調節基因的組合物和系統的制作方法

專利名稱：：調節基因的組合物和系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學、基因調控、基因治療和轉基因生物領域。更具體說，本發明涉及通過外部的RNA干擾系統來調控基因表達的方法。相關技術說明RNA干擾(RNAi)是RNA多核苷酸通過內源性細胞加工特異性阻抑其序列對應于該RNA的基因表達的一種現象(Brummelkamp等，2002；Gevroe和Silver，2002；Barton和Medzhitov，2002；Xia等，reviewedinSharp，2001)。該現象廣泛傳播并看來是進化上保守的(Barton和Medzhitov，2002；Sui等，2002)。許多研究現已證明RNAi存在于許多生物中是一種天然發生的細胞活動(Sharp，2001)。所述RNAi通路還不完全了解。然而在許多系統中，小的干擾性RNA分子(siRNA)看來在體內是通過RNA酶III內切核酸酶消化而產生的。這種消化吸收產生了長約21-23個核苷酸(堿基)的分子，雖然分子的大小可大至30個堿基。然后這些相對較短的RNA介導了對應的RNA信使和轉錄物降解(Sui等，2002；Sharp，2001)。理論上稱為RNA-誘導的沉默復合體(RISC)的RNAi核酸酶復合體，可通過堿基配對相互反應幫助小的dsRNA識別互補的mRNA。siRNA與其底物反應后，mRNA靶向RISC中也許是通過RISC中存在的酶而被降解(Montgomery等，1998)。這些通路認為是生物體用來阻抑病毒感染、轉座子跳躍和類似現象和調控內源基因表達的(Hutvagner等，2001；Sharp，2001；Waterhouse等，2001；Zamore，2000)。雖然dsRNA阻抑基因表達的完全機制尚不清楚，但研究經驗表明RNAi在大多數生物中是有效和重要的。RNAi的普遍存在促進了將這種天然的基因調控系統開發轉變為操縱基因表達工具的方法和組合物。利用RNAi操縱基因表達的一個最吸引人方面包括它的靶特異性。RNAi對介導該現象的RNA多核苷酸序列是特異的。因此可將設計的與能阻抑其表達的基因(靶基因)序列充分對應的RNA多核苷酸序列導入細胞中。存在此設計恰當的RNA時，激活了RNAi通路，導致對靶基因的阻抑或調節。然而，利用RNAi作為工具來操縱基因表達需要在細胞中導入siRNA或表達。目前在細胞中導入siRNA調節靶基因表達的方法包括將siRNA(或前體RNA)直接注射或灌注入細胞、用游離載體(如質粒、腺病毒等)轉染細胞和將表達siRNA的表達盒永久性導入細胞基因組內。直接給予哺乳動物細胞siRNA或前體RNA的一個主要障礙是內源性抗病毒反應，該反應能識別長30個核苷酸(nt)以上的RNA聚核苷酸，并在它們能有效誘導表達的RNAi調節前降解它們。Elbashir等(2001)描述了以下發現，即長21個堿基的雙鏈RNA能有效逃避這種抗病毒反應，因而可用于特異性調節哺乳動物細胞中的基因表達。關于抗病毒反應的另一種方法是將siRNA表達盒加入載體中，然后轉染入細胞來轉錄適當的誘導RNA類別的RNAi(見Sui等，2002；Xia等，2002；Barton和Medzhitov，2002)。可用的載體包括質粒(Brummelkamp等，2002；Sui等，2002)和病毒衍生的載體(見例如Xia等，2002；Barton和Medzhitov，2002；Devroe和Silver，2002)。已證明這些目前已知的系統在特異性調節外源和內源性基因時是有效的(見例如Sui等，2002；Xia等，2002)。病毒載體的另一優點是它們能使sIRNA表達構建物穩定整合到細胞基因組中，得以產生特定基因受特異性阻抑的細胞系。另外，某些病毒載體可用于體內轉化細胞，從而可直接操縱體內和整個生物的基因表達。就穩定轉染細胞和生物表達特定siRNA構建物而言，一個挑戰是避免這些構建物提供的siRNA產物異源組成型表達引起的細胞或生物毒性或活力降低。Tiscornia等(2003)證明了可用慢病毒載體組成型表達整合在各種哺乳動物系統中的siRNA。此研究得以產生能降低特異性基因表達的細胞系，和產生靶基因產物表達減少的敲減(knockdown)小鼠。然而如上所述，siRNA組成型表達的主要障礙在于發育早期時其頻繁發生會導致早期死亡。這就取消了發育期的基因表達操縱而進入生物的成年期。因此，該領域需要通過載體攜帶的siRNA來調節和控制基因表達的系統，而載體中該siRNA分子本身的表達可受到控制。siRNA的受控胞內轉錄有許多應用，包括例如，為研究治療目的，使細胞產生胞內或分泌性內源基因產物，如蛋白質受到控制；產生“條件性敲減”的轉基因動物，如產生人類疾病(如糖尿病、免疫缺陷病等)的臨床前動物模型；或作為治療研究的細胞/器官來源，以及用于農業食品工業中和植物中的類似目的；作為siRNA臨床應用，如抗病毒治療和遺傳方法的安全裝置，目的是控制例如，激素分泌過多所致的疾病。發明概述本發明涉及含有通過控制siRNA的表達來控制基因表達的有用的系統的組合物和方法。本發明提供外部可調控的系統，通過控制RNA干擾來操縱內源或外源基因的調節。該外部可調控系統可通過(改變)條件和組織特異性方式和/或定位方式調節。在具體實施方案中，本發明包括一種外部施加的試劑，如藥物或一種或多種其它化合物，來調節編碼siRNA的核苷酸序列的表達。在具體實施方案中，本發明涉及一種多核苷酸構建物。其含有編碼操作性連接于一外部可調控啟動子的siRNA的區域，該構建物也可定義為一種載體。載體的非限制性例子包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、MLV載體、AAV載體、質粒載體或腺病毒載體。外部可調控啟動子可以是一種阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的試劑下調編碼siRNA的表達。可通過外部施加藥物下調編碼siRNA的表達。在具體實施方案中，該阻抑型啟動子受Tet阻抑物的調節，和/或定義為還含有至少一個tet0序列。該阻抑型啟動子可受lacI阻抑物的調節，或該阻抑型啟動子可來自ANB1、HEM13、ERG11、OLE1、GAL1、GAL10、ADH2或TETR基因。在具體實施方案中，外部可調控的啟動子是一種誘導型啟動子，從而可通過外部施加的試劑上調編碼siRNA的表達。誘導型啟動子可受Cu2+、Zn2+、四環素、四環素類似物、蛻皮激素、糖皮質激素、三苯氧胺或lac操縱子誘導物的誘導。該啟動子可受蛻皮激素、糖皮質激素或三苯氧胺的誘導。在具體實施方案中，該誘導型啟動子是噬菌體誘導型啟動子、營養物誘導型啟動子、溫度誘導型啟動子、輻射誘導型啟動子、金屬誘導型啟動子、激素誘導型啟動子、類固醇誘導型啟動子、或它們的組合。輻射誘導型啟動子的例子包括fos啟動子、jun啟動子或erg啟動子。可用于本發明考慮范圍的基因表達調節系統，包括可利用孕酮、雌激素和/或蛻皮激素的調節系統。在一個優選的實施方案中，該系統包括(a)一多核苷酸構建物，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的多核苷酸的聚合酶III依賴型啟動子；(b)一多核苷酸，其編碼含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域的藥物誘導型阻抑融合蛋白質；和(c)一可結合的多核苷酸，其可被(b)所述融合蛋白的結合域結合并定位，從而轉錄阻抑結構域可發揮作用而阻抑(a)所述多核苷酸構建物的轉錄；(d)一個或多個含有(a)、(b)和(c)所述構建物的載體；和(e)一種化合物，可將其施加于細胞以控制上述融合蛋白的表達，或控制所述融合蛋白通過其結合域與所述可結合的多核苷酸序列結合。在具體實施方案中，編碼所述融合蛋白的多核苷酸與一誘導型啟動子操作性相連。在其它和優選的實施方案中，該啟動子是一種組成型啟動子。在一具體實施方案中，該組成型啟動子是EF-1α啟動子。在其它實施方案中，該啟動子是組織特異性啟動子。本發明的各種多核苷酸和多核苷酸序列可以是一種多核苷酸分子或其一部分，或它們可位于或組成在不同的多核苷酸分子中。不同的多核苷酸和多核苷酸序列，如果位于同一分子中，它們可以是相互毗連、毗鄰、靠近或接近。這些序列的排列使得能轉錄性調節siRNA編碼的多核苷酸，該領域普通技術人員不難構想這種排列。此外，本發明的實施例公開了相關序列的具體空間排列。在本發明具體實施方案中，通過采用含多核苷酸和多肽組分二者的特殊系統產生對表達的控制。在前核和真核細胞中，對DNA上特定位點具有親和力的多肽能調節基因的轉錄性表達。通過與基因中特定位點DNA的相互反應，某些稱為阻抑物的多肽，例如可使該DNA不能接近RNA聚合酶而阻止了轉錄。已廣泛地特征分析了DNA結合蛋白質，以確定這些多肽是否確實能接觸DNA分子，關于阻抑的那些實施例是否通過直接結合機制與其相互反應而影響基因表達。這些多肽的某些非限制性例子包括那些含有結構性基序α-螺旋-轉角-α-螺旋(H-T-H)的多肽。這些蛋白質可作為二聚體或三聚體與具有大致對稱回文序列的特定操縱子序列中的DNA結合。在B-形DNA的主要溝槽二位點中和附近各單體的二個毗鄰α-螺旋發生接觸，是DNA與這些蛋白質之間介面中的主要特征。能以這種方式結合的蛋白質在H-T-H區中具有序列相似性，但在其它區域中相似程度不同。這組蛋白包括，例如噬菌體溫度阻抑型蛋白和Cro蛋白，細菌代謝阻抑蛋白如GalR、LacI、LexA和TrpR，細菌激活劑蛋白CAP和激活劑/抑制劑雙功能蛋白AraC，細菌轉座子和質粒TetR蛋白，酵母菌交配型調節蛋白MATal和MATα2和真核同源框(homeobox)蛋白。其它阻抑物與H-T-H結合蛋白序列同源很少或無，沒有H-T-H結合基序。觀察到此組的某些蛋白質，如沙門傷寒菌噬菌體P22Mnt蛋白質(VERS87a)和大腸桿菌TyrR阻抑蛋白(DEFE86)中，能與含有大致對稱回文序列的操縱子相結合。此組的其它蛋白能結合部分對稱(沙門傷寒菌噬菌體P22Arc蛋白VERS87b；大腸桿菌Fur蛋白DEL087；質粒R6Kpi蛋白質FILU85)或非對稱性(噬菌體Mu阻抑物KRAU86)的操縱子序列。本領域技術人員知道，與野生型相比，本發明所用的阻抑物和/或DNA結合域可包含突變，只要該突變不會有害地影響這些組分的各自功能，本發明的方法和組合物中可采用這些突變的組分。在其它具體實施方案中，上述(e)的化合物可調節該融合蛋白的表達。7在其它具體實施方案中，(e)所述化合物通過該融合蛋白的結合域，可調節該融合蛋白與可結合性多核苷酸序列的結合。在具體的優選實施方案中，該融合蛋白的結合域可結合的多核苷酸序列是四環素操縱子(tet0)序列，(b)所述該融合蛋白含有融合于人Kox-1的典型KRAB阻抑結構域(tTR-KRAB)的四環素阻抑物(tTR)的DNA結合域，(c)的底物是強力霉素。在一具體實施方案中，KRAB不是來自Kox-1而是來自另一個含鋅指蛋白的KRAB結構域。因此，在一實施方案中，采用人Kox-1蛋白的KRAB阻抑結構域作為轉錄阻抑物(Theisen等，1990；Margolin等，1994；Pengue等，1994；Witzgall等，1994)。在另一實施方案中，采用一種KRAB協同阻抑物KAP-1，其中KRAB(Friedman等，1996)用作同一融合蛋白的一部分或分別提供。或者，KAP-1可單獨與鋅指蛋白一起應用。在本發明的內容中，考慮能介導上述元件(a)、(b)和(c)輸送和整合到靶細胞、組織或生物基因組中的任何載體都屬于本發明范圍。在具體實施方案中，(b)所述載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。在具體實施方案中，(b)所述載體是慢病毒載體。在實施方案中，(b)所述載體是慢病毒載體，其它實施方案包括其中含有(b)所述融合蛋白的結合域可結合的多核苷酸序列，和操作性連接有編碼siRNA多核苷酸序列的啟動子的載體，編碼siRNA的多核苷酸序列包含在該慢病毒3’-長末端重復序列的U3區中。該系統的其它實施方案中，編碼該融合蛋白的多核苷酸包含在與含(a)所述構建物的載體不同的第二種載體中。在具體實施方案中，該第二種含有該融合蛋白編碼多核苷酸的載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。在優選實施方案中，含有該融合蛋白編碼多核苷酸的第二載體是慢病毒載體。在具體實施方案中，(a)(i)所述聚合酶III-依賴型啟動子是U6或H1啟動子。在具體實施方案中，(a)(i)所述聚合酶III-依賴型啟動子是U6啟動子。在具體優選實施方案中，(a)所述多核苷酸編碼的siRNA形成一種莖環結構或發夾(即個sihRNA)。然而，特別考慮本發明中除子條件性表達(轉錄或轉錄/翻譯)siRNA分子(敲除分子)外，可采用本文所述方法和組合物來表達任何其它外源性核酸序列(“感興趣的序列”)。因此，可用任何其它感興趣序列來實施本文所述有關siRNA的任何實施方案。另外，認為本發明覆蓋了本文所述各多核苷酸或多核苷酸序列，或與其它多核苷酸或多核苷酸序列的組合。因此，在某些實施方案中，本發明包括本發明系統中所述的任何載體。例如，本發明包括的載體或表達構建物含有編碼藥物可調控(如藥物誘導型)的阻抑事例蛋白，該蛋白含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域，和/或相同或不同的載體或表達構建物含有該融合蛋白結合域可結合及定位的多核苷酸，從而該轉錄阻抑結構域可發揮作用而阻抑感興趣基因的表達。在具體實施方案中，該融合蛋白含有融合于人Kox-1的KRAB阻抑結構域(tTR-KRAB)的四環素阻抑物(tTR)的DNA結合域，其可結合tet0序列。該tet0序列可位于相同或不同的表達構建物或載體上。因此，在某些實施方案中，本發明還涉及操作性連接于一示范性Ttr-KRAB-反應啟動子的多核苷酸。通常該Ttr-KRAB-反應啟動子含有一個操作性連接于至少一個tet操縱子(tet0)序列的最小啟動子。例如，可按照Saeger和Heinemann主編的《Protein-NucleicAcidInteraction》(Macmillan，London，1989，第10卷，143-162頁)一書中Hillen&Wissmann著的“TopicsinMolecular和StructuralBiollogy”中的方法獲得該tet0序列，此文內容納入本文作參考。可用于實施本發明的其它tet0序列也可從Genbank和/或Waters，S.H等(1983)NuclAcidRes.116089-6105；Hillen，W和Schollmeier，K.(1983)NuclAcidRes.11525-539；Stuber，D和Bujard，H.(1981)ProcNatlAAcadSciUSA78167-171；Unger，B等(1984)NuclAcidRes.127693-7703；和Tovar，K等(1988)MolGenGenet.21576-80中所述方法獲得，這些文獻的內容全部納入本文作參考。在某些實施方案中，可采用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的tet操縱子序列的拷貝，采用更多數目的這種序列能增加調節的范圍。除了該示范性Ttr-KRAB-融合蛋白可作為外部藥物誘導型阻抑融合蛋白外，可利用其它含有不同結合域和轉錄阻抑結構域的融合蛋白。在本發明的實施方案中，利用DNA結合域作為藥物誘導型可調控的融合蛋白的一部分，該DNA結合域可包含，例如四環素阻抑物(tTR)的DNA結合域，或GAL4或LexA的此種結構域的序列。在本發明的實施方案中，利用一種阻抑結構域作為外部藥物誘導型調節器性融合蛋白的一部分，該阻抑結構域是Kruppel-相關盒結構域(KRAB)。然而，其它阻抑結構域包括EDR或SID轉錄阻抑結構域。可作為轉錄阻抑物的其它優選的轉錄因子和轉錄因子結構域包括，例如MAD(見Sommer等，1998；Gupta等，1998；Queva等，1998；Larsson等，1997；Laherty等，1997；和Cultraro等，1997)；FKHR(forkheadinehapdosarcomagene；Ginsberg等，1998；Epstein等，1998)；EGR-1(早期生長反應基因產物-1；Yan等，1998；和Liu等，1998)；ets2阻抑因子阻抑結構域(EDR；Sgouras等，1995)；和MADsmSIN3相互作用結構域(SID；Ayer等，1996)。其它實施方案中，可采用上述任何系統和構建物產生細胞和轉基因動物。可以條件性方式控制這些轉基因動物來顯示敲減的表型。在本發明的某些實施方案中，可用本領域技術人員熟知的方法將本發明的核酸導入哺乳動物細胞中。因此，在某些實施方案中，該哺乳動物細胞含有(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的核酸區段的聚合酶III-依賴型啟動子；(b)編碼一條件性阻抑融合蛋白的第二多核苷酸序列，該融合蛋白含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域；和(c)上述(b)中的融合蛋白結合域可結合并定位的第三多核苷酸序列，這樣，此轉錄阻抑結構域可發揮作用而阻抑(a)所述核酸區段的轉錄。在具體實施方案中，該條件性阻抑融合蛋白是藥物誘導型蛋白。此外，在其它實施方案中，所述細胞除(a)、(b)和/或(c)以外，還含有(d)第四多核苷酸序列，該序列可被切除從而阻止聚合酶III-依賴啟動子的轉錄；和/或(e)第五多核苷酸序列，該序列在一可調控啟動子的控制下。此酶和可切除序列將在以下進一步詳述。在本發明的實施方案中，所述哺乳動物細胞含有某些核酸構建物。本發明的一方面，上述融合蛋白結合域可結合的第三多核苷酸序列是四環互操縱子(tet0)序列，(b)所述的融合蛋白含有融合于人Kox-1的KRAB阻抑結構域的四環素阻抑物(tTR-KRAB)的DNA結合域，因而該融合蛋白受強力霉素的控制。該系統也可用于執行除任何siRNA分子外的任何感興趣基因的條件性表達。考慮本發明所用的哺乳動物細胞包括未分化細胞，如卵母細胞或受精的卵母細胞。可采用本領域技術人員已知的技術，用這些細胞來產生轉基因動物。因此在某些實施方案中，本發明包括其細胞為本文所述哺乳動物細胞的能顯示靶基因條件性敲減的轉基因動物。特別考慮可創立與本文所述非限制性示范性Ttr-KRAB系統一起應用的奠基細胞系或動物。因此，本發明包括能表達Ttr-KRAB或任何條件性敲減/表達系統(能條件性表達感興趣的敲減分子或其它基因或蛋白質)的細胞和轉基因動物。在實施方案中，轉基因動物的一個或多個細胞含有編碼條件性阻抑融合蛋白的多取核苷酸序列，該融合蛋白含有四環素阻抑物的DNA結合域和轉錄阻抑結構域及人Kox-1的KRAB阻抑結構域(tTR-KRAB)。tTR-KRAB或其它可調節系統的表達可以是條件性的、可誘導的、組織特異性的或局部可利用的(如施加于局部)。可利用奠基細胞或細胞系，來導入含有在轉錄融合蛋白調節元件(效應器多核苷酸)如tTR-KRAB控制下的感興趣序列的核酸序列。或者可用本領域技術人員已知的方法，包括使奠基轉基因動物與效應器轉基因動物(其細胞含有效應器多核苷酸)交配，或將效應器多核苷酸導入奠基轉基因動物的轉基因細胞中，利用奠基轉基因動物來創立同時含有敲減/表達構建物和該效應器多核苷酸的動物。在其它實施方案中，本發明的轉基因動物具有(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的核酸區段的聚合酶III-依賴型啟動子；(b)編碼一條件性阻抑融合蛋白的第二多核苷酸序列，該融合蛋白含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域；和(c)上述(b)中的融合蛋白結合域可結合并定位的第三多核苷酸序列，這樣，此轉錄阻抑結構域可發揮作用而阻抑(a)所述核酸區段的轉錄。此外，在本發明的某些實施方案中，可利用能控制siRNA轉錄的聚合酶III-啟動子的tTR-KRAB所介導的阻抑，來創立條件性敲減動物。可利用上述構建物來轉染或感染性細胞、干細胞、或任何其它可用于創立轉基因動物的未分化細胞。本發明其它方面涉及一種系統，該系統中存在的可切除核酸片段的酶通過切除介導，進而控制RNA干擾。特別考慮也可以執行所述的關于條件性敲減某基因的實施方案，和其它調節方法來敲減某基因，包括利用組織特異性啟動子和/或利用Cre重組酶。因此，除用某可調控的阻抑融合蛋白控制調節轉基因的表達(如siRNA的表達)水平外，本發明可利用該系統的一種以上調節水平，如用外部藥物調節控制該可調控的阻抑融合蛋白質。因此在本發明的某些實施方案中，存在一種可調節靶細胞中siRNA表達的系統，所述靶細胞含有可受調節(即可調節)的含有表達盒的表達構建物，所述表達盒含編碼siRNA的核酸區段。可將該核酸區段置于啟動子控制下，編碼該siRNA的區段和該啟動子之間有一可切除片段，在該啟動子可能影響該siRNA轉錄前需要切除。適當的酶可利用該片段所含切除位點來切除該片段，因此，該片段是“可切除片段”此外，在某些實施方案中，稱為“轉錄調節物”的其活性可受調節的轉錄因子(“可調節的轉錄調節物”)，可調節此啟動子。該可調節的轉錄調節物是此系統的另一組分，可用編碼它的多核苷酸在系統中提供。本發明的諸組分包括各種核酸分子，包括區段、片段、盒和構建物。這些核酸分子可以是RNA或DNA。然而，外部因子可調節任何或所有這些分子。這些核酸分子可至少、最多、或包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、77、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000個連續核苷酸可堿基對。在某些實施方案中，表達構建物是病毒載體，雖然可以是非病毒載體如質粒。病毒載體可以是一種整合型病毒，如逆轉錄病毒可腺伴隨病毒。在某些實施方案中，該表達構建物是逆轉錄病毒，特別是慢病毒。術語“siRNA表達構建物”指能表達siRNA分子的核酸分子。術語“可調節的siRNA表達構建物”指與給定細胞類型中或所有細胞中的組成型表達相反，siRNA的表達可受到調節。術語“表達構建物”理解為包括該構建物是載體。術語“表達盒”理解為指一種核酸區域，其包括被表達的核酸和參與其表達的控制區，包括但不限于啟動子和增強子。術語“可調控的啟動子區域”指可調控某啟動子區域以修飾或改變該啟動子的表達。表達的修飾可以是正面或負面。表達的負修飾指該啟動子的表達可能被消除、減弱、限制或局限。表達的正修飾指該啟動子的表達可能增加、增強或放大。“啟動子區”指能控制和調節遠端或毗鄰基因、cDNA或其它編碼區轉錄速度的核酸區域。在本發明的某些實施方案中，核酸分子包含一種或多種作為標記的肽的編碼序列。該標記可用于監測可測試核酸或其一部分是否已整合入另一核酸、是否轉染或導入了細胞或生物體，或被切除。考慮本發明的核酸分子、系統和生物可含有1、2、3、4、5或更多種標記多肽，或編碼標記多肽的核酸。如上所述，可利用不同的標記多肽來監測不同事情。除siRNA編碼核酸區段外，本發明涉及含有一個或多個能修飾或調節轉錄的區段或元件的啟動子。調節可以是正面或負面調節。負調節指阻抑、降低或消除啟動子的轉錄。同樣，正調節指促進、增強或誘導含上述元件或區段的啟動子的轉錄。在本發明某些實施方案中，所述啟動子含有的元件可阻抑或誘導該啟動子的轉錄功能。在本發明一具體方面，能在轉錄水平或蛋白水平起調節作用的轉錄調節物可識別該元件。在具體實施方案中，該元件是tet操縱子，其能結合含識別該元件的DNA結合域的轉錄阻抑物。在本發明其它實施方案中，該啟動子是聚合酶III-依賴型啟動子，即其轉錄功能需要聚合酶III。在某些實施方案中，啟動子可控制空間和/或時間性表達。因此考慮本發明所用啟動子是組織特異性或發育特異性(只在特定發育階段或時期啟動轉錄)啟動子，而在其它實施方案中，啟動子是誘導型或組成型啟動子。本發明的多肽可外源性表達。這些多肽可以是天然產生的、野生型、多態性或突變產生的。在本發明具體實施方案中，多肽是融合或嵌合蛋白。嵌合蛋白是含有二種或多種多肽一起或無聯系部分的多肽。多肽的無聯系部分指含有可認為是相同功能或活性的氨基酸區域。融合蛋是嵌合蛋白的一種，此蛋白中第一多肽或其一部分端對端連接于第二多肽或其一部分。在本發明具體實施方案中，有一種嵌合蛋白是可調控的轉錄調節物。某些情況下該可調控的轉錄調節物是一種融合蛋白，其DNA結合域來自一種多肽，其轉錄阻抑或激活結構域來自另一多肽，該可調控的轉錄調節物，例如可通過結合某藥物而受到負面調節或修飾。在其它實施方案中，該可調控的轉錄調節物可受到四環素或四環素類似物，如強力霉素的負調節。“四環素類似物”是與四環素(Tc)密切相關能結合tet阻抑物，其Ka值至少為106M-1的許多化合物的任何一種。優選四環素類似物的結合親和力約為109M-1或更高如109M-1。四環素類似物的例子包括但不限于在R.K.Blackwood等編輯的《實驗性藥物手冊78》(HandbookofExperimentalPharmacology78)(SpringerVerlag，Berlin-NewYork，1985)中Hlavka和Boothe著的“四環素”；L.A.Mitscher“四環素抗生素的化學”，MedicinalResearch9，Dekker，NewYork，1978；NoyeeDevelopmentCorporation，“四環素制備工藝”ChemicalProcessReviewsParkRidge，N.J.，第2卷，1969；R.C.Evans，“四環素的技術學”，BiolchemicalReferenceSeries1，QuadranglePress，NewYork，1986；和H.F.Dowling，“四環素”，AntibiolticsMonographs，no.3，MedicalEncyclopedia，NewYork，1955；中所述的那些，這些文獻各自的內容全納入本文作參考。四環素類似物的非限制性例子包括無水四環素、強力霉素、氯代四環素、環氧四環素等。與Tc相比，某些Tc類似物，如無水四環素和環氧四環素的抗生素活性降低。本領域知道本發明所用的四環素或四環素類似物的濃度，或可用標準方法測定。在具體實施方案中，所用強力霉素的濃度高于約10ng/ml(Gossen等，1995)。術語“轉錄調節物”指具有能直接或間接影響轉錄活性的多肽或蛋白質，這些活性包括但不限于核酸結合活性、轉錄激活活性和/或轉錄阻抑活性。另外，轉錄調節物在本發明某些實施方案中可以是“可調節的”，意指，可以調節，即阻抑、消除、降低、增強、活化或改變其活性。調控也可以是暫時性或范圍有限的。考慮到這種轉錄調節物的活性可受到，例如，一種或多種以下轉錄；翻譯；mRNA半衰期；蛋白的半衰期；翻譯后修飾；定位、核酸或多肽的結合特異性、分解速率或親和力；和/或轉錄活性等變化的調節或修飾。負調節或修飾指降低或消除活性，而正調節或修飾指點提高或誘導活性。例如，轉錄掏物的負調節可導致減少存在的阻抑作用。可調節轉錄調節物的表達。將其表達置于可調節啟動子，如組織特異性或誘導型啟動子的控制下。術語“可誘導的”指只在對特異性刺激的反應中可被激活的活性，與“組成型”活性相反。在本文的啟動子中，術語“可誘導的”指只能在某些條件下促進轉錄的啟動子，不象組成型啟動子。誘導型啟動子可理解為在允許的條件下才表達。術語“組織特異性”指只在特定組織中才存在活性，與普遍存在的啟動子相反。在本發明的某些實施方案中，只是在或部分由于啟動子與待轉錄的核酸區段之間存在物理屏障或障礙才實現這種調節。在某些情況下這種屏障或障礙，例如通過切除形成或構成此屏障或障礙全部或部分的核酸區域才能去除。因此，在某些實施方案中，在啟動子與可轉錄核酸序列之間安置一可切除片段。更具體說，該片段可防止siRNA編碼核酸區域受該可調節啟動子區的控制。一旦被切斷，該siRNA編碼區段就被置于該可調節啟動子區的控制下。“可切除片段”指由于一種或多種酶反應，如涉及Cre的重組酶的酶作用，可被生理去除的核酸區。本發明的一具體方面，該可切除片段至少二個側接的loxP位點，使該片段可被Cre重組酶切除。本領域技術人員熟知此loxP位點序列功能是作為Cre重組酶的識別位點。切除/重組系統的另一個例子是可用于本發明的眾所周知的flt/frt系統。此外，該系統另一種水平的調節可能是酶或多肽表達的調節，這些酶或多肽控制著在啟動子控制下的感興趣核酸序列，即siRNA編碼核酸序列。換句話說，這些酶或多肽是條件性使用的。術語“條件性使用”指所述酶或多肽只在特定條件下可利用。，在某些實施方案中，Cre重組酶-編碼的多核苷酸受組織特異性或誘導型啟動子的控制。然而，本領域技術人員知道，其它方法也可控制表達。本發明其它實施方案包括含有但不限于上述核酸的載體或細胞。特別考慮可將本發明的核酸包含在一表達構建物或載體中。然后可將該表達構建物或載體導入細胞中。在某些情況下，所述細胞含有i)包括siRNA編碼核酸片段和可調控啟動子區的表達盒，ii)編碼可調控轉錄調節物的多核苷酸。在其它實施方案中，所述細胞可含有可條件性利用的Cre酶，此酶能催化切斷位于siRNA編碼核酸片段一可調控啟動子區之間的可切除片段。具體考慮所述細胞是前核細胞或真核細胞、某些情況下是哺乳動物細胞，如狗、貓、牛、羊、豬、馬、鼠類、兔類或豬細胞。人是本發明方法和組合物應用特別要考慮的生物。另外，所述細胞可以是分化細胞，在某些情況下，是未分化細胞，如卵子細胞、受孕卵子細胞或精子細胞。可采用未分化細胞來建立含有本發明可調控系統的動物。本發明另一方面涉及含有編碼可誘導能阻抑整合入宿主細胞中本發明至少一種siRNA表達的誘導型阻抑物的DNA分子的真核宿主細胞；和/或含有其siRNA操作性連接于一內部可調控啟動子(如能對該誘導型阻抑物反應，不論直接或間接反應，的啟動子)的DNA分子的真核宿主細胞。例如，該誘導型阻抑物可直接影響此啟動子附近的序列，從而再影響此啟動子本身的活性。宿主細胞可以是哺乳細胞(如人的細胞)。或者，宿主細胞可以是酵母菌、真菌或昆蟲細胞(如可將誘導型阻抑物或siRNA編碼DNA整合到昆蟲細胞中的桿狀病毒基因內)。同源重組的優選宿主細胞類型是胚胎干細胞，可用它來產生非人動物攜帶體，例如整合入動物染色體中預定位置的tTR-KRAB-編碼序列。宿主細胞也可含有操作性連接于一典型tTR-KRAB反應性轉錄啟動子的siRNA。可將該操作性連接于一典型tTR-KRAB反應性啟動子的siRNA整合入宿主細胞的DNA中，隨機(如導入外源基因)或預定(同源重組時使內源基因靶向)的位置。可將連接于tTR-KRAB反應性啟動子的基因導入宿主細胞中，與編碼siRNA的DNA分開，或者，可利用本發明的“一次命中”靶向載體將tTR-KRAB編碼序列和tTR-KRAB反應性啟動子整合入宿主細胞DNA中的預定位置。可使宿主細胞與四環素或四環素類似物接觸，來阻抑操作性連接于tTR-KRAB反應性啟動子的siRNA在本發明宿主細胞中的表達。因此，本發明還涉及含編碼sIRNA分子的可調節表達盒與編碼可調控轉錄調節物的多核苷酸的轉基因動物。在具體實施方案中，本發明包括能顯示以組織特異性方式條件性敲除靶基因的轉基因動物，該動物的細胞含有i)在一可調控啟動子區控制下的siRNA編碼核酸區段，其中此siRNA對應于靶基因；ii)編碼可調控轉錄調節物的多核苷酸；和iii)可條件性利用的Cre重組酶。然而，特別考慮可以除外本發明的組織特異性方面，或可以除外Cre重組酶水平的控制。因此，在某些實施方案中，動物不含有受組織特異性控制的核酸和/或Cre重組酶及或可切除片段。短語“靶基因的可條件性敲除”指某靶基因的表達可以條件方式消除或基本消除。本發明的其它方面包括本發明轉基因動物的妊娠、及所產生的轉基因動物的性細胞和其它轉基因細胞。本發明的其它方法包括采用上述試劑創立或產生能顯示條件性敲除靶基因的轉基因動物的方法。為此，可將具有條件性調節siRNA表達的第一種轉基因動物與其性別不同的第二種動物交配此外，也可以條件或組織特異性方式調節這類動物(的基因表達)，方法包括a)獲得具有在組織特異性啟動子調控下的Cre重組酶編碼多核苷酸的第一種轉基因動物；b)獲得具有i)在一可調控啟動子區控制下的siRNA編碼核酸區段，其中該sIRNA對應于靶基因；和ii)編碼該可調控多肽調節物的多核苷酸的第二種轉基因動物；和c)使性別相反的第一種和第二種動物交配。在某些實施方案中，獲得第二種轉基因動物可通過d)用i)可調控的siRNA表達構建物，其含有siRNA編碼核酸區段和可調控啟動子區(該區段與啟動子區之間有一可切除片段)；和ii)該可調控siRNA表達構建物的可調節多肽調節物的編碼多核苷酸，來轉染未分化的哺乳動物細胞；e)如果細胞是單倍體基因組則使其受精；和f)將產生的胚胎移植到雌性動物中由該雌性動物產生第二種轉基因動物。在某些情況下，未分化細胞是未受精的卵母細胞、受精的卵母細胞、胚胎干細胞、桑椹胚或胚泡中的細胞。此外，所用方法也可能涉及培養細胞然后轉染和/或移植。另外，這類方法可能涉及與本發明轉基因動物交配。本發明在某些方面涉及調節細胞中某基因的表達，例如通過制備或提供編碼操作性連接于一外部可控制啟動子的siRNA，其中siRNA由能下調此基因表達的構建物所編碼，然后部通過該外部可調控啟動子從外部調節編碼的siRNA表達。該外部可調控啟動子可以是阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的試劑，如外部施加的藥物下調該編碼的siRNA的表達。在具體實施方案中，該阻抑型啟動子含有至少一個tet0序列；另外，該方法也可包括提供編碼能阻抑siRNA表達的誘導型阻抑物的多核苷酸的步驟。在本發明的一具體方面，編碼該阻抑物的多核苷酸也定義為藥物誘導型阻抑融合蛋白，其含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域，其中該融會蛋白的結合域可結合該多核苷酸構建物，因此該轉錄阻抑結構域可發揮阻抑siRNA轉錄的作用。在本發明的具體實施方案中，有一種研究基因產物在細胞中的功能的方法，該方法通過向細胞提供i)含操作性連接于一外部可調控啟動子的siRNA編碼區的多核苷酸構建物，其中該約建物編碼的siRNA可下調編碼該基因產物的基因表達；和ii)編碼能阻抑此siRNA表達的誘導型阻抑物的多核苷酸；和iii)通過該外部可調控啟動子從外部調節編碼的siRNA的表達。該外部可調控啟動子可以是阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的試劑，如外部施加的藥物下調該編碼的siRNA的表達。本文所述的方法和組合物可用于治療目的，如控制細胞被免疫系統識別的能力。要這樣做，可通過下調移植抗原，如MHCI抗原，例如通過下調β2微球蛋白，來降低成本或阻抑免疫系統對細胞的識別，合細胞更順從細胞移植。在本發明一個方面，下調β2微球蛋白可導致包含它的整個復合體下調。特別考慮到本發明的方法和裝置的實施方案可采用本發明的其它方法和裝置。在權利要求中所用的術語“或”指“和/或”，除非標明指另外或其它相互排斥的東西，雖然公布了支持物，但此定義僅指其它和“和/或”。本申請書中，術語“約”用于表示一個值，和采用的裝置或方法測定此值得到的標準差。按照專利法，詞語“一個”當在本發明權利要求書和說明書中與詞“包含”一起用時指一個或多個。附圖簡述以下組成本發明一部分的附圖進一步顯示了本發明的某些方面內容。通過參考一個或多個這些附圖，結合本文提供的具體實施方案的詳細描述可更佳地了解本發明》圖1可調節siRNA合成的慢病毒載體。圖2強力霉素通過Tet-KRAB介導的對siRNA產生的阻抑誘導性調節了GFP的表達。GFP表達平均值表示在垂直軸上。水平軸的8段顯示各構建物被轉染入表達GFP的對照(Co)細胞中。Co(對照)段沒有被構建物轉染但經受了處理。各段中的4個短劃顯示各構建物的GFP表達對照處理(Co四組中各組的第一個短劃)；WPXL-KEAB處理，表示細胞用WPXL-KRAB共轉染(四個中的第二個短劃)；強力霉素處理(DOX；四個中的第三短劃)；和WPXL-KRAB+DOX，包括用WOXK-KRAB共轉染細胞和用強力霉素處理細胞。圖3A-3B用于以dox-誘導型siRNA條件性阻抑基因的慢病毒的系統。(圖3A)所用的慢病毒載體質粒的模式圖。將含(LV-H)或不含(pLV-TH)上游tet0序列的H1啟動子、H1-siRNA(LV-His)和tet0-H1-siRNA(LV-THis)盒克隆到pWPXL的3’U3區域內。所有載體都含有在EF-1α啟動子轉錄控制下的內部標記cDNA。(圖3B)siRNA慢病毒載體的雙拷貝設計。逆轉錄時，利用其3’同源序列作為模板，合成5’LTR的U3區，導致先前已整合入轉導細胞基因組中的siRNA盒成雙。圖3中的構建一般見圖1中所述。圖4A-4Bdox-可控制轉錄阻抑物的作用模型。(圖4A)缺少dox時，tTR-KRAB結合于tet0并阻抑Hi-介導的siRNA轉錄，而使細胞靶基因正常表達(“打開”)。(圖4B)在存在dox時，tTR-KRAB不能結合tet0，因此產生siRNA從而下調它們的靶基因(“關閉”)。siRNA載體中含有的內部標記提供了一種“反向”監視系統，因為存在dox它“打開”，缺少dox時它“關閉”。圖5A-5B用dox-誘導型的siRNA調節GFP表達。(圖5A)以組成型(LVHsi)或調節(LV-THis)方式，用對照慢病毒載體(LVTH)或用產生GFP-特異性siRNA的載體，轉導攜帶表達EF-1α啟動子GFP(Hela-GFP)的單拷貝慢病毒載體，如表明的有或沒有LV-tTR-KRAB。截短形式的神經生長因子受體(ΔNGFR)作用是siRNA載體中的內部報導物。這類似于圖2中提供的資料。(圖5B)條件性表達內部標記基因。在存在或不存在dox時培養用LV-This/GFP和LV-tTR-KRAB雙重轉導的Hela-GFP細胞，然后用NGFR特異性單克降抗體Ab作FACS分析。圖6用dox或誘導的siRNA調節內源基因。左如材料和方法中所述下調用所示慢病毒載體感染的p53.MCF-7細胞。用抗p53、GFP或肌動蛋白(作對照)的單克降抗體作Western印跡分析。右下調核纖層蛋白A/C。用核纖層蛋白特異性siRNA載體和抗體在Hela細胞中進行同一實驗。圖7A-7Bdox-誘導的RNA干擾的動力學和劑量反應。(圖7A)如材料和方法中所述，用LV-This/p53和LV-tTR-KRAB共轉導MCF-7細胞。5天后加入濃度5μg/ml的dox。收獲細胞立即進行dox處理(泳道“0”)然后在標明時間點處理；wt，非轉導細胞。(圖7B)如圖1轉導后5天，將細胞置于含以下濃度dox(μg/ml)的培養液中0(泳道1)、0.0005(泳道2)、0.001(泳道3)、0.002(泳道4)、0.004(泳道5)、0.008(泳道6)、0.016(泳道7)、0.063(泳道8)、0.25(泳道9)、1(泳道10)、5(泳道11)；wt，非轉導細胞。再5天后進行全細胞提取物的Western印跡分析。圖8H1啟動子的Cre-介導的激活。將從表達Cre的轉基因小鼠靶組織中取回的受精卵母細胞，用tet-siRNA慢病毒載體(及LV-tTR-KRAB)轉導。去除靶組織中的LoxP-側接的EF-1α-MARKER盒，得以條件性產生siRNA。圖9Cre介導的切除后H1啟動子的序列。將LoxP序列插入到近前端序列元件(PSE)和轉錄起始位點之間的H1啟動子中，取代wt序列(wt遠端保守)。修飾(*)LoxP序列(核心元件)以容納TATA盒。插入GFP-特異性發夾序列作為例子。圖10A-10B目前的系統分析突變基因表型的應用。目前系統的特性可相互排除野生型細胞基因或其突變型的條件性表達。(圖10A)在缺少藥物時，突變體表達和siRNA合成受到阻抑(野生型打開)。(圖10B)存在藥物時，由于siRNA的作用wt基因表達式下調，突變型轉錄。圖11藥物-可控制的轉基因作用和藥物-可控制的敲減的闡述性示范實施方案。發明詳述本發明提供一種條件性阻抑哺乳動物細胞基因(表達)的系統。本發明涉及應用藥物-可誘導的RNA干擾來開發基因敲減動物，任選地可通過慢病毒載體介導。本發明提出可用藥物可誘導的RNA干擾作用，來產生其基因功能可受外部調節的敲減動物。慢病毒介導的轉基因作用提供了創立基因修飾生物的有效和省時的工具(Lois等，2002)。也可利用慢病毒載體輸送的RNA干擾作用，使轉基因小鼠中的基因沉默(Rubinson等，2003)。此輸送模式的遍在性提示其非常廣泛的用途，因為慢病毒載體可轉導包括干細胞的廣泛靶細胞，可用于產生若干種類的轉基因動物。本發明技術采用以下系統四環素反式阻抑子(tTR-KRAB)介導的聚合酶III活性的藥物誘導型調節；和慢病毒介導的轉基因作用。本文所述系統明顯優于目前采用的條件性敲減法。首先，與傳統的Cre-loxP介導敲除法相比，縮短了產生轉基因動物的時間(省錢、省力、省時)。第二，提供了所產生敲減小鼠的可逆表型。第三，在發育或成年過程中靶基因可關閉好幾次(Cre介導的切除導致不可逆表型)。第四，能從小鼠以外的不同種動物產生條件性敲減動物。I.RNA干擾本發明提供的siRNA能在細胞中存在靶基因并不穩定表達時，調節，特別是減弱靶基因的表達。表達的調節器可部分或完全阻抑基因的功能，甚至在對主要靶基因的反應中上調其它次級靶基因或增強這些基因的表達。基因表達的減弱包括基因功能、轉錄加工或轉錄物的翻譯部分或完全受到阻抑或阻抑。RNA干擾的含意是，基因表達的調節通過蛋白質與RNA(具體包括可作為“向導”RNA的小dsRNA)的復合物發生。siRNA之所以有效認為是它的核苷酸序列充分對應于靶基因核苷酸序列的至少一部分。雖然本發明不受其作用機制假說的限制，但更偏向認為siRNA中的核苷酸序列基本上相同于靶基因序列的至少一部分。靶基因一般指含有編碼基因產物如多肽區域的多核苷酸，或對該多肽的表達極為重要的具有調節、復制、轉錄或翻譯、或其它加工作用的多核苷酸區，或含有多肽編碼區和操作性連接的調節表達區二者的多核苷酸。本文中操作性連接指相對于多矛核苷酸序列，啟動子被置于正確發揮功能的位置和/或朝向，從而能控制該序列的起始和/或表達。靶基因可以在是染色體內(基因組)或染色體外。可以是細胞內源的功可以是外來基因(轉基因)。可將外來基因整合到宿主基因組中，或可存在于染色體外遺傳性結構如質粒或粘粒上。靶基因也可衍生自能感染生物或細胞的病原體，如病毒、細菌、真菌或原蟲。靶基因可以是病毒或不能誘導干擾素應答的前病毒基因，如逆轉錄病毒基因。靶基因可以是蛋白質編碼基因或非蛋白質編碼基因，如編碼核糖體RNA、剪接體RNA、tRNA等的基因。可靶向細胞中任何待表達的基因。靶基因宜為參與對疾病有重要意義的細胞活動或與之相關的，或用于研究目的特別感興趣的基因。因此，例如以下是可用于本發明方法調節或減弱靶基因表達的可能的靶基因分類發育中的基因(如粘附分子、細胞周期蛋白抑制劑、Wnt家族成員、Pax家族成員、Winged螺旋家族成員、Hox家族成員、細胞因子/淋巴因子和它們的受體、生長和分化因子和它們的受體、神經遞質和它們的受體)；癌基因(如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)；腫瘤阻抑基因(如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1)；和酶(如ACP脫飽和酶和hycroxylases、ADP-葡萄糖pyrophorylases、ATP酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、環氧化酶、脫羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、半纖維素酶、整合酶、轉化酶、異構酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂氧合酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支鏈淀粉酶、逆轉錄酶、拓撲異構酶、木聚糖酶)。siRNA的核苷酸序列由其靶基因的核苷酸序列確定。siRNA含有與靶基因至少一部分基本相同的核苷酸序列。優選，siRNA所含有核苷酸序列與靶基因的至少一部分完全相同。當然，當RNA序列DNA序列作比較時“相同的”RNA序列含有的是枋糖核苷酸，而DNA序列含的是脫氧核糖核苷酸，另外，RNA序列通常含尿嘧啶的位置在DNA序列中含的是胸腺嘧啶。siRNA含雙鏈結構(如發夾結構或sihRNA)，其序列“基本上相同于”靶基因的至少一部分。‘相同’如本領域所知，是一種或多種多核苷酸(或多肽)序列之間通過序列比較所確定的關系。在專業上，相同性也指兩多核苷酸序列之間通過核苷酸編號的匹配所確定的序列相關的程度。相同性不難計算。見例如ComputationalMolecularBiollogy，1988，Biolcomputinginformatics和GenomeProjects，1993；和WO99/32619，WO01/68836，WO00/44914和WO01/36646中所述的方法，它們的內容納入本文作參考。已有測定二核苷酸序列之間相同性的許多方法，此術語是本領域熟知的。通常設計的測定相同性的方法要產生最大程度的核苷酸序列匹配，也常駐機構用計算機程序實施。相關領域技術坐吃山空不難獲得這類程序。例如GCG程序包(Devereux等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，1998)和CLUSTAL(Higgins等，1992；Thompson等，1994)。本領域技術人員懂得可比較不同長度的二多核苷酸的較長片段的全長。或者，比較較小的區域。通常比較同樣長度的序列以最終估計它們在實施本發明中的用途。優選用作siRNA的和靶基因的至少15個連續核苷酸的dsRNA之間序列100％相同，雖然具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高相同性的dsRNA也可用于本發明。與靶基因至少一部分基本相同的siRNA也可以是dsRNA，其中二條互補鏈之一(就自身互補RNA而言，其二條自身互補部分之一)或與靶基因所述部分的序列相同，或相對而言于靶基因該部分核苷酸序列含有一個或多個插入、缺失或單點突變。因此，siRNA技術具有能耐受序列變異(預計可能因基因突變、菌株多態性或進化多樣性所致)的性能。II.siRNA構建物的受控表達siRNA表達構建物(或任何其它感興趣的序列)的受控表達可通過許多該領域技術人員已知的系統實現。如本發明文中所述，啟動子操縱了多核苷酸轉錄的起始。這類多核苷酸可含有編碼siRNA的序列。能發動轉錄的誘導型啟動子是至少能對誘導物的存在或作用部分起反應的啟動子，所述誘導物可以是其作用能誘導該啟動子發動轉錄的一種化合物或蛋白質。A.啟動子術語“啟動子”本文用于指能調節某編碼區，如基因表達的任何序列。例如，啟動子可以是組成型、誘導型、阻抑型或組織特異性啟動子。“啟動子”是一種控制序列，能控制某多核苷酸序列區域的轉錄啟動和速度。它可含有可調控的蛋白質和分子，如RNA聚合酶或其它轉錄因子可結合的遺傳元件。短語“操作性相連接”指啟動子相對于某核酸序列以正確的功能位置和/或朝向控制著該序列的轉錄啟動和/或表達。啟動子可以和或不和“增強子”一起使用，增強子指參與核酸序列轉錄活動的順式作用調節序列。啟動子可以是與某基因或序列天然相連接，可以通過分離位于編碼區段和/或外顯子上游5’端的非編碼序列獲得。這種啟動子可稱為“內源性啟動子”。類似的，增強子可以攻玉天然與某核酸序列相連接，位于該序列的下游或上游。或者，可通過將編碼的核酸區段置于重組或異源啟動子(指在其天然環境下通常不與該核酸序列相連接)的控制下來獲得某些好處。重組或異源性增強子也指在其天然環境中不與該核酸序列相連接有增強子。這類啟動子或增強子可啟動子或增強子、分離自任何其它前核、病毒或真核細胞的啟動子功增強子、“天然”不存在的啟動子功增強子、即含有不同轉錄調控區的不同元件的，和/或能改變表達的突變的啟動子功增強子。除用合成法產生啟動子和增強子的核酸序列外，可采用重組克隆和/或核酸擴增技術，包括PCRTM與本文所述組合物來產生這類序列(見美國專利4,683,202和5,928,906，各納入本文作參考)。此外，考慮也可采用能指導所述序列在非細胞核細胞器，如線粒體、葉綠體等內轉錄和/或表達的控制序列。在具體實施方案中，本發明所用的啟動子是一種外部可控制的啟動子，可定義為PolI、PoiII或PoiIII啟動子之任何一種(條件型、組織特異型、可調控型、組成型等)，它們通過條件性阻抑融合蛋白的結合域操作性連接于至少一個多核苷酸序列，所述阻抑融合蛋白含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域，二結構域的位置使轉錄阻抑結構域能阻抑siRNA或cDNA或基因的轉錄。誘導型啟動子的特征是當存在誘導物，或受誘導物影響，或與其接觸時，與不存在誘導物，或不受其影響，或其不接觸此啟動子時，誘導型啟動子可導致額外的轉錄活性。誘導物可以是內源性的，或一般是外源性的化合物或蛋白質，給予此化合物或蛋白質能激活對該誘導型啟動子的誘導。誘導物，即化合物或蛋白質的前身，其自身可以是處在誘導型或阻抑性啟動子控制下的某多核苷酸的轉錄或表達產物。誘導型啟動子的例子包括但不限于四環素、金屬硫蛋白、蛻皮激素、哺乳動物病毒(臺腺病毒晚期啟動子；和小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重復序列(MMTV-LTR))和其它類固醇反應性啟動子雷帕霉素反應性啟動子等。本發明的誘導型啟動子能在真核宿主生物中發揮功能。優選的實施方案包括哺乳動物誘導型啟動子，但也可采用設計能在真核宿主中發揮功能的其它生物的誘導型啟動子及合成的啟動子。本發明誘導型啟動子的重要功能特征是它們接觸外部施加的物質，如環境誘導因子時而被最大誘導。合適的環境誘導因子包括接觸熱、各種類固醇類化合物、二價陽離子(包括Cu2+和Zn2+)、半乳糖、四環素、IPTG)異丙基β-D硫代半乳糖苷)，及其它天然產生的和合成的誘導因子和無緣無故的誘導物。重要的是要注意本發明某些模式中，該環境誘導信號可能對應于去除上列任何一種因子，不論其是否在非誘導狀態中不斷施加。真核啟動子的誘導型可通過本發明方法所包括的二種機制獲得。適合的誘導型啟動子依賴于轉錄激活劑，進而依賴于環境誘導因子。另外，誘導型啟動子可被其本身受環境誘導因子滅活的轉錄阻抑物所阻抑。因此，因此誘導型啟動子，可以是受能正面激活轉錄活化劑的環境因子誘導的啟動子，或是受負面調節轉錄阻抑物的環境因子所阻抑的啟動子。本發明的誘導型啟動子包括受潛伏的轉錄激活劑(其受環境誘導因子的誘導)作用控制的啟動子。優選例子包括酵母菌基因CUP1、CRS5和SOD1的銅誘導型啟動子它們受酵母菌ACE1轉錄激活劑的銅依賴型激活(見Strain和Culotta，1996；Hottiger等，1994；Lapinska等，1993；和Gralla等，1991)。或者，可用酵母菌基因CTT1(編碼胞質過氧化氫酶T)的銅誘導型啟動子，其功能不依賴于ACE1轉錄激活劑(Lapinska等，1993)。有效誘導這些基因的銅的濃度應適當低，可被大多數細胞體系，如酵母菌和果蠅細胞所耐受。或者，本發明可采用兵其它天然產生的誘導型啟動子包括類固醇誘導型基因的啟動子(見Oligino等，1998，GeneTher.5491-6)；酵母菌的半乳糖誘導型啟動子(見Johnston，1987，MicrobiollRev.51458-76；Ruzzi等，1987，MolCellBioll.7991-7)；和各種熱激基因啟動子。許多真核轉錄激活劑已顯示在廣大范圍的真核宿主細胞中具有功能，例如，在酵母菌中鑒定到的誘導型啟動子也適合用于哺乳動物宿主細胞。例如，已根據可誘導的含GAL-4結合位點的哺乳動物啟動子的GAL-4雌激素受體融合蛋白，開發了哺乳動物細胞的獨特合成性轉錄誘導系統(Braselmann等，1993，ProcNatlAAcadSciUSA.901657-61)。這些和其它對轉錄激活劑起反應要依賴于特定誘導因子的誘導型啟動子，適合用于本發明。本發明的誘導型啟動子還包括可受阻抑物阻抑的啟動子，所述阻抑物可因環境誘導因子的作用而被滅活。例子包括可在轉錄上阻抑經工程改造摻入了適當的阻抑物-結合操縱子序列的真核啟動子。用于本發明的優選的阻抑物對生理上良性誘導因子的滅活作用很敏感。因此，當利用lac阻抑物蛋白來控制經工程改造含有lac0操縱子序列的真核啟動子的表達時，用IPTG處理宿主細胞會引起lac阻抑物從該經工程改造的啟動子上脫離下來，從而發生轉錄。類似的，當采用tet阻抑物來控制經工程改造含有tet0操縱子序列的真核啟動子的表達時，用四環素處理宿主細胞將引起tet阻抑物從該經工程改造的啟動子上脫離下來，從而發生轉錄。一種或多種生理條件，如pH的變化、溫度、輻射、滲透壓、鹽濃度、細胞表面結合和一種或多種外源因子或內源因子的濃度都誘導型啟動子。外源性因子包括氨基酸和氨基酸類似物、糖和多糖、核酸、轉錄激活劑和阻抑物、細胞因子、毒素、石油化合物、含金屬的化合物、鹽、離子、酶底物類似物和它們的組合。在具體實施方案中，誘導型啟動子在對環境條件的變化，如化學物質、金屬、輻射或營養物濃度的變化，或pH的變化的反應中，被激活或受到阻抑。誘導型啟動子可以是噬菌體誘導型啟動子、營養物誘導型啟動子、溫度誘導型啟動子、輻射誘導型啟動子、金屬誘導型啟動子、激素誘導型啟動子、類固醇誘導型啟動子和/或它們的雜交物和組合。在某些實施方案中，特別是癌癥基因治療中，所用的啟動子是離子射線誘導型啟動子，通過接觸離子射線，如UV或X-線，誘導了位于癌細胞中的基因表達。射線誘導型啟動子包括非限制性例子的fos啟動子、c-jun啟動子、或Egr-1啟動子的至少一個CArG結構域。誘導型啟動子的例子包括一些基因如細胞色素P450基因、熱激蛋白基因、金屬硫蛋白基因、激素誘導型基因的啟動子，如雌激素啟動子等。誘導型啟動子可以是Zn2+金屬硫蛋白啟動子、金屬硫蛋白-1啟動子、人金屬硫蛋白IIA啟動子、lac啟動子、小鼠乳腺瘤病毒早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動子、丙糖脫氫酶啟動子、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、猿病毒40早期啟動子或逆轉錄病毒骨髓增殖性肉瘤病毒啟動子。誘導型啟動子的例子包括哺乳動物probasin啟動子、乳白蛋白啟動子、GRP78啟動子、或細菌四環素誘導型啟動子。其它例子包括熱激蛋白、類固醇激素、重金屬、佛波酯、腺病毒EIA元件、干擾素和血清誘導型啟動子。用于體內的誘導型啟動子包括那些對生物相容性物質，如在給定動物組織中常遇到的那些物質起反應的啟動子。一個例子是人PAI-1啟動子，它是腫瘤壞死難因子可誘導的。其它合適的例子有細胞色素P450基因啟動子，各種毒素和其它因子如熱激蛋白基因可誘導的啟動子、各種應激誘導型啟動子、激素可誘導基因，如雌激素基因啟動子等。顯然，重要的是采用能有效指導所述DNA區段在選擇用于表達的細胞、細胞器和生物中表達的啟動子和/或增強子。分子生物學領域技術人員一般知道蛋白質表達所用的啟動子、增強子和細胞類型。例如見Sambrook等(1989)，其內容納入本文作參考。所用啟動子可以是組成部分性、組織特異性、誘導型，和/或在適當條件下用來指導引入的DNA區段高水平表達，如有利于大規模生產重組蛋白質和/或肽。啟動子可以是異源的或內源的。在某些實施方案中，本發明所用啟動子是組織特異性啟動子。本發明考慮的啟動子包括條件性啟動子。條件性啟動子是一種只在某種條件下才有活性的啟動子。例如，當存在一種特定物質，如化學化合物時該啟動子失活或受阻抑。當所述物質不再存在時，該啟動子的轉錄被激活或去阻抑。條件性啟動子的例子包括受甲硫氨酸調節的啟動子Met23，調節作用以甲硫氨酸濃度為函數(KerjanP等，1986)，或受半乳糖調節的啟動子GAL1或GAL10，調節作用以半乳糖濃度為函數(Johnston和Davis，1984)，但不限于此。在優選實施方案中，本發明的方法和組合物中采用外部刺激可調控的啟動子。外部刺激可調控啟動子的例子包括，例如，PL啟動子、PR啟動子、Pre啟動子、Prm啟動子、P’R啟動子、T7晚期啟動子、trp啟動子、tac啟動子、lac啟動子、gal啟動子、ara啟動子或recA啟動子。在具體實施方案中，本發明中采用這些啟動子中的操縱子序列。表1列出了本發明用于調節基因表達的元件/啟動子。此表不想詳盡描述參與啟動表達的所有可能的元件，而只是示范性的。表2提供了可誘導元件的例子，它們是在對特定刺激反應時可被激活的核苷酸序列區域。此表不想詳盡描述參與啟動表達的所有可能的元件，而只是示范性的。阻抑型啟動子是一種能對阻抑物的存在或作用至少部分起反應的啟動子，所述阻抑物是作用為阻抑啟動子，從而可降低、阻抑或阻抑在該啟動子影響下的多核苷酸轉錄的化合物或蛋白質。阻抑型啟動子的特征是，在阻抑物存在、影響下，或接觸時，可導致轉錄活動水平比該阻抑物不存在時，或不受其影響不接觸時降低。阻抑物可以是內源性的，或通常是外源性給予的具有阻抑該阻抑型啟動子活性的化合物或蛋白質。阻抑物，即化合物或蛋白質，原先自身可能是在誘導型啟動子或阻抑型啟動子控制下的多核苷酸轉錄或表達的產物。在具體實施方案中，編碼條件性阻抑融合蛋白的多聚核苷酯分子，和/或編碼siRNA的多核苷酸也含有一操作性相連的啟動子。該啟動子可以是可誘導型啟動子或組成型啟動子，在某些實施方案中，這類啟動子的例子包括Boshart等(1985)所述的巨細胞病毒啟動子IE、遍在性表達型啟動子如HSV-Tk(McKnight等，1984)和β-肌動蛋白啟動子(如Ng等，1985所述的人β-肌動蛋白啟動子)、及能與控制區聯合使轉基因整合位點獨立表達的啟動子(Grosveld等1987)、及組織特異性啟動子如白蛋白啟動子(肝臟特異性，Pinkert等，1987)、淋巴樣特異性啟動子Calame和Eaton，1988)、具體是T-細胞(Winoto和Baitimore，1989)和免疫球蛋白(Banerji等，1983；Queen和Balimore，1983)啟動子、神經元特異性啟動子(如神經纖絲啟動子Byrne和Ruddle，1989)、胰腺行異性啟動子(Edlund等，1985)或乳腺特異性啟動子(牛奶乳清啟動子，美國專利4,873,316和歐洲專利申請出版物264,166)及受發育調節的啟動子，如小鼠hox啟動子(Kessel和Cruss，Science.249374-379，1990)或甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman，GenesDev.3537-546，1989)，以上各文獻內容納入本文作參考。優選在各自細胞類型中啟動子是組成型的。組織特異性啟動子或元件的鑒定及特征分析其活性的試驗是該領域技術人員熟知的。這類區域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、促生長素阻抑素受體2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睪視黃酸結合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)小鼠α-2(XI)膠原(Lareyre等，1999)、DIA多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長因子II(Wu等，1997)、人血小板內皮細胞粘附分子-1(Almendro等，1996)和SM22α啟動子。在某些實施方案中將采用組織特異性啟動子和/或可調控元件。可用于本發明表達載體中的這類組織特異性啟動子的其它例子，包括大腸上皮細胞特異性的肝脂肪酸結合(FAB)蛋白基因、對胰細胞特異性的胰島素基因、transphyretin、α1-抗胰蛋白酶、纖溶酶原激活物抑制劑1型(PA-1)、肝細胞特異性的載脂蛋白AI和LDL受體基因、少突膠質細胞特異性的髓鞘堿性蛋白(MBP)基因、膠質細胞特異性的膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)基因、特異性靶向眼睛的視蛋白和神經細胞特異性的神經元特異性烯醇化酶(NSE)基因的啟動子。本發明某些方面，利用組織特異性控制，來控制靶序列的表達水平，如控制siRNA的表達水平，或調節其它組分，如能直接或間接調節轉基因(siRNA)表達的酶的表達水平。其與條件性阻抑融合蛋白的表達水平相反。然而，在其它實施方案中，條件性阻抑融合蛋白的表達是組織特異性的，而非siRNA或酶的組織特異性表達。還考慮本發明可采用dectin-1和dectin-2啟動子可在本發明中聯用的其它病毒啟動子、細胞啟動子/增強子和誘導型啟動子/增強子列于表1和表2中。此外，啟動子/增強子聯合(如EukaryoticPromoterDataBaseEPDB)也可用來驅動編碼多糖加工酶、蛋白質折疊輔助蛋白、選擇性標記蛋白或感興趣的異源蛋白的結構基因的表達。或者，在本發明中可采用用于基因治療，如癌基因治療的組織特異性啟動子(表3和表4)。表3基因治療的候選組織特異性啟動子表4用于組織特異性基因的候選啟動子B.起動信號和內部核糖體結合位點有效翻譯編碼序列還需要特異性起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子或毗鄰序列。可能需要提供外源性翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。本領域技術人員能容易地確定和提供必須的信號。眾所周知起始密碼子必須位于所城編碼序列的讀框內以確保完整翻釋插入物。外源性翻譯控制信號和起始密參天子可以是天然的可合成的。包含適當的轉錄增強元件可提高表達效率。在本發明某些實施方案中，利用內部核糖體進入位點(IRES)元件來產生多基因或多順反子信使。IRES元件能繞過5’-甲基化加帽依賴型翻譯的核糖體掃描模式，并開始在內部位點翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。細小病毒家族二成員(脊灰和腦心肌炎病毒)的IRES元件已有描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及哺乳動物信使的IRES(Macejak和Sarmow，1991)。可將IRES元件連接于異源性開放讀框。可一起轉錄多個開放讀框，每個由IRES隔開，產生多順反子信使。借助該IRES元件，各個開放讀框均可接近核糖體進行有效翻譯。利用一個啟動子/增強子轉錄一個信使，可有效表達多個基因(見美國專利5,925,565和5,935,819，納入本文作參考)。C.多克隆位點載體可含有多個克隆位點(MCS)，它們位于含有多個限制性酶切位點的核酸區域中，每個酶切位點都可用于標準重組技術來消化此載體(見Carbonelli等，1999和Cocea，1997，二者內容納入本文作參考)。“限制性酶消化”指用只能在某核酸分子特定位點發揮作用的酶催化性切除該核酸分子。可從商業上獲得許多這樣的酶。本領域技術人員都知道這種酶的用途。通常采用能在MCS中切除的限制性酶使載體線性化或片段化，以能將外源序列連接入該載體。“連接”指在可以是或不是相互毗連的二個核酸片段之間形成磷酯鍵的過程。涉及限制性酶和連接反應的技術是重組
技術領域：
技術人員熟知的。D.剪接位點大多數轉錄的真核RNA分子將經歷RNA剪接從最初轉錄物中除去內含子。含基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點才能確保轉錄物的正確加工用于蛋白質表達(見Ch和ler等，1997，其內容納入本文作參考)。E.末端信號本發明的載體或構建物一般含有至少一個末端信號。“末端信號”或“終止子”組成了RNA聚合酶轉錄DNA序列為RNA時的特定終止位點。因此，在某些實施方案中，考慮設置中止RNA轉錄物產生的終止信號。終止子是體內必須的，以達到所需的信使水平。在真核系統中，終止子區域還包括特異性DNA序列，其可定點切除新生轉錄物以暴露出聚腺苷酸化位點。這給予了專門的內源性聚合酶信號使其在該轉錄物的3’端添加大約200A的殘基(聚A)。經昆尾修飾的RNA分子看來更穩定，能更有效翻譯。因此，其它涉及真核細胞的實施方案中，優選終止子含有RNA切除信號，更優選訪終止子信號能開啟信使的聚腺苷酸化。終止子和/或聚腺苷酸化位點元件的作用，可能是提高信使水平和/或最大程度減少從表達盒子到其它序列的讀取。考慮可用于本發明的終止子包括本文所述或本領域技術普通人員已知的轉錄終止子，包括但不限于，例如基因的末端序列，如牛生長激素終止子或病毒末端序列如SV40終止子。在某些實施方案中，末端信號可以缺少可轉錄或可翻譯序列，如由于序列截短而致。F.聚腺苷酸化信號具體的真核細胞表達通常包括聚腺苷酸化信號對轉錄物適當聚腺苷酸化的作用。不認為聚腺苷酸化信號的性質是成功實施本發明的關鍵，和/或可采用任何這種序列。優選的實施方案包括SV40聚腺苷酸信號和/或牛生長激素聚腺苷酸信號，方便的和/或在各種靶細胞中已知功能良好的。聚腺苷酸化可提高轉錄物的穩定性，或可促進胞質質轉運。G.復制起點為了增殖宿主細胞中的載體，此載體中可含一處或多處復制起始位點(常稱為“ori”)，它是起動復制的特異性核酸序列。或者，如果宿主細胞是酵母菌，可采用自動復制序列(ARS)。H.可選擇的和可篩選的標記在本發明的某些實施方案中，可在表達載體中加入一標記而在體外或體內鑒定含本發明多核苷酸的構建物。這類標記可賦予細胞一種可被鑒定的變化，使得易于鑒定含該表達載體的細胞。通常，可選擇性標記是能賦予某可選擇性能的標記。陽性可選擇標記是存在該標記時可選到其存在的標記，而陰性可標記是其存在防礙其選擇的標記。陽性可選擇標記的例子是藥物抗性標記。通常在載體中包付諸東流可選擇標記有助于克隆和轉化子的鑒定，例如能賦予對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和組氨醇抗性的基因是有用的可選擇性標記。除了能賦予可區分轉化子的表型的標記外，也考慮其它類型的標記包括可篩選的標記，如GFP，依靠比色法進行分析。或者，可利用可篩選的酶，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉移酶(CAT)。本領域技術人員知道怎樣使用免疫標記物，可能要與FACS分析相結合。認為所用的標記不重要，只要它能與編碼基因產生的核酸同時表達。可自動控制和可篩選的標記的其它例子是該領域技術人員熟知的。例如，Mermad等在美國專利6,340,741中公開了在生物學和醫學研發，及生物動技術和體細胞基因治療中廣泛應用的靶基因在真核系統中的受控表達。利用異源性或人造(嵌合性)轉錄因子對外源加入的藥物誘導物(其作用是bonafide配體)的反應，實現了基因表達的調節。通常這些轉錄因子能識別靶基因啟動子中的同源調節元件，該配體能調節轉錄因子與DNA的相互反應，或DNA-結合因子與轉錄活化結構域的相互反應。給予或去除該配體會導致靶基因轉錄或活化的開關處于開或關狀態。幾種小分子已顯示能介導組織培養細胞和/或轉基因動物模型中基因表達的調節。這些小分子包括FK1012和雷帕霉素免疫阻抑藥物(Spencer等，1993；Magari等，1997)、孕酮拮抗劑米非司酮(RU486)(Wang，1994；Wang等，1997)、四環素抗生素衍生物(Gossen和Bujard，1992；Gossen等，1995；Kistner等，1996)和昆蟲類固醇激素蛻皮激素(No等，1996)。所有這些文獻納入本文作參考)。作為其它例子，Yao在美國專利6,444,871中公布了已開發的與四環素抗性(tet)操縱子子的前核元件，其中tet阻抑蛋白與已知能調節哺乳動物細胞轉錄的多肽融合在一起。通過給tet操縱子序列定位后將該融合蛋白導入特定位點。例如，將tet阻抑子融合于反式激活蛋白(VP16)而靶向位于某選出的基因上游的tet操縱子序列(Gussen等，1992；Kim等，1995；Hennoghausen等，1995)。此融合蛋白的tet阻抑子部分與該操縱子結合從而將VP16激活蛋白靶向需要誘導轉錄的特定位點。另一種方法是使tet阻抑子與KRAB阻抑結構域融合，將此蛋白靶向某基因上游數百個堿基對的操縱子。利用此系統，已發現該嵌合蛋白，而不是單單tet阻抑子，能產生對CMV-調節的基因表達10-15倍的阻抑(Deuschle等，1995)。I.調節元件和系統在基因調節及其修飾的一些例子中，需要導入進化上相隔很遠物種的調節元件，如大腸桿菌到高等真核細胞，預計調制這種調節環境的的效應器對真核細胞生理將是橢性的，結果不會在真核細胞中引起不希望的多效性作用。例如大腸桿菌的Lac阻抑子(LacR)/操縱子/誘導物系統在真核細胞中具有功能，已被用來調節基因表達，通過三種不同方式(1)將Lac操縱子置于啟動子的恰當位點防止轉錄啟動(Hu和Davidson，1987；Brown等，1987；Figge等，1988；Fuerst等，1989；Deuschle等，1989)；(2)用LacR/操縱子復合物阻斷RNA聚合酶的轉錄延伸(Deuschle等，1990)；(3)啟動子活化對LacR與單純皰疹病毒(HSV)毒粒蛋白16(VP16)的活化結構域之間的融合起反應(Labow等，1990；Baim等，1991)。在一個版本的Lac系統中，lac操縱子-連接序列受LacR-VP16融合蛋白的組成型激活而表達，在存在異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)時表達關閉(Labow等，1990，同上)。在另一版本此系統中，采用在存在IPTG時能與lac操縱子結合的lacR-VP16變體，可通過提高細胞溫度而增強(Baim等，1990，同上)。因此，在本發明的某些實施方案中采用了Lac系統的組分。例如，可將lac操縱子操作性連接于siRNA-編碼多核苷酸，可從外部用，例如，含lac阻抑子的IPTG可誘導融合蛋白控制其表達。還發現大腸桿菌四環素抗性系統的組分在真核細胞中具有功能，已被用來調節基因表達。例如在植物細胞中表達能在缺少呈環素時結合tet操縱子序列并阻抑基因轉錄的Tet阻抑子(TetR)，其表達濃度足夠高能阻抑含tet操縱子序列的啟動子的轉錄(Gatz，C等，1992，PlantJ.2397-404)。在本發明的某些實施方案中，類似地采用了這種阻抑子系統。本發明中也可利用溫度誘導型基因調節系統，如含有融合蛋白形式的冷誘導反式激活蛋白的示范性TIGR系統，其含有融合于VP16反式激活蛋白的熱激反應調節子rheA(Weber等，2003a)。能對該融合溫感器反應的啟動子含有操作性連接于最小啟動子，如人巨細胞病毒立即早期啟動子最汪版本的rheO元件。在37℃允許溫度時，該冷誘導反式激活蛋白，反式激活了示范性rheO-CMVmin啟動子，得以表達靶基因。41℃時，該冷誘導反式激活蛋白不再反式激活rheO啟動子。本發明所用的其它實施方案包括大腸桿菌的紅霉素抗性調節子，其含有對大環內酯抗生素，如紅霉素、克拉霉索和羅紅霉素起反應的阻抑(Eoff)和或誘導(Eon)系統(Weber等，2002)。Eoff系統利用紅霉素依賴型反式激活蛋白，其中提供大環內酯抗生素來阻抑轉基因的表達。在Eon系統中，阻抑子與操縱子結合導致轉基因表達的阻抑。而存在大環內酯蛤誘導了基因表達。Fussenegger等(2000)描述了采用天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的鏈陽性菌素抗性操縱子編碼的Pip(原始霉素誘導的蛋白質)阻抑子的阻抑和可誘導系統，此系統可對鏈陽性菌素類抗生素(如原始霉素、威里霉素和喹奴普丁)反應。例如，可將PipDNA-結合域與VP16的反式激活結構域，或與KRAB沉默結構域相融合。如以上所述，原始霉素存在或不存在都能以各自方式調節該PipON和PipOFF。轉基因表達系統的另一例子是利用密度感受系統(指顆粒性前核分子通訊系統，其具有可擴散性信號分子可防止阻抑子與操縱子位點結合，導致靶調節子脫阻抑)。例如，Weber等(2003b)采用含有天藍色鏈霉菌的密度感受受體與反式激活結構域結合的融合蛋白，來調節各自具有的該融合蛋可結合的操縱子的嵌合性啟動子。用無毒性的丁酰內酯，如SCB1和MP133來細調表達。在具體實施方案中，本發明采用功能上彼此相容的多重多基因治療性基因表達系統(見例如，Kramer等，2003)。例如，在Weber等(2002)中，采用大環內酯反應性紅霉素抗性調節子系統，結合鏈陽性菌素(PIP)調節的和四環素調節的表達系統。在本發明一具體實施方案中，用PolII啟動子調節轉基因(如示范性的siRMA)的表達(見例如，Shinagawa和Ishii，2003)。如在Shinagawa和Ishii(2003)的示范性系統中，產生的長dsRNA沒有5’-帽結構和3’-聚(A)尾，阻礙了此長dsRNA輸出到胞質中，從而阻礙了干擾素反應的誘導。雖然在此系統中，轉錄后加工受到在RNA起始位點(為去除5’-加帽)和MAZ位點(為PolII停頓)下游處加入順式作用錘頭核酶的調節，但這樣做的任何方法都屬于本發明的范圍。III.轉染將siRNA表達系統導入細胞或生物體中轉染是將核酸導入受體真核細胞中，然后將該核酸序列整合入染色體DNA中。有效的轉染需要載體，它能促進外源性核酸導入所需的細胞中，可提供染色體整合機制，和適當表達這些核酸編碼的性狀或蛋白質。設計和構建細胞轉染用的有效、可靠和安全的載體是本領域熟知的。本發明申請書中，能介導元件(a)、(b)和(c)輸送和基因組整合到靶細胞、組織或生物體內的任何載體都認為屬于本發明的范圍。許多類型的病毒構成了載體的基礎。所用的病毒常衍生自病原性種類的病毒，它們具有需要的性能和轉染細胞的能力。然而，不是所有的病毒者能成功轉染處在細胞周期所有階段的所有類型細胞。因此在開發病毒載體時，常需修飾病毒基因組以提高它們導入外源性基因構建物(轉基因)或其它核酸的能力和效果。同時，可導入修飾以減少或消除它們引起疾病的能力。因此，本發明可采用病毒，如逆轉錄病毒、痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；；Hermonat和Muzycska，1984)和皰疹病毒衍生的病毒載體。它們能賦予各種哺乳動物細胞幾種吸引人的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1998；Horwich等，1990)也可采用衍生自病毒，如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、仙臺病毒、巨細胞病毒和單純皰疹病毒的其它病毒載體。本領域所知的逆轉錄病毒載體可用于輸送siRNA表達構建物。見例如，Devroe和Silver(2002)(其內容納入本文作參考)證明逆轉錄病毒是輸送siRNA表達盒到哺乳動物細胞中的有效載體Barton和Medzhitov(2002)證明用逆轉錄病毒導入siRNA表達構建物導致原代細胞中基因的穩定性失活。慢病毒是逆轉錄病毒的一個亞組，由于其整合前復合體的親核性質可通過核孔輸入其活性形式，而能感染非分裂細胞。A.慢病毒載體慢病毒屬包括牛慢病毒族、馬慢病毒族、貓慢病毒族、羊慢病毒族和靈長類慢病毒族。用于基因治療的慢病毒載體的開發綜述見Klimatcheva等(1999)。適合于基因治療的慢病毒載體的設計和用法見例如美其名曰國專利6,531,123、6,207,455和6,165,782中所述(各專利內容納入本文作參考)。慢病毒的例子包括但不限于HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、貓關節炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧務病毒和牛免疫缺陷病毒。優選HIV-1。慢病毒載體可賦予基因療法很大優點。長期表達需要將它們穩定地整合入靶細胞的染色體中。另外，它們不會轉移病毒基因從而避免了產生可能被細胞毒T-細胞摧毀的轉導細胞問題。此外，它們具有相對較優大的克隆容量，因而有臨床適用性。慢病毒與其它逆轉錄病毒相反，能轉導非分裂懷細胞。這對于組織，如造血系統、腦、肝、肺和肌肉的基因治療非常重要。例如，衍生自HIV-1的載體可在體內或先體外后體內將轉基因輸送、整合到細胞，如神經元、肝細胞和肌細胞中并穩定表達(Blomer等，1997；Kafri等，1997；Naldini等，1996a；1996b)。慢病毒基因組和原病毒DNA具有3個逆轉錄病毒中所見的基因gag、pol和env，它們側國接有2個長末端重復(LTR)序列。Gag基因編碼內部結構(基質、包衣和核衣殼)蛋白pol基因編碼RNA指導的DNA聚合酶(逆轉錄酶)、蛋白酶和整合酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR的作用是啟動轉錄和病毒粒子RNA的聚腺苷酸化。LTR含病毒復制必須的所有其它順式作用序列。慢病毒含有的其它基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。毗連5’LTR的序列是基因組逆轉錄(tRNA引物結合位點)和病毒RNA有效包裹入顆粒(Psi位點)中所必須的序列。如果從病毒基因組中減去包裹(或逆轉錄病毒RNA包裝入感染性毒粒中)必須的該序列，此順式作用缺陷將阻止基因組RNA的包裹。然而，產生的突變體仍能指導所有毒粒蛋白的合成。慢病毒載體是本領域熟知的，見Naldini等，(1996a和1996b)；Zufferey等(1997)；dULL等，(1998)；美國專利6,013,516和5,994,136，它們的內容均納入本文作參考。通常，這些載體是質粒或病毒，結構中攜帶有摻入外源性核酸、選擇和將該核酸轉移到宿主細胞中所必須的序列。相應的，在體外和體內，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)衍生的慢病毒轉基因的有效輸送、整合入非有絲分裂細胞中并長時間表達(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)。逆轉錄病毒基因組中，也含有所有的必須順式作用元件的一個RNA分子，攜帶了所有的編碼序列。通過將編碼基各種組分的序列分配成為盡可能性多的獨立單元，以最大程度提高再創立復制活性重組體(RCR)所需的交換數，從而達到了載體產生系統的生物安全性。在宿主生產細胞，如293人胚腎細胞中共表達毒粒包裝元件和載體基因組產生了慢病毒載體顆粒。就HIV-1載體而言其毒粒的核心和酶組分來自HIV-1，而包膜蛋白衍生自異源病毒，最常用VSV病毒，因為其G蛋白穩定性高和嗜性廣。HIV的基因組復雜，全套基因編碼致病所必須的毒力因子，但可分散轉移病毒基因，這大大有助于開發臨床上可接受的載體系統。多功能減毒包裝系統現在通常只包含HIV-1九個基因中的三個gag，編碼毒粒的主要結構蛋白；pol，負責編碼逆轉錄病毒的特異性酶，和rev，編碼gag和pol有效表達所需的翻譯后調節子(Dull等，1998)。由于這種包裝系統缺失太多，親代病毒不可能重建，因為其基因組的約60％完全被去除。在一種版本的HIV包裝系統中，從4個分離的DNA單元產生了Gag/Pol、Rev、VSVG和載體。另外，載體和輔助序列之間的重疊減少到59個核苷酸使得發生同源重組的機會減至最低程度。基于HIV1型(HIV-1)的載體顆粒可通過在所謂生產細胞質如293T人胚腎細胞中共表達毒粒饈元件和載體基因組而產生。可用一些質粒瞬時轉染這些細胞。常用3-4種質粒，但數目可更多，取決于慢病毒組分破開進入不同單元的程度。通常，一種質粒編碼HIV-1衍生毒粒的核心和酶組分。此質粒稱為包裝質粒。另一質粒編碼包膜蛋白，最常是水皰口炎病毒的G蛋白(VSVG)，因為它穩定性高，嗜性廣。此質粒可稱為包膜表達質粒。還有一質粒編碼待轉運給靶細胞的基因組，即載體本身，稱為轉運質粒。通過此技術可產生每毫升數百萬轉導單位(TU/ml)滴度的重組病毒和及變體。超離心后可獲得大約109TU/ml的濃縮貯存液。載體本身只是一種轉移給靶細胞的遺傳物質。它通常含轉基因盒，側接有其包裹、逆轉錄、核輸入和整合所需的順式作用元件。如先前對致癌逆轉錄病毒所做的工作，制備的慢病毒載體是“自身滅活的”，一旦轉移到靶細胞中，它們即會喪失轉錄病毒長末端重復序列(LTR)的能力(Zufferey等，1998)。此種修飾進一步降低成本了出現復制活性重組體的危險，和避免了啟動子干擾相關的問題。這些載體或它們的組分，稱為SIN載體或含SIN的載體。進一步詳述此SIN設計見Zufferey等，1998和美國專利5,994,136，其內容納入本文作參考。B.轉錄后調節元件在某些實施方案，特別是涉及本發明具有合理活性的啟動子的慢病毒構建物實施方案中，可能需要增強轉基因的表達。一類翻譯后調節元件(PRE)是位于表達盒子中能刺激基因表達的內含子。然而，在慢病毒生命周期中可能剪去內含子。因此，如果內含子用作PRE，可能必須將它們安置在相對于載體基因組轉錄的相反朝向。在病毒生命周期中不依賴于剪接活動的翻譯后調節元件，優點是不會被除去。一些例子是單純皰疹病毒的翻譯后加工元件、乙肝病毒的翻譯后加工元件(HPRE)和美洲旱賴肝炎病毒的翻譯后加工元件(WPRE)。其中最優選WPRE，因為它含一個在HPRE中沒有的額外順式作用元件(Donello等，1998)。將此調節元件定位于載體包括在該轉基因的RNA轉錄物中，但在該轉基因翻譯單元終止密碼子的下游。如本發明和Zufferey等，1999所證明的那樣，WPRE元件是刺激和增強慢病毒載體中所需轉基因表達的有用工具。WPRE的特征鑒定和描述見美國專利6,136,597，其內容納入本文作參考。如上所述，WPRE是一種RNA輸出元件，能介導RNA從細胞核中有效地轉運到胞質中。它通過插入的順式作用核酸序列能增強轉基因的表達，因而可將該元件和轉基因包付諸東流在一個轉錄物內。以有義方向存在的WPRE顯示能提高轉基因表達7-10倍。逆轉錄病毒輸送cDNA形式的序列，而不是含完整內含子的基因，因為在導致形成逆轉錄病毒顆粒的一系列活動中，內含子通常被剪掉。內含子介導了原始轉錄物與剪接機制的相互反應。因為剪接機制對RNA的加工而促進了它的胞質輸出，由于剪接和轉運機制之間的偶聯，常駐機構不能充分表達cDNA。因此，在載體中加入WPRE可導致轉基因表達增加。在細胞核中導入外源核酸需要將該核酸通過核膜輸入到核中。慢病毒所用的活性核輸入系統，形成了它們在非分裂細胞中有效復制能力的基礎。這訓活性輸入系統依靠一系列復雜的活動，包括特異性調制逆轉錄。具體說，在HIV-1中，位于pol基因中的中央多聚嘌呤片段(cPPT)引起下游plus鏈的合成，同時也引起3’多聚嘌呤片段(PPT)的plus鏈合成。該短的DNA分子的鏈轉移后，上游plus鏈的合成將啟動并進行下去直到到達基因組的中心。在中央末端序列(cTS)處，HIV-1逆轉錄酶被排斥(從其模板上釋放出來)，以鏈置換方式發揮功能(Charneau等，1994)。純結果是在基因組中央形成長99個核苷酸的具有穩定下垂物的雙鏈DNA分子。這種中央“下垂物”有助于核輸入(Zennou等，2000)。IV.轉基因小鼠和其它轉基因動物產生轉基因小鼠所用的方法是該領域技術人員熟知的。例如，可采用題為“ManipulatingtheMouseEmbryo”1986，一書中的手工方法。例子見Leder和Stewart美國專利4,736,866中產生轉基因小鼠的方法。其它例子包括以下納入本文作參考的專利美國專利6,025,539，涉及IL-5轉基因小鼠；美國專利6,023,010，缺失成熟淋巴細胞類型的非人轉基因動物；美國專利6,018,098，皮膚光衰老的體內和體外模型；美國專利6,018,097，表達人胰島素的轉基因小鼠；美國專利6,008,434，生長分化因子-11轉基因小鼠；美國專利5,994,618，生長分化因子-8轉基因小鼠；美國專利5,986,171，檢查脊灰病毒神經毒性的方法；美國專利5,981,830，具有被破壞的hepsin基因的敲除小鼠和它們的子代；美國專利5,981,829，DELTA.Nur77轉基因小鼠；美國專利5,936,138，編碼能促進HIV感染的突變體L3T4蛋白的基因，和表達此蛋白的轉基因小鼠；美國專利5,912,411，四環素可誘導轉錄激活蛋白的轉基因小鼠；美國專利5,894,078，表達C-100app的轉基因小鼠(各專利內容納入本文作參考)。本領域眾所周知，在受精卵的核中，或在最終形成受精卵核部分的任何核遺傳物質中，安置或插入外源遺傳物質，可進行受精卵的遺傳轉化(產生胚胎和成熟的生物)。受精卵和此受精卵所產生的生物的基因型將包括該外源遺傳物質的基因型。此外，含有外源遺傳物質的受精卵將產生該外遺傳物質的表型表達。該外源遺傳物質的基因型表達在該受精卵分裂的細胞上。然而，該表型的表達，如產生蛋白產物或外源遺傳物質的產物，或受精卵或生物天然表型的變化，將發生在該受精卵或生物體發育中該具體外源遺傳物質被激活的時間點。表型表達的變化，包括表型表達的增加或減少，或表型啟動和/或控制的改變，包括加入新的啟動子和/或控制子，或補充加強了該表型的現有癖動子和/或控制子。美其名曰國專利4,873,191中公開并詳細描述了各種類型的基因轉化，其內容納入本文作參考。生物的遺傳轉化可用于分化期體內基因表達的分析，和采用基因療法或用非人轉基因哺乳動物作為人類疾病的模型系統來消滅或減少遺傳性疾病。此模型系統可用于測試推測的藥物在人體中的潛在治療價值。可將外源性遺傳物質置于成熟卵的核內。所述卵宜為受精卵或處在(通過孤雌生殖)活化期。加入外源性遺傳物質后，再加入能形成受精卵的一組互補性單倍染色體(如精子細胞或極體)。通過將受精卵植入假孕雌性動物使其發育成生物。分析所產生的生物外源性遺傳物質整合情況。如果確定有正常整合，該生物可用于據認為與某特定遺傳疾病相關的基因的體內表達分析。進行了利用這類轉基因動物研究多種不同類型遺傳疾病的嘗試。見例如WO89/06689和WO89/06693關于阿爾茨海默病的研究，其內容納入本文作參考。不同發育期限的胚胎靶細胞可用于導入轉基因。根據胚胎靶細胞的發育階段采用不同的方法。顯微注射的最好靶子是受精卵。雄性小鼠的前核當其大小達到約20微米直徑時，能容納1-2皮升DNA溶液的生殖性注射。利用受精卵作為基因轉移的靶主要優點是，在大多數情況下注射的DNA在第一次切除前可摻入宿主基因中(Brinster等，1985)。結果，所有的非人轉基因動物將攜帶該摻入的轉基因。這一般也反映在該轉基因能有效地優越性給該奠基動物的是后代，因為50％胚細胞含有此轉基因。受精卵的顯微注射是摻入轉基因的優選方法。也可利用逆轉錄病毒感染將轉基因導入非人動物。可在體外將發育的非胚胎培養到胚泡期。此期間的卵裂球可作為逆轉錄病毒感染的靶子(Jaenich，1976)。用酶處理去除透明帶可獲得對裂球的有效感染(Hogan等，1986)。用于導入轉基因的病毒載體系統一般是攜帶轉基因的復制缺陷型逆轉錄病毒，Jahner等，(1985)；VanderPutten等，(1985)。在單層能產生病毒的細胞上培養該裂球可容易有效地獲得轉染(VanderPutten，同上；Stewart等，1987)。或者，可在晚期進行感染。將病毒或病毒感染細胞注射入該裂球中(Jahner，1982)。大多數奠基動物是轉基因鑲嵌動物，因為轉基因工程的摻入只發生在一亞組細胞中，形成了非人轉基因動物。另外，奠基動物在基因組的不同部位可能含有各種逆轉錄病毒的轉基因插入物，通過會分離到后代中。此外，也可通過逆轉錄病毒宮內感染妊娠中期的胚胎，將轉基因導入胚細胞系中，雖然效率低(Jahner，1982)。用于導入轉基因的第三種靶細胞是胚胎干細胞(ES)。ES細胞可獲自體外培養的植入前胚胎并與胚胎融合(Evans等，1981；Bradley等，1984；Gossler等，1986；到Robertson等，1986)。通過DNA轉染功通過逆轉錄病毒介導的轉導，可有效地將轉基因導入ES細胞中。這樣轉化的細胞可與非人動物的胚泡組合。ES細胞然后定居在胚胎并歸并入所產生的嵌合動物的胚系中。綜述風Jaenisch，(1988)。如本文所用，“轉基因”是一種通過人的干預，如上述方法，引入到非人動物種系中的DNA序列。因此，在本發明的一具體方面，非人哺乳動物所具有的示范性轉基因含有編碼操作性連接于本發明KRAB阻抑結構域的四環素可調控或四環素類似物可調控的DNA結合域的多核苷酸序列，或該示范性轉基因編碼的siRNA操作性連接于啟動子和上述融合基因產物可結合的序列。含有二種轉基因(即編碼四環素可調控或四環素類似物可調控融合蛋白的轉基因，和含有連接有對該融合蛋白起反應的啟動子的轉基因)的雙重轉基因動物也包括在本發明中。一實施方案中，該轉基因動物園是小鼠。在其它實施方案中，該轉基因動物是奶牛、山羊、綿羊或豬。可通過在受精卵母細胞中導入編碼上述示范性轉基因的DNA分子，然后將該受精卵植入假孕養母中，使受精卵母細胞發育成非人轉基因動物，而產生非人轉基因動物。可通過二種轉基因動物的適當交配產生雙重轉基因動物。可通過給予本發明雙重轉基因動物四環素或四環素類似物，來阻抑連接含有一啟動子的siRNA(能對調節該啟動子的四環素或四環素類似物可誘導融合蛋白起反應)的表達。本發明另一具體方面涉及含有編碼本發明四環素或四環素類似物融合蛋白轉基因的非人轉基因動物，其中，所述轉基因通過同源重組整合入該動物細胞染色體中的預定位置(也稱為同源重組動物)。該同源重組動物也可含有第二種編碼操作性連接于對四環素或四環素類似物可誘導融合蛋白能起反應的siRNA的轉基因。此第二種轉基因被隨機導入染色體中，或在染色體預定位置導入(如同源重組)。可通過在胚胎干細胞群中導入本發明的靶向載體，產生在該動物細胞染色體DNA的預定位置貪大求含有整合的tTR-KRAB編碼序列的本發明非人轉基因動物，所用條件適合在編碼tTR-KRAB的DNA與細胞染色體DNA之間發生同源重組，選出其染色體DNA預定位置整合了編碼tTR-KRAB的DNA的胚胎干細胞，將該胚胎干細胞植入胚泡，再將該胚泡植入假孕養母中使該胚泡發育成非人轉基因動物，從而產生該非人轉基因動物。A.條件性轉基因動物本發明還考慮條件性轉基因或敲減動物，例如用重組方法產生這些動物。噬菌體P1Cre重組酶和酵母菌質粒的flp重組酶是位點特異性DNA重組酶的二個非限制性例子，它們能在特定的靶位點(Cre重組酶在loxP位點，flp重組酶在frt位點)切除DNA并催化該DNA與第二切除位點連接。已報導了許多合適的其它位點特異性重組酶，它們的基因可用于本發明的方法中。這類重組酶包括噬菌體λ(含或不含Xis)的Int重組酶(Weisberg等，1983，納入本文作參考)、Tpnl和β-內酰胺酶轉座子(Mercier等，1990)、Tn3解離酶(Flanagan和Fennewald，1989；Stark等，1989)、酵母菌重組酶(Matsuzaki等，1990)、枯草芽胞桿菌SpoIVC重組酶(Sato等，1990)、Flp重組酶(Schwartz和Sadowski，1989；Parsons等，1990；Golic和Lindquist，1989；Amin等，1990)、Hin重組酶(Glasgow等，1989)、免疫球蛋白重組酶(Malynn等，1988)和Cin重組酶(Haffer和Bickle，1988；Hubner等，1989)，所有均納入本文作參考。這類系統在(Echols，1990；deVillartay，1988；Craig，1988；Poyart-Salmeron等，1989；Hunger-Bertling等，1990；Cregg和Madden，1989)中有所報告，所有這些文獻內容納入本文作參考。本發明中特別令人感興趣的是Cre重組酶。將Cre純化至均一，并已廣泛特征鑒定了它與loxP位點的反應(Abremski和Hess，1984，納入本文參考文獻)。Cre蛋白的分子量為35,000，可購自NewEngl和Nuclear/DuPont。已克隆并表達了Cre基因(其編碼Cre蛋白)(Abremski等，1983，納入本文參考文獻)。Cre蛋白可介導存在于相同或不同DNA分子中的二個loxP序列之間的重組(Sternberg等，1981)。因為loxP位點的內部間隔序列不對稱，這二個loxP位點可能在方向上顯示彼此相關(Hoess和Abremski，1984)。因此當同一DNA分子上的二位點以直接重復方向存在時，Cre將切除二位點之間的DNA(Abremski等，1983)。然而，如果二位點彼此相反，重組后它們之間的DNA不會被切斷而是相顛倒。這樣，具有二個順方向loxP位點的環形DNA分子將會重組產生二個較小的環，而具有二個反向loxP位點的環形分子則簡單地顛倒了二個loxP位點側接的DNA序列。此外，當分開的DNA分子上存在靶序列時，重組酶的作用可導致遠離靶位點區域的相互交換。重組酶在特征鑒定敲除動物模型中的基因功能上有重要應用。當用本文所述構建物來破壞鱟凝血因子蛋白酶樣基因時，在鱟凝血因子蛋白酶樣基因翻譯起始點下游(3’)插入陽性選擇標記可產生融合轉錄物。該融合轉錄物可能導致某種水平的蛋白質表達后果不知。這提示陽性選擇標記基因的插入可影響附近基因的表達。這種影響使測定敲除后基因的功能變得困難，因為不可能分辨某給定表型是否與某基因的滅活或附近基因的轉錄相關連。通過利用重組酶的活性解決了這二個潛在問題。當陽性選擇標記側接有同樣取向的重組酶位點時，加入相應的重組酶將導致去除該陽性選擇標記。以這種方式避免了陽性選擇標記或融合轉錄物表達所引起的作用。B.轉基因敲減小鼠在某些方面，本發明考慮建立能顯示條件性敲減靶基因的轉基因動物的方法，敲減靶基因可以組織特異性方式進行，雖然不需要這樣。某基因的“敲減”可通過干擾突變基因轉錄為有害蛋白來實現。將此技術應用來創造其遺傳的RNAi能使靶基因表達降低或沉默的轉基因小鼠，從而產生穩定的“基因敲減”。為使RNAi適應小鼠基因功能的研究，采用基因工程法創立了小鼠胚胎干細胞，此干細胞中RNAi被靶向到一特定基因(Carmell等，2003)。其根據是先前通過RNAi使感興趣的基因沉默的研究，該研究采用工程改造的編碼對應于該感興趣基因的短發夾RNA分子有效實現了這種沉默(Carmell等，2003)。將這種干細胞注入胚胎中產生嵌合動物。這些嵌合性小鼠代交配，產生的后代體內每一個細胞都含有經基因工程程改造的RNAi誘導基因。通過檢查轉基因小鼠的組織觀察到，整個生物體內(如肝、心、脾)感興趣基因的表達顯著減少。基因表達的這種減少稱為“基因敲減(knockdown)”，以和傳統的涉及染色體中某DNA區段“基因敲除”，或完全缺失的方法相區別。此RNAi為基礎的基因敲減策略一個優點是，可修飾該策略使特定組織中的基因沉默，可設計使其在動物發育或成年期間任何時候打開或關閉。V.治療性應用本發明可廣泛用于各種需要能夠調節基因表達水平的情況，如以迅速、有效和可控制方式打開或關閉基因表達，而不引起多效作用或細胞毒性。本發明具體可用于人的基因治療目的，治療遺傳或獲得性疾病。基因治療的一般方法包括將一種或多種核酸分子導入細胞，在該細胞中產生導入的遺傳物質所編碼的一種或多種產物，以恢復或改變功能活性。基因治療方法的綜述見Anderson等，1992；Miller等，1992；Friedmann等，1989；和Cournoyer等，1990。然而，目前的基因治療載體通常使用能對內源性轉錄因子起反應的組成型調節元件。這些載體系統沒有能力調節患者的基因表達水平。相反，本發明的調節系統可提供情報此種能力。為基因治療目的采用本發明的系統，應至少將一種DNA分子導入需要基因治療的患者(如患有遺傳或獲得性疾病的患病)的細胞中以修飾該細胞。被修飾的細胞包括1)編碼本發明可誘導調節子的核酸，其形式適合在宿主細胞中表達該可誘導調節子；和2)操作性連接有誘導型調節子-反應性啟動子(如至少一個tet操縱子序列，任選的和最小啟動子)的siRNA(如為了治療目的)。可采用編碼本發明調節系統諸組分的一個DNA分子，或者，可采用編碼各個組分的不同DNA分子。可在活體外修飾患者的細胞后再導入該患者，或可采用在細胞中導入核酸的常規技術直接修飾體內的細胞。患者中存在Tc或Tc類似物時能刺激文藝患者細胞中感興趣siRNA的表達，而患者中不存在Tc或Tc類似物時阻抑基表達。在某些實施方案中，基因表達水平不同取決于采用那種Tc類似物作為誘導物。此外，可根據個體的醫療需要調節siRNA的表達，這可能在該個體的一生中有變化。因此，本發明的調節系統賦予了比組成型調節系統更好的優點，可使基因表達水平的調節依據治療情況的需要而定。為治療遺傳性或獲得性疾病患者細胞中要敲減或敲除的特別感興趣基因，包括編碼不良基因產物，如異常蛋白質的那些基因。非限制性特定疾病的例子包括甲狀腺機能亢進(這是一種與甲狀腺素分泌過多缺陷有關的疾病)和阿爾茨海默綜合征。基因治療的應用特別感興趣的在于癌癥治療，包括例如ABL1、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES等癌基因。本領域技術人員懂得，用本發明的方法和組合物治療癌癥可與其它其它形式癌癥相結合，如手術、化療、放療、基因治療、免疫治療等。治療的癌癥類型包括非限制性例子有膠質肉瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、子宮癌、膀胱癌、脾臟癌、頭頸癌和骨癌。本發明可用于開發治療目的的自身或同種異體細胞系。例如，在細胞和/或器官移植中利用本發明作特別感興趣的基因治療。在示范性實施方案中，下調移植抗原(如通過siRNA下調β-2-微球蛋白表達)使同種異體移植細胞盡可能免遭患者免疫系統的排斥。就副作用(移植細胞不受控制的復制)而言，本發明可關閉RNAi。可用于本發明的細胞類型包括造血干細胞、成肌細胞、肝細胞、淋巴細胞、氣道上皮細胞、皮膚上皮細胞、胰島、多巴胺能神經元、角質形成細胞等。用于基因治療的其它細胞類型、基因和方法的進一步說明見例如Wilson等，(1988)；Armentano等，(1990)；Wolff等，(1990)；Chowdhury等，(1991)；Ferry等，(1991)；Wilson等，(1992)；Quqntin等，(1992)；Dai等，(1992)；vanBeusechem等，(1992)；Rosenfeld等，(1992)；Kay等，(1992)；Cristiano等，(1993)；Hwu等，(1993)；Herz和Gerard，(1993)。在本發明的具體實施方案中，治療任何疾病的方法易于用siRNA治療。在具體實施方案中，該方法包括制備含有編碼操作性連接有外部可調控啟動子的siRNA的多核苷酸構建物，其中該構建物編碼的siRNA可治療疾病，并通過外部可調控的啟動子從外部調節該siRNA的表達。所述疾病可以是，例如過度增殖性疾病，如癌癥，具體的癌癥例子包括膠質肉瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、子宮癌、膀胱癌、脾臟癌、頭頸癌和骨癌。在其它實施方案中，所述疾病涉及與至少一種激素過度分泌相關的過度分泌缺陷病。具體例子包括甲狀腺素分泌過多(如格雷夫斯病)、糖皮質激素分泌過多(如庫欣綜合征)、生長激素分泌過多(如巨人癥或肢端肥大癥)、胰島素分泌過多、鹽皮質激素分泌過多(如醛固酮過多癥)、雄激素分泌過多(如雌性雄激素綜合征)、雌激素分泌過多(如女子乳腺和/或卵巢癌發病升高和男子女性乳房)、或腎上腺素和/或去甲腎上腺素分泌過多。上前分泌過多缺陷的治療可包括劇烈的治療措施，如切除腎上腺。本發明的優點是通過本文所述的方法和組合物的特異性調節能夠精細治療分泌過多。細胞免疫識別的控制為治療器官疾病和器官衰竭。在醫學上采用同種異體或非自身組織移植變得越發重要。然而，利用同種異體移植物受到受者對移植組織頻繁排斥的限制，因為供者與受者之間存在抗原性差異。同種族各成員之間的抗原差異稱為“同種抗原”。同種異體組織移植排斥時涉及的同種抗原稱為“組織相容性抗原”。術語“主要組織相容性抗原”和“主要組織相容性復合物”(MHC)指基因的一種密切相連區域的產物。這些MHC基因產物位于細胞表面，是成功進行同種異體移植的重要障礙。本領域技術人員知道，免疫防御機制的關鍵是T細胞。發現T細胞在對一種或數種與它們天然宿主的特異性移植抗原相關的抗原反應中受到限制。在體外，一種單倍型宿主的T細胞能對不同單倍型宿主移植抗原的相關抗原起反應。T細胞的受體庫看來比B細胞免疫球蛋白庫狹窄。此外，T細胞受體看來不能直接結合抗原，需要與抗原表位和移植抗原一起結合。本領域知道免疫移植抗原含有主要組織相容性復合物的成分。移植抗原可分成二類I類和II類，I類抗原比較遍布在宿主細胞上，而II類相對限制于淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。不同的T細胞可被一類或加一類移植抗原所激活。人類中，活化T細胞的性質隨與其互補的移植抗原類型而不同。在效果上，看來一個T細胞克隆只識別與特異性等位移植抗原相結合的一種特異性抗原。然而，當將T細胞、抗原和抗原提呈細胞一起培養時，抗原序列的變異會影響反應的性質。根據變化的性質，可遇到三種可能性，即無變化，刺激增強和刺激減弱。回顧以上所述，主要感興趣的是能夠調節體內外的免疫應答，能夠激活或滅活特定的免疫應答。以這種方式，可調節對某事物的天然應答，即通過活化特定淋巴細胞來增強保護性應答，或滅活特定淋巴細胞來降低或防止免疫應答。在優選實施例中，下調移植抗原可掩蓋該移植物的免疫原性。在具體實施方案中，本發明提供控制細胞被免疫系統識別能力的方法和組合物。這樣，本發明可提供至少一種可移植但不會引起免疫應答危險的細胞。在本發明一具體方面，產生的一種或多種細胞其MHC以可控制的方式已被敲減。如果細胞的MHC被敲減，在某些實施方案中，該細胞上的至少主要的MHC抗原基本上都缺少。因此，該細胞缺少組織相容性抗原使其不能補識別為外源性抗原。本領域技術人員懂得，利用本發明的可調控性能，臺去除外部施加的藥物即廢棄外部施加的藥物，再從外部施加藥物，加入更多的外加藥物等等，可用來結束這種需要。因此能夠掩蓋細胞避開使移植不易進行的免疫應答是本發明的優點，利用本發明的可逆方式也是特別有益的。在本發明的具體實施方案中，在調節基因產物時使全部或基本上全部的MHCI類復合物缺失，可控制免疫系統識別的能力。例子包括β2-微球蛋白復合體中的β2-微球蛋白分子，和/或功能類似β2-微球蛋白的分子。在具體實施方案中，擴本發明方法下調I類或II類，或二者移植抗原。在加一具體實施方案中，下調NHCI移植抗原，如β2-微球蛋白。移植抗原的其它例子包括HLA，其中包括HLA-C、HLA-G和HLA-DQ；H-Y；P35B；Kdm4和Kdm5、TL、P198、P91A；H-2Kb等。本文中可用于本發明的細胞包括，例如干細胞(如胚胎干細胞)、胰島細胞、肝細胞、多巴胺能神經元、角質形成細胞或它們的混合物。在本發明的具體實施方案中，用本發明的方法，如敲減移植抗原如β2-微球蛋白來修飾干細胞，如胚胎干細胞。修飾干細胞然后分化。在另一具體實施方案中，在分化之前或之后修飾干細胞，或移植。VI.人類疾病的動物模型可單獨或聯用本發明的方法和組合物來刺激或阻抑動物特定基因的表達，或模擬人類疾病的病理機制，從而創立人類疾病的動物模型。例如在宿主動物中，參與疾病的感興趣基因可能是本文所述siRNA的靶子。在示范性實施方案中，一種動物可與第二種動物交配，該第二種動物攜帶有一種或多種能調節siRNA表達的誘導型融合蛋白的轉基因，以創立含有四環素或四環素類似物調節的融合蛋白基因和表達受其影響的siRNA二者的后代動物。可利用四環素或四環素類似物調節的融合蛋白下調該siRNA靶的基因的表達，以研究基因表達與疾病之間的關系。此方法優于同源重組基因“敲除”所產生的疾病動物模型，因為本所述示范性實施方案的tet-調節系統，能控制感興趣基因的表達水平，又能在基因表達時下調或上調其水平。VIII.實施例以下實施例顯示了了本發明的優選實施方案。本領域技術人員理解這些實施例中公開的技術代表了發明人公開的技術，按照這些技術能很好實施本發明，因此認為此技術構成了實施本發明的優選模式。然而，本領域技術人員應知道，憑借此公開的內容，可在具體實施中做出許多修改而仍能獲得類似結果，但這些修改不脫離本發明的思路和范圍。實施例1強力霉素通過tKRAB介導阻抑siRNA產生而誘導GFP表達的調節在該系統的這個例子中，將元件(a)、(b)和(c)摻入慢病毒載體中。反式阻抑子(tTR-KRAB)由融合到人Kox-1的KRAB阻抑結構域的四環素阻抑子tTR的DNA結合域構成。tTR-KRAB的表達受組成型EF-1α啟動子的控制。將tet0(四環素操縱子)序列、U6或H1啟動子、sihRNA插入慢病毒載體3’長末端重復序列的U3區。在靶細胞中，此元件由于逆轉錄調制存在于整合的原病毒二端LTR中，從而復制了該3’LTR的U3區(圖1)。沒有強力霉素時，tTR-KRAB結合tet0并阻斷sihRNA合成，使sihRNA靶基因(例如感興趣的基因))得以表達。存在強力霉素時，tTR-KRAB從tet0中釋放出來，產生sihRNA，靶基因的表達受到阻抑。圖2提供的數據(類似于圖5C所示)說明利用上述系統可調節GFP標記蛋白的表達。用攜帶有tet0和GFP-特異性sihRNA(pNGFP-siGFP/tet0，或pNGFR-siGFP/tet0inv，或pNGFR-siGFPinv/tet0，或pNGFR-siGFPinv/tet0inv)的慢病毒載體，和攜帶有在EF-1α啟動子轉錄控制下的tTR-KRABcDNA(pWPXL-KRAB)的慢病毒，共轉導組成型表達的GFP(Hela-GFP)。在存在強力霉素時，GFP的表達受到顯著阻抑，反映了tTR-KRAB從tet0中釋放和GFP-特異性shRNA的合成。相反，在沒有強力霉素時，tTR-KRAB與tet0結合導致阻抑sihRNA的合成，而使GFP得以表達。此資料證明，本發明的系統可用于有效和特異性調節內源或外源基因。這里用的GFP報道基因相當于內源基因，因為它已整合到細胞染色體中。另外，已知內源基因控制病毒載體通過siRNA的表達是有效的(如Devroe和Silver，2002)。實施例2材料和方法以下用于實施3的材料和方法，可用于實施本文所述的本發明這施方案。載體構建物采用標準的克隆方案構建載體。pSUPER和pSUPER-p53如前所述構建(Brummelkamp等，2002)。將pSUPFR的H1啟動子插入pWPXL的3’LTR中構建pLV-H。為構建pLVTH，從pUHD13-3切下tet0盒克隆入H1啟動子上游的pLV-H中。最后，用切取自pSUPER-siRNA的H1-siRNA盒替代pLV-H和pLV-TH中的H1啟動子盒，分別產生pLY-H/siRNA和pLV-TH/siRNA。將編碼tTR-KRAB的序列克隆入pWPXL替代的GFP標記(pLV-tTR-KRAB)，或利用腦心肌炎病毒的5’內部核糖體進入位點(IRES)，作為雙順反子單元也編碼dsRed。細胞培養和用慢病毒轉導將293T、Hela和MCF-7細胞系培養在添加了10％胎牛血清的DEME中。按標準方案用瞬時轉染的293T細胞產生所有的重組慢病毒(Zufferey等，1997)。簡而言之用20微克質粒載體、15微克pCMV-ΔR8.91和5微克pMD2G-VSVG，以磷酸鈣沉淀法反轉染亞鋪平的293T細胞。16小時后更換培養液，24小時后收獲重組慢病毒。為了分析GFP的調節，采用含有單拷貝WPXLGFP原病毒的Hela細胞克隆(Hela-GFP)。為轉導，將Hela-GFP、MCF-7或Hela細胞接種在24孔板中(20×104細胞/孔)，16小時后，加入含重組慢病毒的培養液。培養16小時后，洗滌細胞分成二份，一半轉導細胞中加入最終濃度5μg/ml的強力霉素。5天后收獲細胞用FACS分析。Western印跡分析在含有蛋白酶抑制劑(Sigma)的RIPA裂解緩沖液(25mMTrispH7.5，1％TritonX-100，0.5％脫氧膽酸鈉，5mMEDTA，150mMNaCl)中制備細胞提取液。在4-20％梯度PAGE-SDS凝膠上分離蛋白質樣品(10μg)，電泳轉移到聚偏氟乙烯膜上，接觸抗p53(SantaCruzBioltechnology)、核纖層蛋白A/C(SantaCruzBioltechnology)、GFP(Clontech)和肌動蛋白(Calbiolchem)抗體。檢測采用偶聯有辣根過氧化物酶的抗體(Amersham)和增強的化學發光抗體(EFL；Amersham)。FACS分析收獲的Hela-GFP細胞用攜帶ΔNGFPcDNA的慢病毒載體轉導，與標記了藻紅NGFR-PE)的抗人NGFP特異性單克隆抗體(BectonDickinsonPharmingen)一起培育，洗滌二次，用FACSscan(BectonDickinson)分析氯熒光(GFP)和紅色熒光(NGFP-PE)。用LV-THsi/p53或LV-This/核纖層蛋白和Plv-tTR-KRAB-Red共轉導MCF-7和Hela細胞，在存在或不存在dox下培養，收獲并用FACSscan分析氯熒光(GFP)和紅色熒光(NGFP-PE)。免疫熒光用LV-This/p53或LV-THsi/核纖層蛋白和Plv-tTR-KRAB-Red共轉導MCF-7和Hela細胞，在存在或不存在dox下培養5天，用醛固定(10分鐘/-20℃)，用PBS/1％BSA封閉，抗p53(SantaCruzBioltechnology)或抗核纖層蛋白A/C(SantaCruzBioltechnology)抗體染色，第二抗體為偶聯有Alexa633(MolecularProbe)的抗體作分析。用三色共焦顯微鏡(LSM510CarlZeiss)拍照，用Zeiss軟件分析。實施例3結果和討論此研究利用四環素可調控雜交蛋白，tTR-KRAB的優良特性，此蛋白質中大腸桿菌Tn10的四環素阻抑子(tTR)融合于人Kox1的KRAB結構域(Deuschle等1996；Gossen和Bujard，1992)。KRAB是見于許多鋅指蛋白中的大約長75個氨基酸的轉錄阻抑調制物，可以取向不依賴型方式阻抑距其結合位點遠達3kb的polII-和polIII-介導的轉錄，推測是觸發形成了異質染色體(Bellefroid等，1991；Deuschle等，1995；Margolin等，1994；Moosmann等，1997；Senatore等，1999)。當KRAB連接于tTR的DNA結合域時，可調節整合的與tet操縱子(tet0)序列(6)并列的啟動子的轉錄。在沒有強力霉素(dox)時，tTR-KRAB與tet0特異性結合，阻抑附近啟動子的活性。相反，存在強力霉素時，tTR-KRA脫離與tet0的螯合，使基因工程能夠表達(Deuschle等，1995)。采用HIV-1衍生的慢病毒載體(LV)作為輸送載體，因為它可提供能應用于廣泛類型靶細胞的系統，即先體外后體內(細胞系、原代細胞如干細胞、受精卵母細胞、胚泡)或體內(如腦、肝)(Jacque等，2002；Miyoshi等，1999；Naldini等，1996a；1996b；Pfeifer等，2002；Qin等，2003；Rubinson等，2003；Tiscornia等，2003)；并且，由于tet0連接的轉錄單元只在整合入基因組中時才受tTR-KRAB的阻抑。從作為雙順反子轉錄物(其也可產生dsRed標記)一部分的遍在活性EF-1-α啟動子表達tTR-KRAB式Cdna(圖3A，LV-tTR-KRAB)。將tetO-H1啟動子-siRNA盒插入自身滅活慢病毒載體3’長末端重復序列(LTR)的U3區中，構建成可調控的siRNA(圖3A，LV-THsi)。逆轉錄中，載體RNA3’U3區作為合成其5’DNA同源物的模板，因而在整合的原病毒中復制該tet0-H1-siNA盒(圖3)。選擇這種雙拷貝構型可獲得較高速率的siRNA合成。如Brummelkamp等，2002所述設計了含編碼siRNA發夾前體的序列。對照載體攜帶有組成型活性的Hi-siRNA盒(LV-Hsi)，或H1或tet0-H1轉錄元件，無下游siRNA編碼序列(分別為H1和tet0-H1)。所有的siRNA和對照載體也含內部EF1-α啟動子下游的編碼標記的基因。預測用LV-THsi和LVtTR-KRAB共同轉導的細胞在保持無dox時，由于tTR-KRAB介導的對siRNA合成的阻抑，通常表達siRNA靶向的基因。相反，加入強力霉素將減輕其阻抑，從而下調靶基因(圖4B)。該內部標記基因的表達也受條件性tTR-KRAB的阻抑，因此提供了一種內部監控裝置。5C說明在慢病院載體中聚合酶III-介導的tTR-KRAB轉錄阻抑不依賴于tet0元件或聚合酶III啟動子(HI)彼此的取向及與慢病毒的取向。在第一系列實驗中，研究了該系統調節穩定表達此熒光分的Hela細胞中的GFP產生(5A)。采用感染復數10的載體以確保良好的(共)轉導率。用空LV-TH載體轉導的Hela-GFP細胞在各自培養條件下保持了GFP強陽性。相反，用組成型活化LV-His/GFP載體轉導的細胞表明出該標記的強烈下調。用可調控的LV-THsi/GFP載體轉導的細胞，只存在tTR-KRAB和缺少dox時觀察到GFP表達(圖5A)。相應的，缺少強力霉素時，tTR-KRAB阻抑了該載體的ΔNGFP內部報告基因的表達(圖5B)。如預期那樣，tTR-KRAB介導的對siRNA產物的阻抑效果，不論tet0以有義或反義取向插入H1啟動子上游或下游時相等。其次，測試了該系統能否調節真正的內源性基因。選擇p53和核纖層蛋白作為靶子，因為先前已鑒定和周全特征分析了siRNA能高效靶向這些基因(Brummelkamp等，2002；Elbashr等，2001)。采用MCF-7乳癌細胞作為p53下調研究的底物(圖6，左)。用LV-tTR-KRAB和LV-THsi/p53共轉導的細胞，在缺少dox培養時產生了野生型水平的p53，表明siRNA的合成全部阻抑(下圖泳道7)。tTR-KRAB介導了這種阻抑，因為在僅用LV-THsi/p53轉導的細胞中未測到p53，不論dox是否存在培養液中(上圖，泳道7和8)。相反，加入強力霉素到該雙重轉導的細胞中，導致p53產生速率下調，如在含有組成型活化的LV-THsi/p53載體的細胞中觀察到的那樣強(比較下圖泳道8和二圖的泳道5與6)。用相應的siRNA慢病毒載體轉導的Hela細胞中核纖層蛋白獲得類似結果(圖6)。值得注意的是，二種設置中，強力霉素誘導的siRNA產物，不論用Western印跡(圖6)、FACS或共焦顯微鏡觀察，都阻抑了p53或核纖層蛋白靶基因的表達，這與慢病毒載體內部GFP標記的阻抑相關。綜合在一起，這些結果表明，tTR-KRAB調節的、慢病毒載體介導的siRNA輸送能以高效和無遺漏地可調控性阻抑細胞的基因表達。為完成此系統的特征鑒定，確定了其動力學和劑量反應性(7)。選擇p53作為這種分析研究靶子是因為此蛋白的半衰期限相對較短為12小時左右。在用LV-THsi/p53和LV-tTR-KRAB載體雙重轉導的MCF-7細胞中，p53的穩定狀態水平面早至培養液中加入5μg/mldox后12小時就開始下降，36小時內用Western印跡法已測不到(圖7A)。這提示RNA干擾在24小時不到時完全有效，意味著dox介導的tTR-KRAB螯合快速地分離，從而使整合的H1啟動子高速產生siRNA產物。劑量反應分析進一步揭示對強力霉素控制極其敏感，同時點出基因阻抑的某些調節可能性。的確dox低濃度0.004μg/ml時已顯示p53下調，而僅在0.25μg/ml劑量即達到了全部阻抑(圖7B)。此實驗中所用的抗p53siRNA抗體很有效，用較低特異性的siRNA時，更大范圍的dox濃度可調節基因敲減的程度。實施例4條件性基因敲減動物(Ckd)本發明涉及應用慢病毒載體介導的和藥物誘導的RNA干擾來開發基因敲減動物。提供的技術包括以下系統四環素反式阻抑子(tTR-KRAB)介導的聚合酶III活性的藥物誘導型調節；和慢病毒介導的轉基因。主要策略包括(1)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉導受精卵母細胞(通過卵黃周圍注射)，然后將其轉移到代孕母體子宮內；(2)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉導受精卵母細胞(去除卵黃帶后)，使其在體個成熟為胚泡轉移到代孕母體子宮內(3)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉導桑椹胚或胚泡，使其成熟和/或轉移到代孕母體子宮內；和(4)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉導胚胎干細胞(ES)然后將其注射入胚泡轉移到代孕母體子宮內。由于高效和沒有嵌合現象，第一代方法是本發明優選的。在發育或成年的任何時期可通過給予強力霉素誘導基因敲減。實施例5利用轉基因tTR-KRAB小鼠產生條件性敲減小鼠實施例4中所述的策略也可應用于產生tTR-KRAB轉基因動物，然后可利用此動物以tet-可調控siRNA載體進一步轉基因。因此，為了促進cKD小鼠的產生，創立了表達tTR-KRAB的轉基因小鼠。用LV-tTR-KRAB-deRed慢病毒載體轉導受精卵母細胞(通過卵黃周圍注射)，然后轉移到代孕母體子宮壺腹部。此法不需要共轉導這樣大量的運作表型，因為分離自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞或胚泡可用上述(實施例4)方法以tet0-siRNA慢病毒載體轉導。然而，可從tTR-KRAB小鼠分離ES細胞或任何其它類型細胞并用tet0-siRNA載體轉導，以分析在條件性基因下調后的表型。實施例6組織特異性可條件性敲減的動物也可擴大本發明來獲得以組織特異性方式的可條件性基因敲減。此情況為分析具體細胞類型的敲減表型，或基因敲減對生物整體是否有致死作用是特別需要的。將側接loxP位點的填充片段(floxed)插入可調控H1聚合酶III啟動子中防止下游shRNA的合成(圖8和9)。轉基因小鼠的產生，例如可通過轉導從表達在組織特異性啟動子轉錄控制下的Cre重組酶轉基因小鼠挽回的受精卵母細胞(通過卵黃周圍注射)，然后將其植入代孕母體中。由于Cre和填充片段被去除，從而激活了H1啟動子，使條件性shRNA合成限于該特定組織。在某些特定情況時可采用條件性Cre(如與三苯氧氨可誘導核定位信號偶聯)。也可利用標記基因作為填充片段來監測組織特異性切除的效率。實施例7調節組織特異性敲減小鼠中的靶基因本發明研究了對條件性基因敲減小鼠(其基因敲減是組織特異性的)中的基因調節。因此，例如，采用攜帶編碼在組織特異性啟動子轉錄控制下感興趣基因的cDNA的tet0慢病毒載體(如LV-TH)，來轉導獲自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞。給予藥物以組織特異性方式調節雙重轉基因小鼠中的靶基因。實施例8用tTR-KRAB小鼠進行組織特異性條件性基因表達本發明還可延伸至動物中的條件性基因置換。其中在慢病毒載體中導入靶基因的突變型(圖10)。該突變型因在其DNA序列中插入了沉默突變而能抵抗RNA干擾。此系統的此種特異性調制導致以下情景缺少強力霉素時，siRNA的的合成及突變基因的表達受到tTR-KRAB的阻抑。相反，存在此藥物時通過RNAi和突變等到位基因的表達導致敲減野生型基因的表達。因此，可通過條件性阻抑野生型等位基因可分析野生型背景中的隱性突變表型。實施例9體外和體內通過tTR-KRAB的強力霉素誘導型調節外源基因表達此實施例是關于本文已有描述的tTR-KRAB的產生，條件性轉基因動物的產生，組織特異條件性轉基因動物的產生，和例如通過調節外源基因的表達進行原位條件性表達。本領域技術人員知道，本文所述方法和組合物可用于治療目的，如基因治療，來阻抑至少一種細胞的免疫識別，以治療癌癥等)及提供研究基因功能的有用方法。在具體實施方案中，這可通過該系統和本文所述的其各自方法對外源基因表達進行調節而實現，。通過開發能組成型表達tTR-KRAB的轉基因小鼠，可大大促進本文所述的策略。可采用常規方法(如ES細胞的原核注射或轉染)或慢病毒介導的轉基因，產生tTR-KRAB小鼠。例如，該tTR-KRAB小鼠可作為一種“通用平臺”來條件性表達感興趣的基因。本發明因此采用tet0慢病毒載體(如pLVTH)來輸送編碼感興趣基因的cDNA到tTR-KRAB小鼠中。此轉基因的表達將受到位于該載體上游的啟動子特性的控制，并受加入的外部藥物控制(如至少一種藥物)。利用tTR-KRAB小鼠將確保對每一個轉導細胞中感興趣基因的調節。在另一實驗中，采用攜帶有編碼感興趣基因cDNA的tet0慢病毒載體(如LV-TH)來轉導獲自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞，然后將其植入代孕期母體中。給予藥物進行研究雙重轉基因小鼠中靶基因的調節。感興趣基因的表達可以是(a)完全性的(如果是組成型啟動子表達該轉基因，基本上包括該小鼠的每一個細胞)；(b)組織特異性的(如果由組織特異性啟動子表達該轉基因)；(c)局部性的(如局部注射到特定器官或器官某區域中，給予含藥物可調控轉基因盒的載體)。以于(a)和(b)，可利用tTR-KRAB小鼠作基礎，通過輸送含有位于組成型或組織特異性啟動子下游的感興趣基因表達盒，來產生雙重轉基因小鼠(利用常規或慢病毒載體介導的轉基因)。本發明方法優于現有方法的一個主要改進是，得以藥物可調控組織特異性表達轉基因。圖11涉及藥物可調控轉基因的代表性實施方式，其中提供了含示范性TR-KRAB的小鼠，和編碼感興趣基因的多核苷酸(示為基因X，雖然該多核苷酸本身可能不是基因)，例如，將受遍在性啟動子控制的(左上圖)，或受組織特異性啟動子控制的(右上圖)多核苷酸導入TR-KRAB小鼠，進行外部藥物可調控的敲減感興趣的基因(表達)。實施例10體外通過tTR-KRAB介導的對siRNA產生的阻抑強力霉素誘導型調節細胞的基因表達此實施例是關于采用本發明的方法和組合物產生本文所述的tTR-KRAB細胞系和產生條件性siRNA文庫。本發明可用來開發能夠高通量研究，例如基因功能、藥物試驗(例如分析在缺少細胞基因時藥物的功能)等的siRNA文庫。通過開發組成型表達tTR-KRAB或類似的轉基因的細胞系，可能極有利于下述策略。可用本文所述的慢病毒載體(如pLV-tTR-KRAB)或其它載體產生tTR-KRAB細胞系。可將該tTR-KRAB細胞系作為“通用平臺”來條件性表達細胞的基因。因而本發是采用tet0慢病毒載體(如pLVTH)來輸送siRNA(或siRNA文庫)到tTR-KRAB細胞中。然后給予藥物下調細胞的基因(表達)。采用至少一種tTR-KRAB細胞系來保證基本上每一個被轉導細胞中感興趣基因受到調節。利用條件性文庫能定時、短期下調基因表達，從而避免可能的致死作用。另外，阻抑此可能的致死作用將擴增和增殖所選擇的細胞，用于進一步研究。因此，產生基因敲減的細胞系可用于，例如，治療目的(如基因治療)、藥物篩選和研究基因功能。臨床應用siRNA的安全裝置也具有本發明這種和類似實施方式的優點。在本發明一具體實施方案中，可用此法和組合物來開發用作治療的自身或同種異體細胞系。如下調移植抗原(如一實施例中，通過RNAi下調β2-微球蛋白的表達)將得以移植同種異體細胞(如非限制性的胰島細胞、肝細胞、多巴胺能神經元、角質形成細胞等)，同時最大程度減少被患者免疫系統排拆的危險。本發明能在發生不良反應時(如植入細胞不受控制的復制)關閉RNAi。實施例11體內通過tTR-KRAB介導的對siRNA產生的阻抑強力霉素誘導型調節細胞的基因表達此實施例是關于體內產生示范性tTR-KRAB小鼠，產生條件性敲減轉基因小鼠，產生組織特異條件性敲減LFNADLD小鼠，產生條件性siRNA文庫，和產生含有tTR-KRAB的ES細胞系(ES-tTR-KRAB)。圖11涉及藥物可調控敲減的代表性實施方式，其中提供了含示范性TR-KRAB的小鼠，和編碼siRNA的多核苷酸，例如，將受遍在性PolIII啟動子控制的(左下圖)，或受組織特異性PolIII啟動子控制的(右下圖)多核苷酸導入TR-KRAB小鼠，進行外部藥物可調控的敲減其表達。在某些實施方案中，本發明采用tet0慢病毒載體(如pLVTH)輸送siRNA靶向的感興趣細胞基因到tTR-KRAB小鼠中。然后給予藥物使siRNA合成并下調基本上每一個被轉導細胞中該感興趣細胞基因的表達。如實施例10條件性阻抑外源基因所述，條件性下調細胞基因可以是完全性的、組織特異性的或局部性的。能夠通過給予藥物來激活RNAi可避免基因敲減可能引起的致死作用而得以研究發育晚期或成年期的基因功能。然而，該條件性RNAi得以分析基因敲減的直接作用，最大程度減少基因功能長期喪失可能發生的繼發作用或代嘗。此系統可用于產生模擬人類遺傳缺陷的動物模型。條件性RNAi允許產生體內的siRNA文庫。可通過慢病毒載體(如pLVTH)輸送siRNA文庫來轉導分離自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞。或者，可通過慢病毒載體(如pLVTH)輸送siRNA文庫來轉導ES-tTR-KRAB細胞。該條件性系統能預防RNAi可能的早期致死作用，得以從而得以研究細胞基因敲減對發育或成年的影響。此外，阻抑基因功能喪失的潛在致死作用得以植入、擴增和增殖該小鼠ES細胞文庫存(或選擇有克隆)用于進一步研究。*********憑借本文所公開的內容，無須過多實驗即可制備本文所述和權利要求所述的所有組合物和/或方法。雖然本發明的組合物和方法已在優選實施例中作了描述，但是本領域技術人員懂得，可對本文所述的組合物和/或方法及其各步順序做出各種變化，這不脫離本發明的概念、思路和范圍。更具體說，顯然某些相關的化學或生理性藥物可替代本文所述的藥物而能匹敵相同或相似的結果。本領域技術人員懂得，所有這些相似的替代和修飾都應認為屬于本發明所附權利要求書中所確定的思路、范圍和概念之內。參考文獻以下是特別納入本文中作參考消息的文獻，除未列出的那些以外。美國專利4,683,202美國專利4,736,866美國專利4,873,191美國專利4,873,316美國專利5,654,195美國專利5,665,577美國專利5,894,078美國專利5,912,411美國專利5,925,565美國專利5,928,906美國專利5,935,819美國專利5,936,138美國專利5,981,829美國專利5,981,830美國專利5,986,171美國專利5,994,136美國專利5,994,618美國專利6,002,066美國專利6,013,516美國專利6,018,097美國專利6,018,098美國專利6,023,010美國專利6,025,539美國專利6,136,597美國專利6,165,782美國專利6,207,455美國專利6,340,741美國專利6,444,871美國專利6,531,123PTC申請WO00/44914PTC申請WO01/36646PTC申請WO01/68836PTC申請WO99/32619PTC申請WO89/06689PTC申請WO89/06693歐洲專利申請264,166Abremski和Hess.JMolBiol.，2591509-1514，1984Abremski等，Cell.，321301-1311，1983Akkina等，J.Virol.，702581-2585，1996Altschul，Proteins.32(1)88-96，1998Altschul等，TrendBiochem.23(11)444-7，1998Amin等，JMolBiol.，21455-72，1990AndersonW.F.，Science.256808-813，1992Angel等，MolCellBiol.，72256，1987Angel等，Cell.49729，1987bAngel等，MolCellBiol.，72256，1987aArmentano，D等，ProcNatlAcadSci.USA.876141-6145，1990Atchison和Perry，Cell，46253，1986Atchison和Perry，Cell.48121，1987Atchison等，Cell，46253，1986Atchison等，Cell.48121，1987Ayer等，MolCellBiol.，165772-5781，1996Baichwal和Sugden，選自GeneTransfer，Kucherlapati(編)，NewYork，PlenumPress，117-148，1986.Baim等，ProcNatlAcadSci.USA.，885072-5076，1991.Banerji等，Cell.27(2Pt1)299-308，1981.Banerji等，Cell.33(3)；729-740，1983Barton和Medzhitov，ProcNatlAcadSci.USA.，9914943-14945，2002Bellefroid等，ProcNatlAcadSci.USA.，883608-3612，1991Berkhout等，Cell.59273-282，1989.Blanar等，EMBOJ.，81139，1989.Blomer等，JVirol.，716641-6649.，1997.Bodine和Ley，EMBOJ.，62997，1987Boshart等，Cell.41521.，1985.Bosze等，EMBOJ.，5(7)1615-1623.，1986.Braddock等，Cell.58269，1989.Bradley等，Nature.309255-258，1984.Brinster等，ProcNatlAcadSci.USA.，824438-4442.，1985Brown等，Cell.49603-612，1987Brummelkamp等，Science.296550-553，2002.Bulla和Siddiqui，J.Virol.，621437，1986Byrne和Ruddle.，ProcNatlAcadSci.USA.，865473-5477，1989Calame和Eaton，AdvImmunol.43235-275，1988.Campell和Villarreal，MolCellBiol.，81993，1988Campere和Tilghman，GeneandDev.3537，1989Campes和Tilghman，GeneDev.3537-546，1989Campo等，Nature.30377，1983.Carbonelli等，FEMSMicrobiollLett.，177(1)75-82，1999Camell等，NatStructBiol.，10(2)91-92，2003Celander和Haseltine，JVirology，61269，1987.Celander等，JVirology，621314，1988Chandler等Cell，33；489，1983Candler等，ProcNatlAcadSci.USA.，94(8)3596-601，1997.Chang等，MolCellBiol.，92153，1989Charneau等，MolBiol.241651-662，1994.Catterjee等，ProcNatlAcadSci.USA.，869114，1989.ChowdhuryJR等，Science.2541802-1805，1991Cocea，Bioltechniques.23(5)814-816，1997.Cohen等，JCellPhysiol.，575，1987.Corbeau等，ProcNatlAcadSci.USA.，9314070-14075，1996Costa等，MolCellBiol.，881，1988.Coupar等，Gene.681-10，1988Cournoyer，D等，Curr.OpinBioltech.1196-208，1990Craig，AnnRevGenet.，2277-105，1988.Cregg和Madden，MolGenGenet.，219320-323，1989Cripe等，EMBOJ.，63745，1987CristianoRJ等，ProcNatlAcadSci.USA.，902122-2126，1993Culotta和Hamer，MolCellBiol，91376，1989Cultraro等，MolCellBiol.，172353-2359，1997DaiY等，ProcNatlAcadSci.USA.，8910892-10895，1992.Dandolo等，JVirology.，4755-64，1983deVillartay，Nature.335170-174，1988DeVilliers等，Nature.312(5991)242-246，1984Deschamps等，Science.2301174-1177，1985Derschle等，ProcNatlAcadSci.USA.，865400-5405，1989Deuschle等，Science.248480-483，1990Deuschle等，MolCellBiol.，151907-1914，1995Devereux等，NucleicAcidsRes.，12(1)387，1984Devroe和Silver，BMCBiotechnol.，2(1)15，2002Donello等，JVirol，725085-5092，1998Dull等，JVirol.，728463-8471，1998Echols，JBiollChem.，26514697-14700，1990Edbrooke等，MolCellBiol.91908，1989Edlund等，Science.230912-916，1985Elbashir等，Nature.，411494-498，2001Epstein等，MolCellBiol.184118-4130，1998Evans等，Nature.292154-156，1981Feng和Holland，Nature.3346178，1988FerryN等，ProcNatlAcadSci.USA.，888377-8381，1991Figge等，Cell.52713-722，1988Firak和Subramanian，MolCellBiol.，63667，1986Flanagan和Fennewald，JMolecBiol.，206295-304，1989Foecking和Hofstetter，Gene.45(1)101-105，1986Friedman等，GeneDev.10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述的系統，其中，所述組織特異性啟動子是肝脂肪酸結合(FAB)蛋白基因啟動子、胰島素基因啟動子、transphyretin啟動子、α1-抗胰蛋白酶啟動子、纖溶酶原激活物抑制劑1型(PAI-1)啟動子、載脂蛋白AI啟動子、LDL受體基因啟動子、髓鞘堿性蛋白(MBP)基因啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)基因啟動子、視蛋白啟動子、LCK啟動子、CD4啟動子、角蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、或神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子。27.如權利要求16所述的系統，其中，所述多核苷酸在組成型啟動子的控制之下。28.如權利要求16所述的系統，其中，所述多核苷酸包含在病毒載體中。29.如權利要求27所述的系統，其中，所述病毒載體是整合型病毒載體。30.如權利要求28所述的系統，其中，所述整合型病毒載體是慢病毒、逆轉錄病毒或腺伴隨病毒。31.如權利要求16所述的系統，其還包含(a)一多核苷酸構建物，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的多核苷酸的啟動子；(b)一編碼能阻抑所述至少一個siRNA表達的誘導型阻抑子的多核苷酸；(c)一個或多個含有(a)和(b)所述構建物的載體；和(d)可將其施加于細胞以控制所述融合蛋白表達的化合物或試劑。32.如權利要求31所述的系統，其還包含(a)一多核苷酸構建物，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的多核苷酸的聚合酶III依賴型啟動子；(b)一多核苷酸，其編碼含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域的藥物誘導型阻抑融合蛋白質；和(c)一可結合的多核苷酸，其可被(b)所述融合蛋白的結合域結合并定位，從而轉錄阻抑結構域可發揮作用而阻抑(a)所述多核苷酸構建物的轉錄；(d)一個或多個含有(a)、(b)和(c)所述構建物的載體；和(e)一種化合物，可將其施加于細胞以控制所述融合蛋白的表達，或控制所述融合蛋白通過其結合域與所述可結合的多核苷酸序列結合。33.如權利要32所述的系統，其中，所述多核苷酸編碼操作性連接一誘導型啟動子的融合蛋白。34.如權利要求32所述的系統，其中，所述啟動子是組成型啟動子。35.如權利要求32所述的系統，其中，所述可被融合蛋白結合域結合的多核苷酸序列是四環素操縱基因(tet0)序列，(ii)所述融合蛋白包含融合于人Kox-1的KRAB阻抑結構域(tTR-KRAB)的四環素阻抑子(tTR)的DNA結合域，且(c)的底物是強力霉素。36.如權利要求32所述的系統，其中，(b)所述載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。37.如權利要求35所述的系統，其中，所述可被(b)所述融合蛋白結合域結合的多核苷酸序列、操作性連接于編碼siRNA的多核苷酸序列的啟動子和編碼siRNA的多核苷酸序列都包含在慢病毒載3’長末端重復序列的U3區域中。38.如權利要求32所述的系統，其中，所述編碼融合蛋白的多核苷酸包含在第二個、與含(a)所述構建物分開的載體中。39.如權利要求38所述的系統，其中，所述含編碼融合蛋白的多核苷酸的第二個載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。40.如權利要求15所述的系統，其中，所述多核苷酸編碼的siRNA形成莖環結構或發夾。41.一種含有權利要求1所述多核苷酸構建物的哺乳動物細胞。42.如權利要求41所述的哺乳動物細胞，其特征在于，該細胞還含有(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的核酸區段的啟動子；(b)第二多核苷酸序列，其編碼含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域的條件性阻抑融合蛋白；和(c)第三多核苷酸序列，其可被(b)所述融合蛋白的結合域結合并定位，從而轉錄阻抑結構域可發揮作用以阻抑(a)所述核酸區段的轉錄。43.如權利要求41所述的哺乳動物細胞，其中，所述條件性阻抑融合蛋白是藥物誘導型蛋白。44.如權利要求42所述的哺乳動物細胞，其還包含(d)第四多核苷酸序列，其中所述第四多核苷酸序列是可切除的，并能阻止聚合酶III依賴型啟動子的轉錄；和(e)第五多核苷酸序列，其編碼的酶能切除所述第四多核苷酸序列，其中所述第五多核苷酸序列處在一可調控的啟動子控制之下。45.如權利要求44所述的哺乳動物細胞，其中，可被融合蛋白結合域結合的第三多核苷酸序列是四環素操縱基因(test0)序列，(b)所述融合蛋白包含融合于人Kox-1的KRAB阻抑結構域(tTR-KRAB)的四環素阻抑子(tTR)的DNA結合域，且所述融合蛋白處于強力霉素控制之下。46.如權利要求41所述的哺乳動物細胞，其中，所述細胞是未分化的細胞。47.如權利要求41所述的哺乳動物細胞，其中，所述細胞是卵母細胞或受精的卵母細胞。48.一種含有權利要求41-47中任一項所述的一種或多種細胞的轉基因動物。49.一種產生能夠顯示靶基因條件性敲減的轉基因動物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在性細胞或未分化胚細胞中導入含權利要求1所述的多核苷酸的表達構建物；(b)如果上述細胞是性細胞使其受精產生胚胎；和(c)將該胚胎植入雌性動物，在該雌性動物中產生轉基因動物。50.如權利要求49所述的方法，其中，所述性細胞或未分化的胚細胞是未受精的卵母細胞、受精的卵母細胞、胚胎干細胞、桑椹胚或胚泡中的細胞。51.如權利要求49所述的方法，該方法還包括在導入所述表達構建物和/或移植前培養所述細胞。52.一種調節細胞中基因表達的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(a)制備如權利要求1所述的多核苷酸構建物，其中，所述構建物編碼的siRNA能下調所述基因的表達；(b)通過外部可調控的啟動子從外部調節編碼siRNA的表達。53.如權利要求52所述的方法，其中，所述外部可調控啟動子是一種阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的制劑下調編碼的siRNA的表達。54.如權利要求53所述的方法，其中，可通過外部施加的藥物下調編碼的siRNA的表達。55.如權利要求53所述的方法，其中，所述阻抑型啟動子含有至少一個tet0序列。56.如權利要求52所述的方法，其中，所述方法還包括提供編碼能阻抑siRNA表達的誘導型阻抑子的多核苷酸的步驟。57.如權利要求56所述的方法，其中，所述編碼阻抑子的多核苷酸還被定義為一種藥物可調控的阻抑融合蛋白，其含有DNA結合域和轉錄阻抑結構域，其中該融合蛋白的結合域能結合所述多核苷酸構建物，從而使轉錄阻抑結構域發揮作用以阻抑siRNA的轉錄。58.如權利要求52所述的方法，其中，所述能調節siRNA表達的啟動子是組成型啟動子。59.如權利要求52所述的方法，其中，所述能調節siRNA表達的啟動子是組織特異性啟動子。60.如權利要求52所述的方法，其中，所述細胞還被定義為細胞系中的細胞。61.如權利要求59所述的方法，其中，所述方法還包括向所述細胞提供某藥物的步驟，以測試在缺少所述基因編碼的基因產物時該藥物的功能。62.如權利要求52所述的方法，其中，所述細胞包含在動物體內。63.如權利要求56所述的方法，其中，所述編碼siRNA的多核苷酸構建物可給予所述動物的某區域，在該區域內動物含有編碼阻抑子的所述多核苷酸。64.如權利要求63所述的方法，其中，所述給藥是注射給藥。65.如權利要求63所述的方法，其中，所述動物的區域是在某器官內。66.如權利要求62所述的方法，其中，所述動物是人類患者。67.如權利要求66所述的方法，其中，所述基因是癌基因。68.如權利要求67所述的方法，其中，所述癌基因是ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3或YES。69.如權利要求52所述的方法，其中，所述從外部調節編碼的siRNA的表達包括給予患者影響上調或下調所述表達的試劑。70.如權利要求69所述的方法，其中，所述試劑是抗生素、輻射、類固醇、激素、金屬、二價陽離子、營養物或溫度。71.如權利要求70所述的方法，其中，所述輻射是離子輻射。72.一種控制細胞被免疫系統識別的能力的方法，其特征在于，該方法包括(a)獲得一種細胞，其含有(i)如權利要求1所述的多核苷酸構建物，其中，所述構建物編碼的siRNA能下調編碼某移植抗原的多核苷酸的表達；和(ii)編碼能阻抑所述siRNA表達的誘導型阻抑子的多核苷酸；和(b)通過外部可調控的啟動子從外部調節編碼的siRNA的表達。73.如權利要求72所述的方法，其中，所述細胞在動物體內。74.如權利要求72所述的方法，其中，所述移植抗原是MHCI類抗原。75.如權利要求72所述的方法，其中，所述移植抗原是β2-微球蛋白、HLA、H-Y、P35B、Kdm4、Kdm5、TL、P198、P91A或H-2Kb。76.如權利要求75所述的方法，其中，所述HLA抗原是HLA-C、HLA-G或HLA-DQ。77.如權利要求74所述的方法，其中，所述細胞是胰島細胞、干細胞、肝細胞、多巴胺能神經元或角質形成細胞。78.一種可用siRNA治療的疾病癥狀的治療方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)制備如權利要求1所述的多核苷酸構建物，其中，所述構建物編碼的siRNA可治療該疾病癥狀；(b)通過所述外部可調控的啟動子從外部調節所述siRNA的表達。79.如權利要求78所述的方法，其中，所述疾病是過度增殖性疾病。80.如權利要求79所述的方法，其中，所述過度增殖性疾病是癌癥。81.如權利要求80所述的方法，其中，所述癌癥是膠質肉瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、子宮癌、膀胱癌、脾臟癌、頭頸癌或骨癌。82.如權利要求78所述的方法，其中，所述疾病是甲狀腺功能亢進癥。83.如權利要求78所述的方法，其中，所述疾病與分泌過多缺陷相關。84.如權利要求83所述的方法，其中，所述分泌過多缺陷包括激素分泌過多缺陷。全文摘要本發明提供了通過控制或調節編碼siRNA的多核苷酸構建物或其它所需外源核酸或蛋白質的表達來調制或調節真核基因表達的組合物和方法。可將這類構建物或該系統的其它元件轉染到感興趣的細胞中并表達該siRNA，從而可通過給予該細胞一種化合物(如小分子物質或藥物)控制該siRNA的靶基因表達。在本發明的某些實施方案中，可利用慢病毒來產生條件性敲減的動物。文檔編號C12N15/90GK1759182SQ200380109095公開日2006年4月12日申請日期2003年11月24日優先權日2002年11月22日發明者D·特羅諾,M·維茲那羅維茨申請人:克雷頓研究院