VP16、雌激素受體)系統，使StMEK1DD表達(文獻74)。在對照區使用pER8載體代替XVE:StMEK1DD，注入20μM的β-雌二醇(圖26)。
將懸浮液在室溫(20℃)靜置1小時，然后使用沒有注射針的注射筒注入到本塞姆氏煙草葉的細胞間隙。注入后，將植物體在25℃、24小時照明的條件下靜置，用于下述9.的MUG(4-甲基傘形酮β-D-葡萄糖醛酸苷)測定。
8.本塞姆氏煙草中病毒誘導的基因沉默已知植物所感染的病毒的堿基序列包含與植物的基因同源的序列，則植物內發生基因沉默(病毒誘導的基因沉默；VIGS)(文獻67)。本實施例中采用了基因沉默穩定發生的PVX和本塞姆氏煙草系。含有PVX的雙元載體pGR106中插入有由SIPK翻譯起始密碼子開始的230bp的cDNA片段、由WIPK翻譯起始密碼子開始的178bp的cDNA片段、或者使SIPK和WIPK串聯連接的cDNA片段，將由此得到的基因沉默載體導入農桿菌。按照上述7.的方法培養農桿菌，注入播種后生長3周的本塞姆氏煙草葉中，生長1個月，取上部葉用于試驗(圖27)。
9.MUG測定按照Gallagher(1992)的方法(文獻60)，為了對GUS表達定量而進行MUG(4-甲基傘形酮β-D-葡萄糖醛酸苷)測定。將3片注入了農桿菌的1平方厘米的本塞姆氏煙草葉在液氮中磨碎，然后加入200μl提取緩沖液[50mM NaHPO4(pH7.0)、10mM β-巰基乙醇、10mM EDTA、0.1％月桂酰肌氨酸鈉、0.1％Triton X-100]，離心(12,000rpm、4℃、5分鐘)回收上清。根據上述13.的蛋白質定量方法測定提取液的蛋白質濃度，將10μl提取液加入到90μl、37℃的熒光測定緩沖液中[提取緩沖液、2mMMUG]，將反應液制成100μl，在37℃靜置1小時。將反應液加入到900μl的反應終止液(0.2M Na2CO3)中用于測定。使用熒光分光光度計RF-5300PC(Shimadzu)，用365nm的激發光，測定455nm的發射光譜。校正曲線使用4-MU(7-羥基-4-甲基香豆素)制作，測定值換算為4-MUnM/分鐘·mg蛋白。為了從測定值中去掉內源GUS活性，，準備使酶熱變性的樣品，由此得到換算值的差，從而計算來自表達載體的GUS活性。
10.由本塞姆氏煙草葉中提取總RNA由本塞姆氏煙草葉中提取總RNA，可以依據SDS/苯酚法，按以下的方法進行。將1g本塞姆氏煙草葉在乳缽中邊加入液氮邊磨碎，將其加入到已裝有5ml提取緩沖液(EB)[50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM氯化鈉、5mM EDTA、5％SDS]、0.4ml PCI[苯酚/氯仿/異戊醇(50∶49∶1，v/v/v)、10μl巰基乙醇的50ml容量滅菌離心管中，劇烈混合1分鐘，加入4.8ml PCI，輕緩攪拌。使用polytron勻漿器(HG30、日立)磨碎2分鐘，然后離心(1,300×g、15分鐘)。將水層(上層)移入新的50ml容量滅菌離心管中，加入6ml PCI，攪拌2分鐘，然后再在常溫下離心(1,300×g、15分鐘)。向水層(上層)中加入1/40量的4M氯化鈉和2倍量的乙醇，混合，在-20℃靜置2小時或以上，然后離心(1,300×g、15分鐘)。向所得沉淀中加入2ml再懸浮緩沖液(RB)[50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.5％SDS]，輕緩振蕩15分鐘，懸浮。向懸浮液中加入0.2ml 4M氯化鈉和4ml乙醇，在-20℃靜置2小時或以上，然后離心(1,300×g、15分鐘)。用1ml 70％冷乙醇洗滌所得沉淀，然后懸浮于1ml TE緩沖液[10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA]，移入Eppendorf管中，加入250μl10M氯化鋰，在冰上靜置1小時。將懸浮液在4℃離心(22,000×g、15分鐘)，RNA作為沉淀回收。將該鋰沉淀操作重復兩次，將所得沉淀懸浮于300μl TE緩沖液，加入100μl氯仿/異戊醇(24∶1；v/v)，劇烈攪拌后，在4℃離心(22,000×g、15分鐘)。向水層(上層)中加入1/10量的3M乙酸鈉(pH5.2)和2倍量的乙醇，在-20℃靜置2小時或以上，然后離心(22,000×g、5分鐘)。用70％冷乙醇洗滌所得沉淀，風干10分鐘，懸浮于40μl TE緩沖液，制成總RNA。以此作為RNA樣品，在-80℃保存。
11.Nortern印跡分析用甲醛瓊脂糖凝膠電泳將總RNA分級(文獻37)，通過堿印跡法(參照文獻68)轉印并固定在Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上。
將吸附有RNA的尼龍膜在42℃的預雜交溶液[50％甲酰胺、5×Denhardt溶液(文獻37)、5×SSPE(文獻37)、0.5％SDS、100μg/ml熱變性鮭精DNA(Pharmacia)]中放置1小時或以上，然后添加32P標記DNA探針，在42℃下雜交16小時或以上。將該膜在含有0.1％SDS的4×SSPE中、在室溫下洗滌15分鐘(2次)，再在含有0.1％SDS的4×SSP E中、在60℃下洗滌15分鐘，再在含有0.1％SDS的2×SSPE中、在60℃下洗滌15分鐘(1次)。使用X射線膠片OMAT-AR(Kodak)和增感紙Lighting Plus(Dupont)，在-80℃下進行放射自顯影。
12.探針的制備以摻入煙草的TEAS cDNA的質粒pTEAS(Facchini和Chappel，1992)為模板，使用引物(5’-GTCGACGACACAGCCACGTACGAGGT-3’SEQID NO.38、5’-ATCGATAGACTTTCTCCGGATGAGTG-3’SEQ IDNO.39)，通過PCR擴增TEAS cDNA片段。反應如下進行使用2ng摻入TaKaRa TaqTM(寶酒造)和插入片段DNA的質粒，用DNA熱循環儀(PJ 2000、Perkin Elmer Cetus)在94℃-1分鐘(熱變性)、53℃-45秒(退火)、72℃-2分鐘(DNA延伸反應)，25個循環的條件下進行反應。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認擴增的DNA片段的大小。使用QIAquick Gel提取試劑盒(QIAGEN)從凝膠中純化DNA片段。根據隨機引物法(文獻17)，使用[α-32P]dCTP(111TBq/mmol、ICN Biochemicals)和Megaprime DNALabelling systems(Amersham)制備32P標記DNA探針。
<實施例9>通過土壤農桿菌浸潤法導入的PVS3啟動子缺失克隆對INF1的應答來自晚疫病菌的引發物蛋白INF1是對本塞姆氏煙草有效的引發物(文獻63)。將含有內含子的GUS基因框內連接到PVS3啟動子的下游，形成雙元載體，將該雙元載體通過土壤桿菌浸潤法導入本塞姆氏煙草葉中，由此研究INF1誘導的GUS活性(圖27)。在導入幾乎插入了PVS3啟動子全長的雙元載體pPVS3-1時，與水處理對照區相比，可觀察到顯著的GUS活性(圖28)。為了研究應答INF1的PVS3啟動子的順式序列，制備缺失克隆，構建雙元載體，研究GUS活性。結果在-1337(pPVS3-2SEQ ID NO.22)保持了INF1應答性，但如果缺失至-1287(pPVS3-3)之前，則INF1對GUS活性的誘導顯著降低。該結果顯示PVS3啟動子的順式序列與pPVS3-2和pPVS3-3之間的50bp(SEQ ID NO.23)有關(圖29)。
<實施例10>StMEK1DD對PVS3啟動子的誘導StMEK1DD是由于MAPKK的氨基酸取代而產生的組成型活性突變體，通過土壤農桿菌浸潤法導入本塞姆氏煙草葉中，可誘導SIPK和WIPK(文獻64)。為了研究PVS3啟動子區針對INF1處理的應答區與針對StMEK1DD的應答區是否相同，將含有內含子的GUS基因與PVS3啟動子連接，形成雙元載體，將該雙元載體通過土壤農桿菌浸潤法導入本塞姆氏煙草中。同時使該煙草用經雙元載體轉化的農桿菌共感染，所述雙元載體具有連接到由β-雌二醇誘導的XVE的下游連接的StMEK1DD。注入β-雌二醇后(B)，再靜置一天，使StMEK1DD表達以研究GUS活性(圖27)。結果與對照區相比，缺失至-1337(pPVS3-2SEQ ID NO.22)注入β-雌二醇后(B)誘導GUS活性(圖30)。而如果PVS3啟動子缺失至-1287(pPVS3-3)之前，則β-雌二醇處理對GUS活性的誘導顯著降低。該結果顯示pPVS3-2和pPVS3-3之間的50bp(SEQ ID NO.23)與應答StMEK1DD的順式序列有關，其與針對INF1的順式序列相同(圖29)。
<實施例11>SIPK和WIPK沉默對于StMEK1DD誘導的PVS3啟動子活性的影響通過土壤農桿菌浸潤法將pPVS3-1導入使SIPK、WIPK單獨或SIPK和WIPK雙方基因沉默的本塞姆氏煙草，進行GUS活性的研究。此時，將連接在XVE下游的StMEK1DD通過土壤農桿菌浸潤法共感染該本塞姆氏煙草，感染1天后注入β-雌二醇，再靜置一天，使StMEK1DD表達(圖31)。與接種PVX的對照植物比較，在分別使SIPK、WIPK沉默的植物體中，并未觀察到GUS活性的顯著降低(圖32)。而在使SIPK、WIPK雙方沉默的植物體中，可觀察到GUS活性的顯著降低。
<實施例12>SIPK和WIPK沉默對于StMEK1DD誘導的TEAS表達的影響為了研究煙草的倍半萜環化酶TEAS的控制機理，通過土壤農桿菌浸潤法將含有與35S啟動子連接的StMEK1DD的表達載體導入使SIPK和WIPK沉默的本塞姆氏煙草，在不同時間提取總RNA。使用TEAScDNA作為探針進行Nortern印跡分析時，在使SIPK和WIPK兩者均沉默的區，TEAS mRNA的蓄積得到顯著抑制(圖32)。該結果顯示SIPK和WIPK對于PVS3啟動子的活性的作用相同。
如以上實施例所示，為了研究對于PVS3基因表達重要的啟動子區，將PVS3啟動子連接到GUS基因的上游，構建缺失克隆，實施INF1處理，測定GUS活性(圖28)。缺失pPVS3-2(SEQ ID NO.22)中，可見INF1處理使活性顯著增加，但缺失pPVS3-3中未見活性增加(圖28)。已知基因的轉錄是由于因刺激而產生的轉錄因子蛋白與啟動子區中的順式序列結合而被誘導的。可以認為缺失pPVS3-2和pPVS3-3之間存在與轉錄因子結合的順式序列。目前該50bp的區(SEQ ID NO.23)中還未發現已知的調控元件(圖29)。
有報道顯示煙草的MAPK即SIPK控制在倍半萜烯植物抗毒素合成中發揮重要作用的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的表達(文獻73)。已知MAPK級聯在植物的信號轉導途徑中擔負著重要的控制功能，在其下游激活各種防御反應(文獻71)。最近有報道顯示將StMEK1DD連接到35S啟動子的下游，構建表達載體，將該表達載體通過土壤農桿菌浸潤法導入本塞姆氏煙草，則TEAS在轉錄水平被誘導(文獻64)。為了研究PVS3啟動子針對INF1處理的應答區與針對StMEK1DD的應答區是否相同，通過土壤農桿菌浸潤法使缺失克隆和StMEK1DD在本塞姆氏煙草葉中共表達，以此研究GUS活性。與INF1的情況相同。缺失pPVS3-2中，可見StMEK1DD使活性顯著增加，但缺失PVS3-3中未見活性顯著增加(圖30)。Zhang等人(1998)報道用隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)生產的隱地蛋白激發素或寄生疫霉(P.parasitica)生產的parasiticein激發素處理煙草培養細胞，則SIPK和WIPK被激活(文獻72)。結合本試驗結果考慮，則顯示MAPK級聯與晚疫病菌生產的INF1激發素的信號轉導誘導PVS3的過程可能有關。為了研究該可能性，通過土壤農桿菌浸潤法將含有PVS3啟動子的雙元載體導入使SIPK、WIPK或SIPK和WIPK雙方沉默的本塞姆氏煙草葉中，用INF1激發素處理，研究GUS活性(圖32)。與接種PVX的對照植物比較，在使SIPK或WIPK沉默的植物體中，僅僅看到GUS活性的降低。而在使SIPK和WIPK雙方沉默的植物體中，可觀察到GUS活性的顯著降低。這些結果顯示內源性倍半萜環化酶TEAS也可能受SIPK和WIPK的控制。因此，使StMEK1DD基因在使SIPK和WIPK沉默的本塞姆氏煙草中表達時，只在SIPK和WIPK雙方沉默的區中，TEAS mRNA的蓄積受到顯著抑制(圖32)。
Samuel和Ellis(2002)報告將煙草植物置于高濃度臭氧環境中，則SIPK和WIPK被激活，誘導了伴隨著活性氧生成的細胞死亡(文獻69)。他們發現將由于RNAi(RNA干擾)使SIPK沉默的轉基因植物置于臭氧中，則WIPK活性顯著增高，誘導細胞死亡。結合該報告，可以認為SIPK和WIPK以彼此互補的形式控制下游的PVS3基因的表達本發明并不受上述發明的實施方式和實施例說明的任何限制。只要不脫離權利要求的范圍，本領域技術人員可容易想到的范圍內的各種變化方案也包含在本發明中。
序列表<110>NAGOYA INDUSTRIAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTEYOSHIOKA，Hirofumi<120>病原菌應答性啟動子<130>P0206402<150>JP P2002-351701<151>2002-12-03<150>JP P2003-294409<151>2003-08-18<160>39<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2648<212>DNA<213>馬鈴薯<220>
<221>misc_feature<222>(246)..(246)<223>n代表任意堿基<220>
<221>misc_feature<222>(278)..(278)<223>n代表任意堿基<400>1ctcttctgtt gatgtgctat agtcttttat atagcgctct attcatgttg taatttggcc 60tctactttaa tttttttcaa cctaaaccaa cgtacaataa tgtgtaatga tactaatttg120actcacataa tagcatggtg ctagaagagt cacttgaaag agtatactga agagtattaa180aaatataatt ctaaagaatt tcgaagattc aattataatt gatcaagaag gtgataagag240
ccttcnacaa caacgtaaag tttgggtagc ctctatanat gactatgaaa atagccaaaa300aaaaattcaa attcgaattc ttgtaatcct tatttaggat tattgcgacc atcacttgtg360ggtgccttac ttgactaaat atttgattaa acattaattt ttggtcagtg gatatacatg420ccactcaatt ttaaataaat tagtgatccc ttacgatctt aaaaaaattg tatttttgtg480tgtaatgtca actttggttc aaatgtctaa tataataagt attaattcca acagtattag540aattttattt ctaagatcac tcttacggtc ttaccactga aagattaaaa ttctaaccaa600gaatttgaac tttaaatagt acttatgaat tttacttgcc gtttgaattt tatgtacatg660cttagaataa ttaggtcctc atgtagtcaa ctttaagaaa attacaatgt tacgttctaa720caagaacaaa tttgactcta gatttttaat tttttttttt taaaaaaaaa ctaaatactc780atccgattca atttgtttga aactatgttc caattattaa tccgtttcaa aaacaatgtt840acattcagat atttaaaatc aattaactta aatttctcat catcagtaag aagttttaat900aatcacatga aggaaagcct gtttggagaa agttatgcgt aaaatattgc atatatctct960tccattgaat tagttacatc tggatttgca taaaatcaac atttagtaaa atacgatggc 1020ttagatgatt gaactttgaa caggaaaaat aagcgtgcaa ataagccatc aatcttgaac 1080tttagaaata tatatatata attcaataag ttactttatt ggaatagcta tagtgacggc 1140ggatttagaa ttttcattaa agggactcta aaaaaatata gtgcctaaga tttgaacttg 1200aaactcaaga tgccactaaa caacctctaa tcttacattc agaaggttca aaatcaatat 1260atatagacat aattttttaa atttttttta acctccctcg actacctcta ggtccgccct 1320tactattccc atccgatctc ttgggaagcg ggggagaaaa ttttataata gtgcactcat 1380gctataatta catactaaga ttttatgtaa tgctatattt tttcaagttg aagacggaaa 1440caatagcatt ggatcaagac agacgccatt gaaggaagaa aaaacctaaa aaaataaaca 1500aaaggagaga cactttcttg gtcccttcga ggccatatat cccattaata taaaaatata 1560
aaacaaaaaa aaagacagac ggtcgcccaa ggaaagaagg cggacgtcac taacggctaa 1620ccctaactac aaataatgta attttccaaa aacggaacta taaggaataa aaaacatgaa 1680gattattgag tattattaat ttttaaaaga cagacgccac tcgaggaaat aaggaatcac 1740aaggagtaaa gaaagaaatt aaaggcacgt tacagtatca tataatataa atttaagttt 1800ggttgcattg aagttatata gtttttaaaa aaaaataaaa ttgtccaaca atacttgtcc 1860aatttagaaa atctaaaaga taatttatta ttttgtgttt gttttacctc aacatctaat 1920acatttctca aattattaaa tttaatatat tcaaaaggta atatagtaat attactctta 1980ttatttattt attgtttctt aagatttgtg caggtcaata ataaataact atcgttgaat 2040taagggagta ccatcaaaga aattgattta taacacgatg cgggtggagg gagctagaaa 2100gttagtacaa atttggttgc actaagtact tcatccgtct caatttatga gattttgttt 2160gattcgagac gaaatttaat aaagatgatt tttttaaagt tgtaatctaa aacaagtcat 2220aaatatttgc atcactataa taatctcatt aaatgtaaat gaatattttt agctaaatta 2280ttactactcc ctccatgtcc atattagttg atcatcttac tatatattaa ctgtccacct 2340tactcaatta ataaaatatt aattaaagtt tttctatact agatataaaa atgttattat 2400tatttttgat aaagactaga aagagtatac tatttgtata tctacagtgg gacgaccagt 2460taagtatatt gtagtcaaag taaggcaacc ggatggactg catgcagcac aaaggctctc 2520accactataa atactcaata ttccttctct ttcatttcca tcaacacctt caccaactaa 2580caaattaaaa gaaagaaaaa aaaatctctc agtttcctca caagctaatt agacccgttt 2640ccgaagaa2648<210>2<211>2000<212>DNA<213>馬鈴薯
<400>2tttatgtaca tgcttagaat aattaggtcc tcatgtagtc aactttaaga aaattacaat 60gttacgttct aacaagaaca aatttgactc tagattttta attttttttt tttaaaaaaa120aactaaatac tcatccgatt caatttgttt gaaactatgt tccaattatt aatccgtttc180aaaaacaatg ttacattcag atatttaaaa tcaattaact taaatttctc atcatcagta240agaagtttta ataatcacat gaaggaaagc ctgtttggag aaagttatgc gtaaaatatt300gcatatatct cttccattga attagttaca tctggatttg cataaaatca acatttagta360aaatacgatg gcttagatga ttgaactttg aacaggaaaa ataagcgtgc aaataagcca420tcaatcttga actttagaaa tatatatata taattcaata agttacttta ttggaatagc480tatagtgacg gcggatttag aattttcatt aaagggactc taaaaaaata tagtgcctaa540gatttgaact tgaaactcaa gatgccacta aacaacctct aatcttacat tcagaaggtt600caaaatcaat atatatagac ataatttttt aaattttttt taacctccct cgactacctc660taggtccgcc cttactattc ccatccgatc tcttgggaag cgggggagaa aattttataa720tagtgcactc atgctataat tacatactaa gattttatgt aatgctatat tttttcaagt780tgaagacgga aacaatagca ttggatcaag acagacgcca ttgaaggaag aaaaaaccta840aaaaaataaa caaaaggaga gacactttct tggtcccttc gaggccatat atcccattaa900tataaaaata taaaacaaaa aaaaagacag acggtcgccc aaggaaagaa ggcggacgtc960actaacggct aaccctaact acaaataatg taattttcca aaaacggaac tataaggaat 1020aaaaaacatg aagattattg agtattatta atttttaaaa gacagacgcc actcgaggaa 1080ataaggaatc acaaggagta aagaaagaaa ttaaaggcac gttacagtat catataatat 1140aaatttaagt ttggttgcat tgaagttata tagtttttaa aaaaaaataa aattgtccaa 1200caatacttgt ccaatttaga aaatctaaaa gataatttat tattttgtgt ttgttttacc 1260
tcaacatcta atacatttct caaattatta aatttaatat attcaaaagg taatatagta 1320atattactct tattatttat ttattgtttc ttaagatttg tgcaggtcaa taataaataa 1380ctatcgttga attaagggag taccatcaaa gaaattgatt tataacacga tgcgggtgga 1440gggagctaga aagttagtac aaatttggtt gcactaagta cttcatccgt ctcaatttat 1500gagattttgt ttgattcgag acgaaattta ataaagatga tttttttaaa gttgtaatct 1560aaaacaagtc ataaatattt gcatcactat aataatctca ttaaatgtaa atgaatattt 1620ttagctaaat tattactact ccctccatgt ccatattagt tgatcatctt actatatatt 1680aactgtccac cttactcaat taataaaata ttaattaaag tttttctata ctagatataa 1740aaatgttatt attatttttg ataaagacta gaaagagtat actatttgta tatctacagt 1800gggacgacca gttaagtata ttgtagtcaa agtaaggcaa ccggatggac tgcatgcagc 1860acaaaggctc tcaccactat aaatactcaa tattccttct ctttcatttc catcaacacc 1920ttcaccaact aacaaattaa aagaaagaaa aaaaaatctc tcagtttcct cacaagctaa 1980ttagacccgt ttccgaagaa 2000<210>3<211>1500<212>DNA<213>馬鈴薯<400>3aattttcatt aaagggactc taaaaaaata tagtgcctaa gatttgaact tgaaactcaa 60gatgccacta aacaacctct aatcttacat tcagaaggtt caaaatcaat atatatagac120ataatttttt aaattttttt taacctccct cgactacctc taggtccgcc cttactattc180ccatccgatc tcttgggaag cgggggagaa aattttataa tagtgcactc atgctataat240tacatactaa gattttatgt aatgctatat tttttcaagt tgaagacgga aacaatagca300ttggatcaag acagacgcca ttgaaggaag aaaaaaccta aaaaaataaa caaaaggaga360
gacactttct tggtcccttc gaggccatat atcccattaa tataaaaata taaaacaaaa420aaaaagacag acggtcgccc aaggaaagaa ggcggacgtc actaacggct aaccctaact480acaaataatg taattttcca aaaacggaac tataaggaat aaaaaacatg aagattattg540agtattatta atttttaaaa gacagacgcc actcgaggaa ataaggaatc acaaggagta600aagaaagaaa ttaaaggcac gttacagtat catataatat aaatttaagt ttggttgcat660tgaagttata tagtttttaa aaaaaaataa aattgtccaa caatacttgt ccaatttaga720aaatctaaaa gataatttat tattttgtgt ttgttttacc tcaacatcta atacatttct780caaattatta aatttaatat attcaaaagg taatatagta atattactct tattatttat840ttattgtttc ttaagatttg tgcaggtcaa taataaataa ctatcgttga attaagggag900taccatcaaa gaaattgatt tataacacga tgcgggtgga gggagctaga aagttagtac960aaatttggtt gcactaagta cttcatccgt ctcaatttat gagattttgt ttgattcgag 1020acgaaattta ataaagatga tttttttaaa gttgtaatct aaaacaagtc ataaatattt 1080gcatcactat aataatctca ttaaatgtaa atgaatattt ttagctaaat tattactact 1140ccctccatgt ccatattagt tgatcatctt actatatatt aactgtccac cttactcaat 1200taataaaata ttaattaaag tttttctata ctagatataa aaatgttatt attatttttg 1260ataaagacta gaaagagtat actatttgta tatctacagt gggacgacca gttaagtata 1320ttgtagtcaa agtaaggcaa ccggatggac tgcatgcagc acaaaggctc tcaccactat 1380aaatactcaa tattccttct ctttcatttc catcaacacc ttcaccaact aacaaattaa 1440aagaaagaaa aaaaaatctc tcagtttcct cacaagctaa ttagacccgt ttccgaagaa 1500<210>4<211>1000<212>DNA<213>馬鈴薯
<400>4aaaacggaac tataaggaat aaaaaacatg aagattattg agtattatta atttttaaaa 60gacagacgcc actcgaggaa ataaggaatc acaaggagta aagaaagaaa ttaaaggcac120gttacagtat catataatat aaatttaagt ttggttgcat tgaagttata tagtttttaa180aaaaaaataa aattgtccaa caatacttgt ccaatttaga aaatctaaaa gataatttat240tattttgtgt ttgttttacc tcaacatcta atacatttct caaattatta aatttaatat300attcaaaagg taatatagta atattactct tattatttat ttattgtttc ttaagatttg360tgcaggtcaa taataaataa ctatcgttga attaagggag taccatcaaa gaaattgatt420tataacacga tgcgggtgga gggagctaga aagttagtac aaatttggtt gcactaagta480cttcatccgt ctcaatttat gagattttgt ttgattcgag acgaaattta ataaagatga540tttttttaaa gttgtaatct aaaacaagtc ataaatattt gcatcactat aataatctca600ttaaatgtaa atgaatattt ttagctaaat tattactact ccctccatgt ccatattagt660tgatcatctt actatatatt aactgtccac cttactcaat taataaaata ttaattaaag720tttttctata ctagatataa aaatgttatt attatttttg ataaagacta gaaagagtat780actatttgta tatctacagt gggacgacca gttaagtata ttgtagtcaa agtaaggcaa840ccggatggac tgcatgcagc acaaaggctc tcaccactat aaatactcaa tattccttct900ctttcatttc catcaacacc ttcaccaact aacaaattaa aagaaagaaa aaaaaatctc960tcagtttcct cacaagctaa ttagacccgt ttccgaagaa 1000<210>5<211>1125<212>DNA<213>馬鈴薯<400>5atgcgacctc ttcaaccacc cccaccagct gccaactcca cctcctccgc cgccgcatca 60
tccatgcctc ctccctcttc cgccggacaa cgcagtcgtc cccggcgtcg tactgatttg120acccttcctc ttcctcaacg tgacgttgct cttgctgttc ctctccccct tcctccaacc180tccgctcctt cctcttcctc atcctcatct tcctccccgc ttcctacccc tttacatttc240tctgagctcg agagggttaa tcgcatcggt agtggcaccg gaggtactgt ttacaaggtt300ctacatcgtc ccactggcag actctatgct ttgaaagtta tctatggtaa ccatgaggat360tctgtccgtc tccagatgtg ccgtgagatc gagattctcc gagatgtaga caaccctaac420gtcgttaggt gtcacgatat gttcgatcac aacggcgaaa tccaagttct tcttgagttc480atggataaag gctctctcga agggatccat atccctctcg aacaacctct ctccgatcta540actcgacagg ttctctccgg cctctactac ctccacaggc gtaagattgt tcacagagat600atcaaacctt ctaacctctt aatcaactcc aggcgtgagg tcaagattgc agattttggg660gtctccagag ttctcgcaca aactatggat ccttgcaatt cctccgtggg taccatcgct720tacatgagtc ccgagagaat caacacagat ctgaatcacg gacagtacga cggatatgct780ggggacatat ggagtcttgg ggtgagcatc ttagagttct acttgggaag gttccccttc840tctgtgggga gacaaggaga ctgggccagc cttatgtgcg ccatttgtat gtcgcagcct900cctgaggcac cacccactgc ttccagggag tttagggagt tcattgcctg ctgtttgcag960agggatcctg ctaggcggtg gacggccgcg cagctcttgc gccatccctt catcacccag 1020aatagcccag gcacccacac cggtcctgct actacctcat tgagtaatca ggcacatcaa 1080ttgttacctc cacctcctca tttttcttct tcttcttctt cttga 1125<210>6<211>374<212>PRT<213>馬鈴薯<400>6
Met Arg Pro Leu Gln Pro Pro Pro Pro Ala Ala Asn Ser Thr Ser Ser1 5 10 15Ala Ala Ala Ser Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ala Gly Gln Arg Ser20 25 30Arg Pro Arg Arg Arg Thr Asp Leu Thr Leu Pro Leu Pro Gln Arg Asp35 40 45Val Ala Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Thr Ser Ala Pro Ser50 55 60Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Pro Thr Pro Leu His Phe65 70 75 80Ser Glu Leu Glu Arg Val Asn Arg Ile Gly Ser Gly Thr Gly Gly Thr85 90 95Val Tyr Lys Val Leu His Arg Pro Thr Gly Arg Leu Tyr Ala Leu Lys100 105 110Val Ile Tyr Gly Asn His Glu Asp Ser Val Arg Leu Gln Met Cys Arg115 120 125Glu Ile Glu Ile Leu Arg Asp Val Asp Asn Pro Asn Val Val Arg Cys130 135 140His Asp Met Phe Asp His Asn Gly Glu Ile Gln Val Leu Leu Glu Phe145 150 155 160Met Asp Lys Gly Ser Leu Glu Gly Ile His Ile Pro Leu Glu Gln Pro165 170 175
Leu Ser Asp Leu Thr Arg Gln Val Leu Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu His180 185 190Arg Arg Lys Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile195 200 205Asn Ser Arg Arg Glu Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val Ser Arg Val210 215 220Leu Ala Gln Thr Met Asp Pro Cys Asn Ser Ser Val Gly Thr Ile Ala225 230 235 240Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn His Gly Gln Tyr245 250 255Asp Gly Tyr Ala Gly Asp Ile Trp Ser Leu Gly Val Ser Ile Leu Glu260 265 270Phe Tyr Leu Gly Arg Phe Pro Phe Ser Val Gly Arg Gln Gly Asp Trp275 280 285Ala Ser Leu Met Cys Ala Ile Cys Met Ser Gln Pro Pro Glu Ala Pro290 295 300Pro Thr Ala Ser Arg Glu Phe Arg Glu Phe Ile Ala Cys Cys Leu Gln305 310 315 320Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp Thr Ala Ala Gln Leu Leu Arg His Pro325 330 335Phe Ile Thr Gln Asn Ser Pro Gly Thr His Thr Gly Pro Ala Thr Thr340 345 350
Ser Leu Ser Asn Gln Ala His Gln Leu Leu Pro Pro Pro Pro His Phe355 360 365Ser Ser Ser Ser Ser Ser370<210>7<211>1125<212>DNA<213>人工的<220>
<223>突變的MEK基因<400>7atgcgacctc ttcaaccacc cccaccagct gccaactcca cctcctccgc cgccgcatca 60tccatgcctc ctccctcttc cgccggacaa cgcagtcgtc cccggcgtcg tactgatttg120acccttcctc ttcctcaacg tgacgttgct cttgctgttc ctctccccct tcctccaacc180tccgctcctt cctcttcctc atcctcatct tcctccccgc ttcctacccc tttacatttc240tctgagctcg agagggttaa tcgcatcggt agtggcaccg gaggtactgt ttacaaggtt300ctacatcgtc ccactggcag actctatgct ttgaaagtta tctatggtaa ccatgaggat360tctgtccgtc tccagatgtg ccgtgagatc gagattctcc gagatgtaga caaccctaac420gtcgttaggt gtcacgatat gttcgatcac aacggcgaaa tccaagttct tcttgagttc480atggataaag gctctctcga agggatccat atccctctcg aacaacctct ctccgatcta540actcgacagg ttctctccgg cctctactac ctccacaggc gtaagattgt tcacagagat600atcaaacctt ctaacctctt aatcaactcc aggcgtgagg tcaagattgc agattttggg660gtctccagag ttctcgcaca agatatggat ccttgcaatg actccgtggg taccatcgct720tacatgagtc ccgagagaat caacacagat ctgaatcacg gacagtacga cggatatgct780
ggggacatat ggagtcttgg ggtgagcatc ttagagttct acttgggaag gttccccttc840tctgtgggga gacaaggaga ctgggccagc cttatgtgcg ccatttgtat gtcgcagcct900cctgaggcac cacccactgc ttccagggag tttagggagt tcattgcctg ctgtttgcag960agggatcctg ctaggcggtg gacggccgcg cagctcttgc gccatccctt catcacccag 1020aatagcccag gcacccacac cggtcctgct actacctcat tgagtaatca ggcacatcaa 1080ttgttacctc cacctcctca tttttcttct tcttcttctt cttga 1125<210>8<211>374<212>PRT<213>人工的<220>
<223>突變的MEK<400>8Met Arg Pro Leu Gln Pro Pro Pro Pro Ala Ala Asn Ser Thr Ser Ser1 5 10 15Ala Ala Ala Ser Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ala Gly Gln Arg Ser20 25 30Arg Pro Arg Arg Arg Thr Asp Leu Thr Leu Pro Leu Pro Gln Arg Asp35 40 45Val Ala Leu Ala Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Thr Ser Ala Pro Ser50 55 60Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Pro Thr Pro Leu His Phe65 70 75 80Ser Glu Leu Glu Arg ValAsn Arg Ile Gly Ser Gly Thr Gly Gly Thr
85 90 95Val Tyr Lys Val Leu His Arg Pro Thr Gly Arg Leu Tyr Ala Leu Lys100 105 110Val Ile Tyr Gly Asn His Glu Asp Ser Val Arg Leu Gln Met Cys Arg115 120 125Glu Ile Glu Ile Leu Arg Asp Val Asp Asn Pro Asn Val Val Arg Cys130 135 140His Asp Met Phe Asp His Asn Gly Glu Ile Gln Val Leu Leu Glu Phe145 150 155 160Met Asp Lys Gly Ser Leu Glu Gly Ile His Ile Pro Leu Glu Gln Pro165 170 175Leu Ser Asp Leu Thr Arg Gln Val Leu Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu His180 185 190Arg Arg Lys Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile195 200 205Asn Ser Arg Arg Glu Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val Ser Arg Val210 215 220Leu Ala Gln Asp Met Asp Pro Cys Asn Asp Ser Val Gly Thr Ile Ala225 230 235 240Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Asn Thr Asp Leu Asn His Gly Gln Tyr245 250 255Asp Gly Tyr Ala Gly Asp Ile Trp Ser Leu Gly Val Ser Ile Leu Glu
260 265 270Phe Tyr Leu Gly Arg Phe Pro Phe Ser Val Gly Arg Gln Gly Asp Trp275 280 285Ala Ser Leu Met Cys Ala Ile Cys Met Ser Gln Pro Pro Glu Ala Pro290 295 300Pro Thr Ala Ser Arg Glu Phe Arg Glu Phe Ile Ala Cys Cys Leu Gln305 310 315 320Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp Thr Ala Ala Gln Leu Leu Arg His Pro325 330 335Phe Ile Thr Gln Asn Ser Pro Gly Thr His Thr Gly Pro Ala Thr Thr340 345 350Ser Leu Ser Asn Gln Ala His Gln Leu Leu Pro Pro Pro Pro His Phe355 360 365Ser Ser Ser Ser Ser Ser370<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>9aggagat tgt tcgccccata 20<210>10
<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>10tctccatgag tccttacatg 20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>11catcgattgt tttgtacatc tg 22<210>12<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>12aataatgata caaaaaaaaa ttaagg 26<210>13<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>13
tatcaattca ccaaggaaca ct22<210>14<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>14gaagtaatta aatttaaata ttatcaa 27<210>15<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>15ttgtctgctg ctgcttgtgg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>16tctccatgag tccttacatg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>17aggacattgt tcgacctgtt20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>18tctccatgag tccttacatg20<210>19<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>19catcccttaa aattataagt attc 24<210>20<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的引物<400>20aataatgata caaaataaat taagg 25<210>21
<211>2231<212>DNA<213>馬鈴薯<400>21atggccctag ctatcccctt taacaatgaa gaggagattg ttcgccctgt tgccaatttc 60tctccaagtc tttggggtga tcgtttccat tcattctctc tcgacaatca ggtaattact120taattaatta ctaattaaat ccttctctat cgcttatatt tggttaatta ctactaatcc180caatcatgaa cattttacag gttgctgaaa agtatgctca agagattgaa actttgaagg240aacaaacaag gagtttgttg tctgctgctg cttgtggaat aacattggct gagaaattga300atctgataga cattgttgag cgccttggct tagcttatca ttttgagaaa caaatagatg360atatgttgga tcaaatttac aaagcagatc ccaactttga cgctcatgat ttaaacactt420tatcccttca atttcgaata ttaagacaac atggttacaa tatctcccaa agtaggtcca480tcatttaaaa caattcacca aaataatacg tttttttctg catgaaaact aattatcttt540tgcttttatt cgatcatgat ccagaatttt tcagcagatt ccaagatgcg aatggcaagt600tcaaggaatg tcttagcaac gacatcaggg gtctattgaa cttatacgaa gcttcacatg660taaggactca tggagaagat attttagaag aggcacttgt tttctccact gctcatcttg720agtctgcagc tccacatttg gagtcacctc tgagtaagca agtgactcat gcccttgagc780agtctctcca taagagcatt ccaagagtcg agacgcgcta cttcatctcc atctacgaag840aggaggaatt taagaatgat gtgttgcttc gatttgccaa attggattac aacttactcc900agatgttgca caaacacgaa cttagtgaag tatcaaggta tacagatgtg ttaagttgaa960ttaaaaatac tagtataaat tatttgttga tagtaatttc taagattggt acttattttg 1020taggtggtgg aaagatttgg attttgtgac aacgcttcca tatgctaggg atagagcagt 1080ggaatgttac ttttggacga tgggagtgta tgctgaacct caatactctc aggctcgtgt 1140catccttgca aagactatag caatgatttc gatagtagat gacacattcg atgcttatgg 1200
aatagtaaaa gaacttgagg tctacaccga tgccatacaa aggtatggac ttgcctctcc 1260aacagttcat ggatttatta gacgggaaac ttactaaatc tctttctgtt ttattaggtg 1320ggatattagt caaattgatc gactcccaga atacatgaaa gttagtttta aggctctttt 1380ggatctctat gaagattatg aaaaggagtt gtcaaaggat ggcagatccg atgttgtcca 1440ctacgcaaaa gaaagagtag gactcactga tttctattta aaaacacttg tatttacctt 1500atactatttc tttattatac aattagatct gttatgggag tattgatggt tgaatgtctt 1560gtggtttctg ttaaacagat gaaggagatt gtgagaaact attttgtaga agcaaagtgg 1620ttcattgagg gatatatgcc gcctgtttct gagtatctta gcaatgcatt agctaccagc 1680acatattact tgctaactac aacatcctat ttgggagtga agtcagcaac aaaggaagat 1740tttgaatggt tggctacgaa ccctaaaatt cttgaagcca atgtgacatt atgccgagtt 1800gttgatgaca tagcaacgta tgaggtaatt agcatcgcat tacactacat aaatcatctt 1860ataatttaga gttacagtaa tttaatacaa attgatttca catacttata aatgaattat 1920aattgccatt ccaggttgag aagggtaggg gccaaatcgc aacaggaatt gagtgttata 1980tgagggatta tgacgtatca acagaagtag caatggaaaa attccaagag atggctgaga 2040tagcatggaa ggatgtaaat gaaggaattc ttcgaccaac acctgtctct acagaaattc 2100ttactcgcat tctcaatctt gctcgtatta tagatgtcac ttacaagcac aatcaagatg 2160gatacactca tcccgaaaaa gttctaaaac ctcacatcat tgctttactg gtggactcca 2220ttgagatcta a2231<210>22<211>1337<212>DNA<213>馬鈴薯<400>22
gtccgccctt actattccca tccgatctct tgggaagcgg gggagaaaat tttataatag 60tgcactcatg ctataattac atactaagat tttatgtaat gctatatttt ttcaagttga120agacggaaac aatagcattg gatcaagaca gacgccattg aaggaagaaa aaacctaaaa180aaataaacaa aaggagagac actttcttgg tcccttcgag gccatatatc ccattaatat240aaaaatataa aacaaaaaaa aagacagacg gtcgcccaag gaaagaaggc ggacgtcact300aacggctaac cctaactaca aataatgtaa ttttccaaaa acggaactat aaggaataaa360aaacatgaag attattgagt attattaatt tttaaaagac agacgccact cgaggaaata420aggaatcaca aggagtaaag aaagaaatta aaggcacgtt acagtatcat ataatataaa480tttaagtttg gttgcattga agttatatag tttttaaaaa aaaataaaat tgtccaacaa540tacttgtcca atttagaaaa tctaaaagat aatttattat tttgtgtttg ttttacctca600acatctaata catttctcaa attattaaat ttaatatatt caaaaggtaa tatagtaata660ttactcttat tatttattta ttgtttctta agatttgtgc aggtcaataa taaataacta720tcgttgaatt aagggagtac catcaaagaa attgatttat aacacgatgc gggtggaggg780agctagaaag ttagtacaaa tttggttgca ctaagtactt catccgtctc aatttatgag840attttgtttg attcgagacg aaatttaata aagatgattt ttttaaagtt gtaatctaaa900acaagtcata aatatttgca tcactataat aatctcatta aatgtaaatg aatattttta960gctaaattat tactactccc tccatgtcca tattagttga tcatcttact atatattaac 1020tgtccacctt actcaattaa taaaatatta attaaagttt ttctatacta gatataaaaa 1080tgttattatt atttttgata aagactagaa agagtatact atttgtatat ctacagtggg 1140acgaccagtt aagtatattg tagtcaaagt aaggcaaccg gatggactgc atgcagcaca 1200aaggctctca ccactataaa tactcaatat tccttctctt tcatttccat caacaccttc 1260accaactaac aaattaaaag aaagaaaaaa aaatctctca gtttcctcac aagctaatta 1320
gacccgtttc cgaagaa1337<210>23<211>50<212>DNA<213>馬鈴薯<400>23gtccgccctt actattccca tccgatctct tgggaagcgg gggagaaaat50<210>24<211>1287<212>DNA<213>馬鈴薯<400>24tttataatag tgcactcatg ctataattac atactaagat tttatgtaat gctatatttt 60ttcaagttga agacggaaac aatagcattg gatcaagaca gacgccattg aaggaagaaa120aaacctaaaa aaataaacaa aaggagagac actttcttgg tcccttcgag gccatatatc180ccattaatat aaaaatataa aacaaaaaaa aagacagacg gtcgcccaag gaaagaaggc240ggacgtcact aacggctaac cctaactaca aataatgtaa ttttccaaaa acggaactat300aaggaataaa aaacatgaag attattgagt attattaatt tttaaaagac agacgccact360cgaggaaata aggaatcaca aggagtaaag aaagaaatta aaggcacgtt acagtatcat420ataatataaa tttaagtttg gttgcattga agttatatag tttttaaaaa aaaataaaat480tgtccaacaa tacttgtcca atttagaaaa tctaaaagat aatttattat tttgtgtttg540ttttacctca acatctaata catttctcaa attattaaat ttaatatatt caaaaggtaa600tatagtaata ttactcttat tatttattta ttgtttctta agatttgtgc aggtcaataa660taaataacta tcgttgaatt aagggagtac catcaaagaa attgatttat aacacgatgc720gggtggaggg agctagaaag ttagtacaaa tttggttgca ctaagtactt catccgtctc780
aatttatgag attttgtttg attcgagacg aaatttaata aagatgattt ttttaaagtt840gtaatctaaa acaagtcata aatatttgca tcactataat aatctcatta aatgtaaatg900aatattttta gctaaattat tactactccc tccatgtcca tattagttga tcatcttact960atatattaac tgtccacctt actcaattaa taaaatatta attaaagttt ttctatacta 1020gatataaaaa tgttattatt atttttgata aagactagaa agagtatact atttgtatat 1080ctacagtggg acgaccagtt aagtatattg tagtcaaagt aaggcaaccg gatggactgc 1140atgcagcaca aaggctctca ccactataaa tactcaatat tccttctctt tcatttccat 1200caacaccttc accaactaac aaattaaaag aaagaaaaaa aaatctctca gtttcctcac 1260aagctaatta gacccgtttc cgaagaa 1287<210>25<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>25cggaattctt gtaatcctta tttaggatta 30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>26cggaattcgt ccgcccttac tattcccatc 30<210>27
<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>27cggaattctt tataatagtg cactcatgct30<210>28<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>28cggaattcgc tatatttttt caagttgaag 30<210>29<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>29cggaattcga cgccattgaa ggaagaaaaa 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>30
cggaattcac tttcttggtc ccttcgaggc30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>31cggaattcaa caaaaaaaaa gacagacggt30<210>32<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>32cggaattcgt tatatagttt ttaaaaaaaa30<210>33<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>33cggaattcga tttataacac gatgcgggtg30<210>34<211>30<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>34cggaattctt actatatatt aactgtccac30<210>35<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>35ccatcgattc ctcttcattg ttaaagggga30<210>36<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>36ttgggcccat gcgacctctt caaccacc 28<210>37<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>37gactagtaca aaagagtgtg gaattac27<210>38
<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>38gtcgacgaca cagccacgta cgaggt 26<210>39<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>39atcgatagac tttctccgga tgagtg 2權利要求
1.病原菌應答性啟動子，該啟動子含有以下(a)-(c)中任意一項的DNA(a)含有SEQ ID NO.1所示堿基序列的DNA；(b)含有在SEQ ID NO.1所示堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(c)在嚴謹條件下與(a)或(b)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
2.病原菌應答性啟動子，該啟動子含有以下(A)-(C)中任意一項的DNA(A)含有SEQ ID NO.2所示堿基序列的DNA；(B)含有在SEQ ID NO.2所示堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(C)在嚴謹條件下與(A)或(B)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
3.病原菌應答性啟動子，該啟動子含有以下(1)-(3)中任意一項的DNA(1)含有SEQ ID NO.1所示堿基序列內連續的一部分，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(2)含有在(1)的DNA中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。(3)在嚴謹條件下與(1)或(2)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
4.病原菌應答性啟動子，該啟動子含有以下(i)-(iii)中任意一項的DNA(i)含有SEQ ID NO.22所示堿基序列的DNA；(ii)含有在SEQ ID NO.22所示的堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA；(iii)在嚴謹條件下與(i)或(ii)的DNA雜交，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能的DNA。
5.病原菌應答性啟動子，該啟動子含有以下(I)-(III)中任意一項的DNA，在植物細胞內發揮病原菌應答性啟動子功能(I)含有SEQ ID NO.23所示堿基序列的DNA；(II)含有在SEQ ID NO.23所示的堿基序列中有1或多個堿基取代、缺失、插入或添加的堿基序列的DNA；(III)在嚴謹條件下與(I)或(II)的DNA雜交的DNA。
6.如權利要求5所述的病原菌應答性啟動子，其特征在于對病原菌感染有特異性應答。
7.DNA，該DNA含有SEQ ID NO.23所示堿基序列。
8.DNA，該DNA含有SEQ ID NO.23所示堿基序列中連續10個或以上的堿基序列，具有病原菌應答性啟動子活性。
9.載體，該載體包含權利要求5的病原菌應答性啟動子。
10.載體，該載體包含權利要求8的DNA。
11.DNA構建體，該DNA構建體包括權利要求5的啟動子；與該啟動子相連并受其控制的、在植物體內表達并激活該植物的防御應答的基因。
12.DNA構建體，該DNA構建體包括權利要求8的DNA；與該DNA協同作用構成病原菌應答性啟動子的DNA；與所構建的病原菌應答性啟動子相連并受其控制的、在植物體內表達并激活該植物的防御應答的基因。
13.權利要求11的DNA構建體，其中上述基因具有其表達產物激活控制植物的防御應答的信息轉導途徑的功能。
14.權利要求11的DNA構建體，其中上述基因具有其表達產物激活SIPK或WIPK的功能。
15.權利要求11的DNA構建體，其中上述基因是編碼組成型活性形式MEK的基因。
16.轉化體，該轉化體是用權利要求11的DNA構建體轉化宿主植物而得到的。
17.權利要求16的轉化體，其中上述宿主植物是茄科植物。
18.權利要求16的轉化體，其中上述宿主植物是馬鈴薯屬的植物。
19.轉基因植物的制備方法，包括用權利要求11的DNA構建體轉化宿主植物的步驟。
20.賦予宿主植物病原菌抗性的方法，包括用權利要求11的DNA構建體轉化宿主植物的步驟。
21.植物，該植物外源導入了權利要求5的病原菌應答性啟動子。
22.植物，該植物外源導入了權利要求8的DNA。
全文摘要
本發明提供對于病原菌感染特異性應答的啟動子(病原菌應答性啟動子)。公開了含有由馬鈴薯植物的PVS3啟動子區(SEQ ID NO.1)形成的DNA的病原菌應答性啟動子。還公開了對于啟動子活性重要的區(SEQ IDNO.23)。
文檔編號C12N15/82GK1745171SQ20038010929
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月1日 優先權日2002年12月3日
發明者吉岡博文 申請人:財團法人名古屋產業科學研究所