專利名稱：新一代慶大霉素、制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗生素發酵，具體地說是涉及發酵制備提高優質組份含量的新一代慶大霉素、制備方法及其用途。
背景技術：
慶大霉素是1963年在美國發現的抗生素。在世界范圍內廣泛應用于臨床。1967年中國開始生產慶大霉素。目前中國已成為世界上主要的慶大霉素生產國，并成為國際上最大的慶大霉素供應地。
慶大霉素是由絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea)生產的抗生素。它是一個多組份的氨基苷類抗生素，其分子由三個環狀結構組成，分別為糖胺，2-脫氧鏈霉胺和絳紅糖胺。由于在絳紅糖胺上存在不同位置的甲基化，所以慶大霉素由不同甲基化的組份組成。國際上對慶大霉素的質量有明確規定，其標準主要是根據慶大霉素組份的比例而定，如慶大霉素C1應不低于25％，C1a應控制在15-40％，C2和C2a應控制在20-50％。
近40年來，慶大霉素被廣泛應用于治療人類疾病和畜牧業。慶大霉素尤其對綠膿桿菌，腸道桿菌和金葡菌感染的療效顯著，極大的提高了人們的健康質量，并且保證了牧業的穩定生產。但是慶大霉素和其它一些藥物抗生素一樣，在有顯示療效的同時，伴隨產生了嚴重的副作用。這些毒性主要反映在耳和腎等器官上。
科學家對如何降低慶大霉素的毒性進行了長期的探討。這些主要集中在制劑方面，即加入添加劑，如甲磺酸去鐵胺(陳陽等《中華耳鼻咽喉科雜志》1999年6月第34卷第3期)。但是由于種種原因，添加劑沒有得到推廣。目前，慶大霉素的副作用還沒有得到根本改善。
生產高質量低毒性的慶大霉素的關鍵是如何從基本上改善慶大霉素的組份。因為慶大霉素中的不同組份，其藥效不同，而且，毒性也不同。如對腸球菌和痢疾桿菌的活性，則是組份C1大于C2。但是C1組份的半數保護劑量(PD50)比其它組份低。所以C1組份的治療指數高，療效好，而且毒副作用低。因此，生產高質量的慶大霉素，即提高C1組份的生產工藝也成了慶大霉素工業的重要課題。所以，本發明提供了C1高含量的慶大霉素簡易制備方法。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足之處，而提供一種C1含量高、毒副作用小的新一代慶大霉素、制備方法及其用途。
本發明目的可以通過如下措施來實現新一代慶大霉素組份C1含量51-75％、C1a含量5-20％、C2和C2a總含量15-35％；制備方法在常規的發酵培養基中含谷氨酸或谷氨酸鈉或谷氨酰胺，有效濃度分別是0.1-50克/升。按常規方法，pH6.8-7.6，培養溫度35-37℃進行發酵88-92小時。
培養基組成是玉米粉5-15克/升，淀粉10-50克/升，酵母粉或黃豆粉25-40克/升，硝酸鉀0.01-0.45克/升，碳酸鈣2.5-7.5克/升，硫酸銨0.1-3.5克/升，蛋白胨3.5-7.5克/升，氯化鈷5-50毫克/升。
本發明中使用的菌種是絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea菌株NRRL2953)ATCC15835，該菌保藏在美國典型培養物保藏中心(AmericanType Culture Collection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)。
慶大霉素提純采用常規方法。
慶大霉素組份分析使用高壓液相色譜法(HPLC)分析慶大霉素組份(圖2)。
在慶大霉素主要的4個組份C1，C1a，C2和C2a中，C1毒副作用最小。國際上使用的傳統慶大霉素標準的主要依據是美國早期發明專利對慶大霉素組份的定義[馬克子(Marquez)等美國專利3,651,042(1972年)]。傳統慶大霉素和新一代慶大霉素組份含量定義及其實測值如表1所示。
表1新一代慶大霉素和傳統慶大霉素組份比較 從表1可以看出，本發明對新一代慶大霉素組份含量的定義為51-75％的C1，5-20％的C1a，15-35％的C2和C2a，明顯的區別于傳統慶大霉素組份含量的定義。尤其是新一代慶大霉素C1含量高于傳統慶大霉素含量，傳統慶大霉素C1含量為25-50％，而本發明取得的新一代慶大霉素組份C1含量的實測值分別為66.8％，64.6％和57.1％。
本發明相比現有技術具有如下優點本發明采用發酵方法，所制得的慶大霉素C1含量51-75％，比傳統的C1含量25-50％高，C1毒副用小，是新一代有高含量優質組份的慶大霉素。
圖1慶大霉素分子結構圖所示為慶大霉素主要組份的結構區別，其區別在于絳紅糖胺的不同程度的甲基化。
圖中R1，R2和R3分別表示氫原子或者甲基。
慶大霉素C1R1和R2為甲基；R3為氫原子。
慶大霉素C1aR1，R2和R3皆為氫原子。
慶大霉素C2R1和R3為氫原子；R2為甲基。
慶大霉素C2aR1和R2為氫原子；R3為甲基。
圖2本發明慶大霉素組份的HPLC分析結果圖中X軸是慶大霉素的流出時間，單位為分鐘；Y軸是在254納米的吸光度，單位為毫吸光單位(mA)。
圖3傳統工藝慶大霉素組份的HPLC分析結果從圖2和圖3可以看出，本發明發酵工藝制備的慶大霉素，其C1的含量明顯高于傳統工藝生產的慶大霉素。
具體實施方法下面列舉四個實施例，對本發明加以進一步說明。但本發明不只限于這些實施例。
實施例1慶大霉素C1高產培養方法。含玉米粉11克/升，淀粉25克/升，黃豆粉32克/升，硝酸鉀0.01克/升，碳酸鈣5克/升，硫酸銨0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化鈷15毫克/升的絳紅小單孢菌常規發酵培養基中，添加谷氨酸2.5克/升，pH7.2，培養溫度35℃，發酵時間90小時。
實施例2與實施例1相同的發酵培養基中，含有谷氨酸鈉2.5克/升，取代實施例1中谷氨酸，其余均與實施例1相同。
實施例3與實施例1相同的發酵培養基中，含有谷氨酰胺2.5克/升，取代實施例1中的谷氨酸，其余均與實施例1相同。
實施例1-3的實測值，見表1。
實施例4把本發明實施例3的產品含C1 57.1％，與傳統生產方法生產的慶大霉素C1含量35.4％，按1∶1重量比混合，即得到C1含量為46.25％的慶大霉素產品。
慶大霉素的純化。向實施例1-3的培養液中加入硫酸，使pH降為2-3，并保持30-60分鐘，之后，加入氫氧化鈉，將pH調高到6.0-6.5。加入強陽離子交換樹脂(Dowex-50)，充分吸附慶大霉素。經過氯化氨(0.4摩爾)和低濃度氨水(0.1摩爾)沖洗，最后用高濃度氨水(1摩爾)解離。
慶大霉素組份分析。使用高壓液相色譜法(HPLC)分析慶大霉素組份。分析方法見喬克(Jork)等《色譜雜志》(Journal of Chromatography)1988年19卷115-9頁。
說明一點國際標準慶大霉素C1含量25-50％，實際上生產單位制得的慶大霉素C1含量35％左右，達不到C1含量36-50％范圍。而本發明慶大霉素與傳統的慶大霉素按重量比例混合，可以制得含C1接近50％的國際標準慶大霉素。
本發明慶大霉素廣泛用于醫療及畜牧業，作抗生素。
權利要求
1.新一代慶大霉素，其特征在于慶大霉素組份C1含量51-75％、C1a含量5-20％、C2和C2a總含量15-35％。
2.新一代慶大霉素的制備方法，其特征在于在常規的發酵培養基中，含谷氨酸或谷氨酸鈉或谷氨酰胺，有效濃度分別是0.1-50克/升。
3.新一代慶大霉素用于與傳統方法生產的慶大霉素按重量比例混合，可以制得含C1接近50％的國際標準的慶大霉素。
全文摘要
本發明涉及一種新一代慶大霉素、制備方法及其用途，它是在含有玉米粉、淀粉、酵母粉或黃豆粉、硝酸鉀、碳酸鈉、硫酸銨、蛋白胨、氯化鈷的絳紅小單孢菌的常規培養基中，添加谷氨酸或谷氨酸鈉或谷氨酰胺。詳細配方和發酵方法詳見說明書。本發明優點是慶大霉素C1含量高，C1毒副作用小，是新一代有優質組份的慶大霉素。本發明產品被廣泛用于醫療及畜牧業，作抗生素。
文檔編號C12P19/00GK1557958SQ200410039138
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月12日 優先權日2004年2月12日
發明者竇德獻 申請人:竇德獻