專利名稱：：用作選擇標記的轉位酶的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物的選擇體系，其基于關鍵轉位酶的失活和通過相同作用的因子消除該失活，所述因子通過載體用于有關細胞。需要大量的蛋白，這些蛋白當中，特別是用于工業應用領域的酶，如今通常通過微生物發酵獲得。對天然產生所研究蛋白的微生物而言，遺傳修飾生產菌株的重要性日益顯著。現有技術早已經建立了這類用于蛋白質生產的遺傳工程方法。其原理在于所研究蛋白的基因作為轉基因結合到宿主細胞中，被這些細胞轉錄和翻譯，并任選分泌穿過細胞膜進入細胞周質或周圍介質中。然后它們可從有關細胞或培養上清液中獲得。在用于蛋白質生產的工業生產方法中，首先利用微生物用于合成蛋白和任選地用于分泌所述蛋白的天然能力。基本上，選擇用于蛋白質生產的細菌體系是發酵中價格低廉的，其可以從一開始實現高的待生產的蛋白產品形成率和保證正確的折疊、修飾等等；后者由于與生物體原來生產所研究蛋白的關系增強從而是更為可能的。特別建立用于本目的的宿主細胞是革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)或革蘭氏陽性細菌，例如葡萄球菌(Staphylococcus)或桿菌(Bacillus)屬的種類。生物技術方法的經濟性主要依賴于可達到的蛋白產量。除了采用的表達體系外，產量取決于采用的方法，特別是依賴于發酵參數和基質。通過優化表達體系和發酵方法，可以明顯增加生產生物體的潛力和可實現的產量。此外，表達體系基本上被開發，并根據兩個根本上不同的遺傳結構進一步開發。另一方面，待生產蛋白的基因被整合到宿主生物體的染色體中。這類構建體在不加以選擇(見下文)的條件下對附加的標記基因是非常穩定的。缺點是該基因只有一個拷貝存在于宿主中，通過基因劑量效果整合更多的拷貝以提高產品形成率是以非常復雜的方式系統地布置。現有技術可以簡要地解釋如下。歐洲專利EP284126B1解決穩定的多重整合的問題，在于大量基因拷貝結合進細胞中，所述細胞在拷貝之間包含內源的和關鍵的染色體DNA片段。另一個穩定的多重整合的解決方案在專利申請WO99/41358A1中公開。據其所述，所研究基因的兩個拷貝以相反轉錄方向整合并通過非必需的DNA片段分開，這樣以免兩個拷貝同源重組。從專利申請DD277467A1，生產細胞外酶的方法基于所述酶的基因編碼穩定有利地多重整合到細菌染色體中。整合作用通過同源區域發生。為調控成功的整合作用，使用包含在質粒上的紅霉素基因，其由成功的整合作用失活。根據DE4231764A1的說明書，整合到染色體中可以通過胸苷酸合成酶基因的單交換或雙交換而實現。后者允許調控該方法，因為對于單交換，胸苷酸合成酶活性得以保持，而雙交換中該活性喪失，也就是說獲得營養缺陷體。伴隨單交換，在該特定體系中具有對抗生素三甲氧芐二氨嘧啶的抗性，而雙交換則對應對抗生素敏感。在申請WO96/23073A1中，公開了為整合多拷貝所研究基因到細菌染色體中的基于轉座子的體系，其特征在于質粒的標記基因通過整合作用刪除，從而包含的菌株不含抗性標記。此外，根據說明書，標記物只有在控制所需菌株的構建時是需要的。此外在申請WO01/90393A1中也公開了提高某些轉基因整合到細菌染色體中拷貝數的體系。第二種構建生產菌株的方法在于對所研究基因傳遞自主復制元件，例如質粒，如此將其傳遞到宿主生物體。通常在這種情況下每個細胞的高質粒拷貝數通過基因劑量作用具有有益的效果。整個培養期施加選擇壓力以將質粒保留在細胞中是不利的。默認的是，施加選擇壓力通過添加抗生素到培養基中而進行，而給予有關物質抗性的基因被傳遞給質粒。從而只有具有足夠數量的該質粒細胞能夠生長。抗生素抗性用作選擇標記近來日益收到批評。一方面，應用抗生素實際上是昂貴的，特別是如果抗性基于酶降解抗生素，而且有關物質必需在整個培養期間增加。另一方面，其普遍的應用，特別是在其他的
技術領域：
，導致抗性基因散布到其他菌株，甚至到病理菌株。由于多重抗性的人病源菌株的存在，這已經使得例如內科衛生學和特別地在傳染性疾病處理中相當困難。因此，在很大程度上為穩定地整合基因到生產細胞的染色體中，對上述體系進行復原，因為這些質粒在沒有持久的選擇壓力下是穩定的。然而，如上所述的有關菌株只能通過昂貴的花費制備。在生物工程實踐中，將例如具有選擇標記的質粒上新發現的或修飾的基因結合到宿主細胞中并用這樣的方式表達它是更快和更方便的。在現有技術中，同時還開發了無抗生素的選擇體系。例如，在出版物J.Bacteriol.，Volume172，6557-6567頁(1990)中Herrero等的“Transposonvectorscontainingnon-antibioticresistenceselectionmarkersforcloningandstablechromosomalinsertionofforeigngenesingram-negativebacteria”，描述了對除草劑和重金屬的抗性作為選擇標記。然而對這些化合物的應用有著和抗生素應用類似的顧慮。通過營養缺陷體的選擇，例如，通過使有關細胞取決于某些代謝產物的供應，作用原則上與對抗生素的選擇相似。營養缺陷型的菌株然后接受，與消除該營養缺陷體的所研究的轉基因結合。就損失來說，在合適的培養條件下它們將同時喪失成活力，從而對所需的營養缺陷體生產者進行選擇。例如，在出版物NetherlandsMilkandDairyJournal，Volume40，(1986)141-154頁中deVos的“Genecloninginlacticstreptococci”中，參考例如148頁從乳鏈球菌代謝產生的不同選擇標記；這些當中是來自乳鏈球菌的乳糖代謝、銅抗性和不同細菌素抗性基因的選擇標記。專利EP284126B1，其考慮所研究基因穩定整合到細菌染色體的問題(參見上面)，該專利文獻在第7頁以術語″生存選擇″總結了可能用于選擇的營養缺陷體、抗微生物劑抗性和對病毒感染抗性體系。這里提到的營養缺陷型選擇標記的例子是新陳代謝基因leu、his、trp“或類似的”；顯而易見是指來自氨基酸合成途徑的基因。但是在實踐中，這類營養缺陷體的應用到目前為止是非常有問題的，因為特別是在工業發酵介質中，幾乎所有的必需基質都是足量的，有關細胞可以通過從培養基吸收相同的化合物而補償某特定化合物合成的不足。例外迄今僅是必需的胸腺嘧啶脫氧核苷，其在工業發酵介質中只以痕量存在，因此必需通過胸苷酸合酶從增殖的并因而合成DNA的生物體形成。因此EP251579A2的應用提供采用對核苷酸代謝必要的胸苷酸合酶基因缺陷的宿主菌株的解決方案。據文獻所述通過載體有可能使該基因(來自EscherichiacoliK12的thyA)精確地用于所述功能并消除基因缺陷。如果這些載體另外帶有所研究蛋白的基因，可以產生對生產者細胞類似于抗生素的選擇。概括地說，應該理解在現有技術中盡管存在大量生物工程生產蛋白的經驗，并且通過染色體整合和抗生素選擇表達所研究基因是系統性可調控的，對于這兩個體系迄今沒有同樣好的實際應用的替換物存在，特別是不存在比染色體整合復雜性小且同時無需通過昂貴的或有生態問題的化合物進行選擇。特別是，對于工業慣常的復合培養基，通過營養缺陷型標記選擇的方法目前只得到非常不充分的結果。因此本發明的目的是開發新的選擇體系，其與通過抗生素的選擇具有可比較的簡便性，并且無需通過昂貴的和某些情況下環境有害的物質進行選擇。它應該可在工業規模上利用。它不應該基于這樣的必需基因，所述基因在工業介質中不存在時可通過污染物補償。根據本發明上述目的通過微生物的選擇而實現，其特征在于(a)編碼必需轉位活性的內源性存在的基因被失活，和(b)根據(a)必需轉位活性的失活通過載體得到消除。令人驚訝的是，已經公認轉位涉及的關鍵因子適合用于選擇。對于選擇，使用根據發明的基因，其衍生的蛋白包括在蛋白轉位中作為有關細胞必需的因子。這表明缺乏該基因是致命的，因此微生物的抗生素樣選擇是可能的。該選擇體系運行無需添加劑(例如，現有技術已知的抗生素)，且原則上作用時不受營養培養基組成的影響。為此，對所研究微生物進行分子生物學修飾是必需的，其按照轉位的細節進行描述并且在本申請的實施例中闡述。轉位過程包括由細菌形成的蛋白分泌到周質中(就革蘭氏陰性細菌而言)、或到周圍介質中(就革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌兩者而言)。其描述于，例如A.J.Driessen(1994)的論文“Howproteinnscrossthebacterialcytoplasmicmembrane”inJ.Membr.Biol.，142(2)，pp.145-59。為此所必需的分泌裝置由一系列不同的、主要是膜-相關的蛋白組成，其在本申請的圖1中顯示。這些包括，特別是，蛋白SecA、SecD、SecF(共同作為復合SecDF)，E、G和Y較好地表征，例如枯草桿菌(Bacillussubtilis)(vanWely，K.H.，Swaving，J.，Freudl，R.，Driessen，A.J.(2001)“TranslocationofproteinsacrossthecellenvelopofGram-positivebacteria”，FEMSMicrobiolRev.2001，25(4).，pp.437-54)。被認為是體系一部分的其它因子是YajC，其同樣地與Sec復合物直接接觸，且在圖1中確認了因子Bdb(Dsb)、SPase(為″信號肽酶″)、PrsA和b-SRP(Ffh，Ffs/Scr、SRP-RNA)。前面提到的因子是細菌因子，其原則上起著與最初在真核生物中描述的SRP(信號識別粒子)相同的作用。其亞基是Ffh因子，特征來自枯草桿菌(B.Subtilis)和大腸桿菌(E.coli)。b-SRP相鄰的亞基在枯草桿菌中被稱為Scr，在E.coli中被稱為Ffs。此外，RNA(SRP-RNA)是功能b-SRP復合物的一部分。功能上與此聯合的其他因子在大腸桿菌中被稱為Srb和在枯草桿菌中被稱為FtsY。就其功能對應于真核的停靠蛋白。在另外的背景中，例如還包括因子PrfB(肽鏈釋放因子B；也叫RF2)。它已知為蛋白合成裝置的一部分，即，既在革蘭氏陽性細菌又在革蘭氏陰性細菌中。與翻譯相關，它功能特別地是脫離剛翻譯的核糖體，即翻譯的終止。由于prfB基因在許多細菌中與因子SecA的基因同時轉錄，因而只間接地提供與上述轉位的關系。從而具有調控關系。轉位的前提是待釋放的蛋白具有N-末端信號肽(Park，S.，Liu，G.，Topping，T.B.，Cover，W.H.，Randall，L.L.(1988)“Modulationoffoldingpathwaysofexportedproteinsbytheleadersequence”，Science，239，pp.1033-5)。這適用于細胞外的蛋白和膜蛋白。當翻譯在核糖體上進行后，得到的肽鏈通過具有伴護作用的胞漿蛋白保持解折疊的狀態并運輸到膜。肽的穿膜運輸隨著消耗ATP而被催化(Mitchell，C.，Oliver，D.(1993)“TwodistinctATP-bindingdomainsareneededtopromoteproteinexportbyEscherichiacoliSecAATPase”，Mol.Microbiol.，10(3)，pp.483-97)。這里SecA作為多酶復合物轉位酶的能量供給組分(ATPase)。在穿膜以后，信號肽通過信號肽酶的活性分裂，細胞外的蛋白以這樣的方式與膜分離。就革蘭氏陽性細菌而言，外蛋白(exoproteins)以這樣方式釋放直接進入周圍介質。就革蘭氏陰性細菌而言，隨后通常在周質空間發現該蛋白，并需要另外的修飾以實現其釋放到周圍介質中。B.v.d.Berg等近期的研究(2004；Nature，Volume427，36到44頁)描述了轉位酶的x-射線結構，即在其他生物體中作為對應復合物模型的詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschi)中的SecY復合物。因此該方法的中央分子是轉位酶蛋白前體，由SecA、SecY、SecE、SecD、SecF(SecDF)和SecG亞單位組成。因為ATPase控制該過程，因子SecA對轉位具有決定性的作用。本發明的優選實施方案的特征是這些因子(見下文)。在下面的表1中，目前已知包括在轉位中的因子根據它們在兩種模式生物體大腸桿菌(革蘭氏陰性)和枯草桿菌(格蘭氏陽性)之一中是否是必需的而進行分類。如果這些因子中的一個在各種情況下的有關生物體中是必需的，那么其適合于本發明的選擇。基本上，由此可以假定對應的模式還存在于其他的生物體，特別是革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌。表1目前已知包括在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌轉位中的蛋白因子，根據它們在這些生物體中是否是需的而進行分類。根據本發明在革蘭氏陰性細菌，特別是在大腸菌類細菌中，更具體是在大腸桿菌中，可通過下列轉位酶或它們的相關基因進行選擇SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號肽酶、b-SRP(Ffh或FfS)、SrborYajC。根據本發明在革蘭氏陽性細菌，特別是在桿菌中，更具體是在枯草桿菌中，可通過下列轉位酶或它們的相關基因而選擇SecA、SecY、SecE、b-SRP(Ffh或Scr)、FtsY或PrsA。這些列表中的限定或連接語不應理解為排他的。技術上而言，其應該還可能同時關閉一些相關的基因。然而根據本發明，只選擇一個就足夠。在各種情況下，相關基因的單獨序列可以從例如下列可訪問的數據庫獲得GenBank(NationalCenterForBiotechnologyInformationNCBI，NationalInstituteofHealth，Bethesda，MD，USA；http//www3.ncbi.nlm.nih.gov)；EMBLEuropeanBio-informaticsInstitute(EBI)inCambridge，GreatBritain(http//www.ebi.ac.uk)；Swiss-Prot(GenevaBio-informatics(GeneBio)S.A.，GeneVa，Switzerland；http//www.genebio.com/sprot.html)；″Subtilist″or″Colibri″ofthePasteurInstitute，25，28rueduDocteurRoux，75724ParisCEDEX15，Franceforgenesandfactorsfrom枯草桿菌orE.coli(http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/orhttp//genolist.pasteur.fr/Colibri/)。此外，可以求助于通過在提及的數據庫交叉引用而獲得的數據庫。根據本發明，在各種情況下只需要鑒定和恰當地使用設計用于培養的菌株中轉位裝置的單個必需基因。本發明序列表中表明的不同微生物SecA因子的序列產生了另外的起點。這些能被直接使用(見下文優選實施方案)或者用于鑒定基因庫中事先已經設計用于所研究微生物的同源體。這些轉位酶或因子主要被理解為表示野生型分子。但是，如果有可能制備原理上在轉位裝置中具有與野生型酶相同作用的變體，則根據變體構建的選擇體系另外地也包括在保護范圍內。為實現本發明，設計用于培養的菌株，如果它不屬于本申請研究的種類中的一種，則必需首先確認是否至少一種因子對其是必需的。有可能以簡單的方式實現，例如通過從菌株除去一種這些已知的基因，所述菌株是盡可能緊密相關的(例如相似的革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌)，或借助于通常可進入的數據庫的條目而合成并將它整合到基因敲除的載體中。這類方法通常是所屬
技術領域：
的專業人員公知的。如果用所述載體轉化和隨后這些基因的同源重組物進入宿主細胞的基因組具有致死效應，優選與轉化分開啟動，則該基因被認為是必需的。根據本發明和特別地根據本申請實施例的模型，認為是必需的基因可以用作選擇標記。根據特征(a)進行必需的失活，例如通過對已經被引入到所研究微生物菌株細胞中的失活基因拷貝的同源重組，例如通過用合適的載體進行轉化。該方法本質上是已知的。作為重組事件的結果，基因的染色體拷貝被完全或部分刪除，從而不會起作用。這可以通過例如已經事先進行致死性檢測的相同基因進行。然而優選，假定內源同源染色體是已知的或可以用合理的花費分離，那么其可用于達到高的重組成功率。失活是否成功對本發明的完成是決定性的。這個概念可以通過，例如，具有溫度敏感性的復制起點和待刪除的基因同源DNA區域被另外插入到其中的質粒載體(刪除載體)來實現。可逆的失活，例如，將還可能通過可移動的遺傳成分例如轉座子的整合作用進入到靶基因中而實現。在本文中，在各種情況下均應考慮特征(b)，即，甚至在重組或失活事件前，或最遲同時，在有關細胞中制備用于本發明選擇的基因完整的拷貝，因為，否則的話所述細胞將不能從失活作用中存活。根據本發明，產生的缺陷通過載體來彌補，即載體能消除失活。在這方面，如上所述，優選使用內源性存在于宿主細胞并根據(a)刪除的基因。然而，還可以采用來自其他生物體的功能相同的基因，優選相關的菌株，只要它們能夠消除所研究的缺陷。因此有可能，例如，通過提供來自肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)的secA基因消除枯草桿菌SecA的缺陷。還可能通過載體，消除第一個缺陷的另一種遺傳成分被帶進細胞，例如功能基本相同但經過突變修飾的因子的基因。在該細胞中，存在通過單獨的遺傳因子補償致死缺陷的情況是占優勢的。所述單獨的遺傳因子的缺失將是致死的，所以這種細胞被迫在任何細胞分裂情況下將該元件傳遞給后代。在優選實施方案中特征(c)利用這一點(見下文)，據上所述補償基因缺陷的載體攜帶所述轉基因，所研究蛋白的基因將根據本發明的方法精確制備。在某種程度上內源的選擇壓力占優勢，無需添加外部必需的其他化合物例如重金屬或抗生素，即通過培養基來避免喪失具有轉基因的載體。另一方面，開始論述為整合轉基因本身進入染色體DNA而進行復雜的修飾是不適用的。例如，已制備的微生物菌株使用類似構建的載體而用于新的轉化，其每次能利用相同的作用消除基因缺陷，其中制備所述的微生物菌株用于轉位裝置確定的失活，但在各種情況下攜帶不同的轉基因。因此可獲得非常實用且可以多種方式使用的選擇體系。根據本發明選擇方法的目的在于獲得在細胞中經多個世代保持穩定的遺傳元件。精確地講該元件是載體，通過其來補償必需轉位活性的失活，即消除。在優選的實施方案中，根據本發明的選擇方法特征在于(c)根據(b)的載體攜帶轉基因。那么，這是選擇體系技術上最重要的應用。經多個世代穩定的遺傳因子是攜帶轉基因的，特別地是其基因產物具有商業價值的轉基因。優選的實施方案如下進行。在優選的實施方案中，根據本發明的選擇過程的特征在于必需的轉位活性是以下因子中的一個SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。如表1中所述，這些因子或相關的基因是從大腸桿菌或從枯草桿菌已知必需的那些基因。因此，特別是在這兩種生物體中，而且在相關的乃至較少相關的種類中，根據本發明通過有關同源體建立選擇體系是顯而易見的。因為眾所周知在各種情況下即使是這些基因的單個構件也可以代替另一個生物體中涉及的功能，就是說超過了革蘭氏陰性/革蘭氏陽性的限度，根據本發明至少甚至來自很遠相關物種有關基因的單個構件應該可以使用。優選，必需的轉位活性是蛋白前體轉位酶以下亞基中的一種SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優選是SecA亞基。如圖1所示，在某種程度上這些因子代表轉位裝置的功能核心。對于SecA，正如已經在上述中另外說明的，該因子占據ATP酶活性的關鍵位置。因此，在本申請的實施例中，本發明還可以借助secA基因進行變換。優選，本發明選擇過程的特征在于根據(b)發生通過與失活的內源性存在的必需轉位活性相同的活性而消除，優選通過遺傳相關的活性，特別地優選通過同一活性。據反映由于通常有關因子在物種之間具有高同源值，來自較少密切相關物種的有關基因也具有應用前景。然而，當然來自更緊密相關的物種的基因和很特別地來自相同生物體的基因是更優選的，因為就失活所必需的交換而言這些基因是最有前景的。可以再次指出只有單個基因適于失活對根據本發明實現選擇是足夠的。如上所述，有關DNA和氨基酸序列可從通常可進入的數據庫獲得。例如，來自來自PasteurInstitute的″Subtilist″數據庫(參見上面)在SEQIDNO.1和2序列列表中表示的枯草桿菌SecA蛋白序列已經除去(日期2003年2月3日)；上述序列與Swiss-Prot(參見上面)登記號碼為P28366的序列完全一致。序列表明SEQIDNO.3和4代表的來自大腸桿菌SecA蛋白的序列方案來源于PasteurInstitute的″Colibri″數據庫(參見上面；日期2003年2月3日)；這與Swiss-Prot(參見上面)登記號碼為P10408的序列完全一致。地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的SEQIDNO.5和6如本申請實施例1的描述從商業可購買的菌株地衣芽孢桿(DSM13)中獲得(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeg1b，38124Brunswick；http//www.dsmz.de)。因為物種枯草桿菌、大腸桿菌和地衣芽孢桿菌是技術上最經常采用的微生物，這些細菌對于實現本發明的方法特別重要。使用本申請的序列表，能夠利用來自這三個最重要生物體的同源secA基因，而不必將它們分離用于復制。通過這些基因，有可能例如鑒定其他微生物中的有關同源染色體，例如通過制備基因庫和使用這些基因中的一種作為探針進行篩選。但特別是在有關的物種中，還有可能采用這些基因本身用于本發明的失活。因此優選實施方案的特征在于根據(b)的消除通過來自枯草桿菌、大腸桿菌和地衣芽孢桿菌的secA基因的區域恢復轉位活性而實現，其分別見于SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列表。優選的方法特征還在于發生根據(a)的失活，以使在根據(a)失活的基因區域和載體上根據(b)的同源區域的重組被阻止，優選完全失去包含在有關染色體基因中的基因區域。如果載體被整合進宿主細胞的染色體，致死突變將被永久消除，而無需同時存在有關載體上的選擇壓力。通過這種方法，所真正關注的轉基因可能通過后續的細胞分離而喪失。在失活步驟(a)中的廣泛刪除可以防止這一點。在現有技術中，特別是出版物J.Biotechnol.，Volume19，221-240頁(1991)中J.Vehmaanper_etal.的“GeneticmanipulationofBacillusamyloliquefaciens”，描述了通過刪除載體進行基因失活的方法。借助上述的描述，有可能在實施例3中從地衣芽孢桿菌成功地刪除secA基因。該刪除載體的復制起點的特點在于其是溫度依賴性的。因此，在相對低的溫度下首先選擇成功的轉化，然后通過提高溫度對成功的整合施加選擇壓力(即失活內源基因)是非常簡單的。類似的，例如通過添加低分子量化合物構建體用作對照也是可能的。因此根據本發明優選的方法特征在于根據(a)的失活通過刪除載體而進行，優選通過具有外源可調控復制起點的刪除載體，特別優選通過具有溫度依賴性的復制起點的刪除載體。如上所述，原理上有可能(b)包含轉基因的消除載體被整合到細菌染色體中。然而，這種情況下存在轉基因永久喪失的危險，優選的方法特征在于根據(b)的載體是在微生物中自主復制的質粒。其可以在衍生的細胞系中復制其自身。如果該質粒是多拷貝數(例如每細胞2到100)自我復制的質粒則是非常有利的，優選多拷貝數(每細胞大于100質粒)。存在的拷貝數越多，消除越可能成功。此外，當載體攜帶有編碼所研究蛋白的轉基因時，其可以通過基因劑量效應增加該產品的產量。由于革蘭氏陰性細菌的重要性，特別是在基因或基因產物的克隆和定性時，優選的選擇方法特征在于微生物是革蘭氏陰性的細菌菌株。其中，特別地，應當理解方法的特征在于涉及的是革蘭氏陰性大腸桿菌屬或克雷伯桿菌屬(Klebsiellaplanticola)的細菌，特別地是大腸桿菌K12，大腸桿菌B的衍生物或植生克雷伯桿菌的衍生物，以及非常特別地是E.coliBL21(DE3)、E.coliRV308，E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliXL-1或植生克雷伯桿菌(Klebsiellaplanticola)(Rf)的衍生物。這些是分子生物學中最常用的生物體。特別對發酵生產蛋白而言，革蘭氏陽性細菌是特別重要的。一定程度上這適用于分泌的蛋白。因此根據本發明優選的方法特征在于微生物是革蘭氏陽性的細菌菌株。這些當中，特別是在工業上，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)屬、棒狀桿菌(Corynebacteria)屬或芽孢桿菌(Bacillus)是已經建立的，特別是肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，枯草桿菌(Bacillussubtilis)，地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，克魯伯氏芽孢桿菌(B.globigii)或緩慢芽孢桿菌(B.lentus)，及非常特別地，地衣芽胞桿菌或解淀粉芽孢桿菌的衍生物，這些決定了對應優選選擇方法的特征。特別感興趣的是涉及通過培養微生物而產生特定產物的本發明的方法。因此對應地優選的選擇方法是特征為根據(c)的轉基因是編碼非酶蛋白的那些方法，特別是藥物相關蛋白，非常特別的是胰島素或降鈣素。然而，酶也是在工業上是非常重要的。因此，根據本發明這些方法還要求保護特征在于根據(c)的轉基因是編碼酶的轉基因，優選編碼水解酶或氧化還原酶，特別優選蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、纖維素酶、脂肪酶、角質素分解酶(cutinase)、氧化酶、過氧化物酶或漆酶。其中，優選生產用于去污劑和清潔劑的代表性的酶闡述如下。一般來說，這類組合物可以用于提高現有技術中所有酶的去污或清潔效力。在這些蛋白酶中，枯草桿菌類的酶是優選的，例如緩慢芽孢桿菌的堿性蛋白酶。來自緩慢芽孢桿菌DSM5483(WO91/02792A1)的蛋白酶派生出使用BLAP_作為名稱的變體，其詳細在WO92/21760A1，WO95/23221A1，WO02/088340A2和WO03/038082A2中描述。來自不同的芽孢桿菌屬sp.和克魯伯氏芽孢桿菌的另外的可根據本發明制備的蛋白酶從以下專利申請顯而易見地得到WO03/054185A1，WO03/056017A2，WO03/055974A2和WO03/054184A1。可以根據本發明制備的淀粉酶的例子是來自地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪桿菌芽孢(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶，和它們改進的進一步發展，特別用于去污劑和清潔劑的應用。此外在專利申請WO02/10356A2公開了來自芽孢桿菌sp.A7-7(DSM12368)的α-淀粉酶和在申請WO02/44350A2中描述的來自B.agaradherens(DSM9948)大環糊精葡聚糖轉移酶(CGTase)重點用于此目的。此外，屬于α-淀粉酶序列部分的分解淀粉酶是本申請的重點，其在申請WO03/002711A2中定義，且在WO03/054177A2中有描述。同樣地，提及到分子的融合產物指例如來自申請DE10138753A1的產物。根據本發明，還可以生產脂肪酶或角質素分解酶，例如那些原先可從Humicolalanuginosa(Thermomyceslanuginosus)獲得的酶，或進一步發展的脂肪酶，特別是那些具有氨基酸交換D96L的酶或其起始酶分離自門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)和茄病鐮孢(Fusariumsolanii)的脂肪酶或角質素分解酶。此外，其特別地設計用于紡織品的工業處理和用于依賴纖維素酶例如葡聚糖內切酶和/或纖維二糖水解酶的清潔劑。例如，也通過來自天然生產者生產的纖維素酶是來自芽孢桿菌sp.CBS670.93和CBS669.93的那些，如WO96/34092A2的公開。此外，也可根據本發明生產以術語半纖維素酶概括的另外的酶。這些包括，例如，甘露聚糖酶、黃原膠裂解酶、果膠裂解酶(＝果膠胸)、果膠酯酶、果膠酸鹽裂解酶(＝木聚糖酶)、支鏈淀粉酶和β-葡聚糖酶。去污劑和清潔劑酶同樣地包括氧化還原酶，例如氧化酶、氧酶、過氧化氫酶、過氧化物酶，例如鹽、氯、溴、木質素、葡萄糖或錳過氧化物酶、二氧酶或漆酶(酚類氧化酶、多酚氧化酶)或所有在現有技術描述用于這些應用領域的其他酶。如同引言中解釋的，構成本發明基礎的發明目的特別明顯地依賴于大規模發酵的背景。因為準確地講，其缺點表現為一方面，通過抗生素選擇是昂貴的和從環境觀點來看是有問題的，另一方面根據代謝缺陷癥的營養缺陷型可以由于工業培養基的復雜性而得到補償。因此根據本發明的選擇方法轉化為大規模的方法是特別重要的，例如用于低分子量化合物例如抗生素或維生素的生產或很特別地用于蛋白質生產過程。通過培養微生物菌株細胞生產蛋白的方法是現有技術公知的。它們基于的事實是以適合的方式培養細胞，其天然地或用有關基因轉化后生產所研究的蛋白，優選被刺激以形成所研究的蛋白。因此通過培養微生物菌株細胞生產蛋白的方法形成本發明的另一個主題，特征為采用前述的選擇方法。這一點上，尤其是上述的實施方案強調消除載體本身包含轉基因，該轉基因優選編碼非酶蛋白或酶。其中，特別有必要了解商業上重要的蛋白。因此，轉基因生產胰島素被用于治療糖尿病，使用許多酶，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶以至氧化酶來生產去污劑和清潔劑。由于簡單的工業操作性能，如果在載體上能獲得所研究的轉基因和消除基因，那些根據本發明的蛋白質生產方法是優選的，其特征在于根據(c)的轉基因編碼通過該方法生產的蛋白。原則上，細菌能被用在固體表面上。這對檢測它們的代謝性質或在實驗室規模持續培養是特別重要的。為生產蛋白，另一方面，特征為微生物培養發生在液體培養基中優選在發酵罐中的方法是優選的。這類技術在現有技術中是普遍的，并且準確地通過本發明中由必需的轉位因子通過轉化來選擇得到進一步發展。特別重要的是特征為所研究的蛋白分泌到周圍介質中的蛋白質生產方法。用這種方法獲得的產品的發展被顯著地促進。然而本發明可能的替換方法也在于裂解所研究的細胞，其制備遵循實際生產的蛋白，從而獲得該產物。原則上，通過對微生物的各自分子生物學轉化產生新的菌株。因此，新的微生物菌株還通過本發明的轉化產生，確切地說是通過特定的必需轉位活性的失活和通過供給相同作用的轉位因子消除而不同于起始菌株的那些菌株(更確切地說不同于起始細胞)。因此使用本發明的選擇方法產生新的微生物。因此已經通過前述的選擇方法獲得的微生物屬于本申請保護的范圍。特別有益的方面在于通過總是進行相同類型的失活和在消除載體上的消除來制備種群相關的微生物，但每次制備另一種轉基因。該方法一旦使用成功可用該方式轉移無數其他的選擇問題。為實現尤其是上述解釋的蛋白質生產方法，必要的是表達轉基因。通過這種方法，表征根據本發明優選的微生物。這些特征當中，根據上述關于蛋白質生產的所述內容，特征在于轉基因是分泌的微生物是優選的。據上所述，只可能發現本發明的選擇體系，其中編碼轉位活性的必需基因被認為是這樣的，通過該基因可以進行選擇。這些類型基因的使用迄今仍然未被考慮，盡管許多這類基因已知來自于大量微生物。準確地講這些知識對根據本發明的選擇體系是有利的，因為實際上所有微生物基因能通過可實現的合適選擇方式來定義。為實現上述目的，它們只需如上所述失活，并被功能同源體在有關細胞中代替。因此本發明的一個主題是編碼微生物選擇的必需轉位活性的基因的應用，其特征在于(a)內源性存在于微生物中的該必需轉位活性被失活，和(b)根據(a)的必需轉位活性失活通過載體消除。對應于上述的介紹，以下解釋的本發明該主題的實施方案因此是優選的。(c)如果這些應用的特征在于根據(b)的載體攜帶轉基因，那么其為特別的分子基因在技術上有意義。本發明的要點包括任何合適的應用，其特征在于必需的轉位活性是以下因子之一SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。這些當中，基于具有以下蛋白轉位酶亞基之一的必需轉位活性的任何應用是優選的SecA、SecY、SecE、SecD或SecF，優選SecA亞基。有利的應用在于進行根據(b)的消除，其通過與失活的內源性存在的必需轉位活性相同的活性進行消除，優選通過遺傳相關的活性，特別優選通過同一活性。為此，本申請能夠獲得一些合適的優選起點，即，提及的應用是可能的，其特征特別在于根據(b)的消除通過來自枯草桿菌、大腸桿菌或地衣芽孢桿菌的基因secA的修復轉位活性的區域進行，其分別顯示在SEQIDNO1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列表中。特別有利的應用特征在于根據(b)的載體是在微生物中自主復制的質粒。另外優選的應用特征在于質粒是多于一個的拷貝數、優選多重拷貝數的質粒。最后本發明還通過提供有合適的載體而實現。因此攜帶必需轉位活性基因和能夠表達轉基因的載體是想要的，但是，如果其作為單個的轉基因出現，則不編碼抗生素抗性。在抗生素抗性的基因是除了根據本發明消除必需轉位活性失活的基因之外僅有的轉基因的情況下，排除該抗性基因目的是為了不在技術上對本申請加以限制。只有在現有技術中，準確地講這些是已經描述與根據本發明能被使用的轉位蛋白的特征有關，才予以考慮。當然這還包括現有技術中通過最普遍的克隆載體已經測序和克隆的基因，準確地講是那些包含抗生素抗性基因作為標記的載體。因此，只包含必需轉位酶和抗生素標記的載體是現有技術已知的。對應于上文所述，根據本發明的載體優選特征在于其上包含的轉基因，優選設計用于蛋白質生產，編碼藥理學相關的非酶蛋白或水解酶或氧化還原酶。這些特征在于待表達的基因具備起作用的啟動子。當然，本發明中所有這類構造體被包括在保護范圍內，其也可編碼藥理學有利的因子，假定這些載體的存在不通過該性質選擇，而是通過必需轉位活性選擇時，其可以介導抗生素抗性。根據選擇體系的細節，某些載體還代表本發明的優選實施方案。這些包括特性在于其編碼的轉位活性能夠消除內源性存在于微生物菌株中失活的必需轉位活性的適當載體，優選通過遺傳相關活性，特別優選通過同一活性。進一步優選，這些包括其特性在于必需的轉位活性是以下因子之一的適當載體SecA、SecY、SecE、SecD、SecF、信號肽酶、b-SRP(Ffh或Ffs/Scr)、FtsY/Srb、PrsA或YajC。其中，特性在于必需的轉位活性是蛋白前體轉位酶的以下亞基之一的載體是優選的SecA、SecY、SecE、secD或SecF，優選SecA亞基。根據本申請的教導，進一步優選的載體特性在于必需的轉位活性是來自枯草桿菌、大腸桿菌或地衣芽孢桿菌secA基因之一，分別顯示在SEQIDNO.1，SEQIDNO.3和SEQIDNO.5的序列表中。此外，若質粒是在使用的微生物中自主復制的質粒，這是根據本發明載體的有利性質。就此而論，尤其是由于基因劑量效應，如果質粒特征在于它們是多于一個、優選多重拷貝數質粒的情況是特別有利的。實施例所有的分子生物學操作遵循標準方法，例如在如Fritsch，Sambrook和Maniatis的″Molecularcloningalaboratorymanual″，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，1989，和可比較的相關論文中表明的方法。根據各個生產商詳述使用酶和試劑盒。實施例1來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的secA基因的分離地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)中secA位點的鑒定為鑒定地衣芽孢桿菌的secA/prfB位點，借助于枯草桿菌prfB-secA基因位點的已知序列通過PCR得到基因探針(Databank″Subtilist″ofthePasteurInstitute，25，28rueduDocteurRoux，75724ParisCEDEX15，France；http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/；日期2002年8月16日)。該基因位點還顯示于圖2。獲得的探針長3113bp，并另外包括prfB基因氨基末端區域的開始451bp。隨后，制備地衣芽孢桿菌的染色體DNA，其可從例如DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeg1b，38124Brunswick(http//www.dsmz.de)序號13獲得，并作為對照，枯草桿菌的染色體DNA使用不同的限制性內切酶消化，并使用提及的探針進行Southern雜交。在用限制性內切酶MunI處理的地衣芽孢桿菌染色體DNA上，鑒定出大小約5.5kB的單個片段，而使用MunI消化地衣芽孢桿菌的染色體DNA產生地衣芽孢桿菌的期望的片段。來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)DSM13的鑒定區域的克隆分離相同株系地衣芽孢桿菌的染色體DNA，預先使用MunI消化，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離大約5.5kB的DNA片段，使用商業上可獲得的試劑盒從中提取核酸。MunI切割獲得的DNA片段的混合物被連接在與MunI匹配的低拷貝數載體pHSG575的EcoRI切割位置(在Gene(1987)，Volume61，pages(63-74)中S.Takeshita；M.Sato；M.Toba；W.Masahashi；T.Hashimoto-Gotoh的″High-copy-numberandlow-copy-numbervectorsforlaczalpha-complementationandchloramphenicol-orkanamycin-resistanceselection″)并轉化成大腸桿菌JM109(從Promega，Mannheim，Germany得到)。進行載體編碼的抗性選擇。另外，藍/白篩選方法(含80μg/mlX-Gal的選擇板)被用于鑒定包含具有插入物載體的克隆。在該方法中獲得200個克隆，其中有可能通過集落雜交鑒定5個攜帶地衣芽孢桿菌secA基因的克隆。通過新鮮的Southern印跡分析使用如上所述的探針進行核對，來源于包含攜帶地衣芽孢桿菌secA基因的MunI片段的pHSG575并包括5.5kB的載體的名稱為pHMH1。限制性分析克隆的5.5kB區域首先通過限制性作圖來確定其特征。為此，使用不同的酶進行pHMH1的單獨消化和雙消化，并通過Southern印跡分析鑒定那些攜帶secA/prfB操縱子部分的片段。由此限制性作圖的結果補充在5.5kB片段的完整序列之后(見下文)，并可以見于圖3。序列分析圖3顯示的5.5kB大小的片段根據標準方法測序到子序列。子序列顯示與以下來自枯草芽孢桿菌的基因具有強的同源性fliT(編碼鞭毛蛋白)、orf189/yvyD(功能未知)、secA(轉位酶結合亞基；ATP酶)和prfB(肽鏈釋放因子2)，與枯草芽孢桿菌具有完全相同的基因序列。這些同樣顯示于圖3。根據這些值，還可以假定來自地衣芽孢桿菌的SecA與來自枯草芽孢桿菌的SecA發揮相同的生化活性，并且從而承擔相同的生理功能。因此它被認為是轉位所必需的酶。根據該實施例確定從此派生的DNA序列和氨基酸序列在SEQIDNO.5或6中給出。因此，翻譯在154位開始，并且在2677到2679位為終止密碼子。從60到65位或從77到82位的子序列推測上被認為是啟動子區域，138到144位推測為核糖體結合位。實施例2含secA基因和枯草桿菌蛋白酶基因的質粒的制備根據實施例1獲得的secA基因使用其自己的啟動子通過PCR從地衣芽孢桿菌的染色體DNA開始擴增。為此，如圖4所示，借助于地衣芽孢桿菌基因的DNA序列選擇引物，其在各自的5’端具有BamHI限制酶切位點。通過這種方法，使用這些引物擴增多片段被克隆到質粒pCB56C的酶切位置處。這在專利申請WO91/02792A1中描述，并且包含來自緩慢芽孢桿菌(BLAP)的堿性蛋白酶基因。該克隆策略還顯示于圖4，產生大小為8319bp的pCB56CsecA載體，除了secA和BLAP基因外，還包含一個編碼四環素抗性的基因。載體pCB56CsecA和用于對照的起始載體pCB56C被轉化進地衣芽孢桿菌，主要是pCB56C轉化進能形成SecA的野生型地衣芽孢桿菌(secA)株系中。就pCB56CsecA而言，進行轉化以同時失活內源的secA。該方法描述于實施例3。在該方式中，獲得兩個菌株地衣芽孢桿菌(ΔSecA)pCB56CsecA和地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C，兩種都能表達質粒編碼的堿性蛋白酶基因。它們在實施例4中進一步研究。實施例3地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA菌株的制備通過刪除載體完成secA基因的關閉。該方法遵循J.Vehmaanper_等(1991)在J.Biotechnol.，Volume19，221-240頁的描述。選擇用于secA刪除的載體是在相同出版物中描述的pE194質粒。該刪除載體的優點在于它具有溫度依賴性的復制起點。在33℃時，pE194可以在細胞中復制，從而在該溫度首先選擇成功的轉化。隨后，包含該載體的細胞在42℃溫育。在這個溫度下，刪除載體不再復制，且通過兩個同源區域(secA的上游和下游區域)中的一個對質粒整合到染色體中的整合作用施加選擇壓力。通過另一個(第二)同源區域的另外同源重組導致secA的刪除。第一個同源區域的重復重組也是可能的。就此而論，載體再次與染色體重組，因此保持染色體的secA。因此secA刪除必需在使用酶限制性消化染色體DNA或借助于PCR技術通過擴增區域的尺寸以后在Southern印跡中檢測。為構建刪除載體，通過PCR擴增位于secA上游和下游的區域。擴增用的引物和隨后克隆用的限制性酶切位點(XbaI和EcoRV)與這些借助于根據實施例1確定的地衣芽孢桿菌secA/prfB位點的DNA序列的選擇有關。就SecA刪除而言，應該考慮到位于secA下游的prfB與secA處于同一操縱子，也就是說沒有其自己的啟動子(比較圖2)。prfB編碼RF2蛋白，其與蛋白生物合成保證蛋白從核糖體的脫離有關。為保證prfB的轉錄，其對蛋白生物合成是重要的，甚至在SecA刪除以后，orf189與其位于secA和下游的secA啟動子之前的自己的終止子被擴增，因此prfB可以在secA刪除以后直接從secA啟動子轉錄(圖5)。在對照步驟中，擴增的區域(orf189′和prfB′)被克隆到大腸桿菌載體pBBRMCS2中。隨后orf189′prfB′構建體的測序表明擴增片段的克隆是正確的。在下一步orf189′prfB′構建體被重克隆到選擇用于刪除的枯草芽孢桿菌DB104的pE194載體中(圖6)。關于這點，使用根據Chang&Cohen，1979的原生質體轉化方法，獲得攜帶刪除載體pEorfprfB的轉化體。所有的操作在33℃下進行以保證載體的復制。在下一步，實施例2描述的pCB56CsecA載體被同樣地通過原生質體轉化方法轉化進攜帶pEorfprfB質粒的地衣芽孢桿菌宿主菌株中。如此獲得和使用常規方法鑒定為陽性的轉化體隨后在42℃時在選擇壓力(對pCB56CsecA的四環素和對pEorfprfB的紅霉素)下選擇兩個質粒的存在。在該溫度下，刪除載體不再復制，只有其中載體整合到染色體上的細胞存活，該整合作用在同源或相同區域以最高概率發生。通過在33℃時無紅霉素選擇壓力下培養，隨后可誘導刪除載體的切除，染色體編碼的secA基因完全從染色體除去。pCB56CsecA質粒保留在細胞中，其介導枯草桿菌蛋白酶合成的能力以及使必需的轉位因子secA可以利用。用這樣的方式獲得的菌株命名為地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA。實施例4質粒穩定性的研究為鑒定攜帶secA枯草桿菌蛋白酶質粒pCB56CsecA的遺傳穩定性，根據實施例2和3獲得的兩個菌株地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C和地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA在不添加抗生素的條件下在搖瓶實驗中的液體培養基中的研究。為此，各自從一個單獨的克隆開始，在所有情況下過夜培養并使用該14mlLB培養基(根據標準配方)在600nm(OD600)光密度為0.05接種。在100mlErlenmeyer搖瓶中進行培養。在各種情況下8-16小時后，培養物被接種到14ml新鮮的培養基中，并在其中依次設定OD600為0.05。培養進行8晝夜，在該方法中培養物被接種共計16次。每天，稀釋液系列被平板涂布，隨機選擇獲得的克隆轉入到蛋白酶檢測平板中。結果顯示于表2和圖7。表2轉化子地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C(對照)和地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA的質粒穩定性，借助于具有蛋白酶活性克隆的各自比例進行檢測對各培養時間而言，全部地衣芽孢桿菌(ΔsecA)pCB56CsecA菌株的克隆顯示蛋白酶活性，而地衣芽孢桿菌(secA)pCB56C單獨的克隆不再具有任何蛋白酶活性。這被解釋為pCB56C質粒的丟失，該丟失另外通過質粒微制備來核對。通過這些數據，因此可明確在沒有添加抗生素，尤其是沒有四環素的LB培養基上，該質粒給予對所述抗生素的抗性，攜帶secA枯草桿菌蛋白酶的pCB56CsecA質粒在ΔsecA菌株中是穩定的，而枯草桿菌蛋白酶pCB56C質粒在沒有染色體secA刪除的菌株中在培養過程中丟失。來自地衣芽孢桿菌的secA基因可以因此消除染色體secA在轉入到表達載體中的不足，且用這樣的方式可以選擇表達另外蛋白基因的細菌培養，在這種情況下為堿性蛋白酶。序列表<110>漢高兩合股份公司<120>用作選擇標記的轉位酶<130>SCT053012-46<140><141><150>DE10309557.8<151>2003-03-04<160>6<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>4148<212>DNA<213>Bacillussubtilis<220><221>CDS<222>(544)..(3069)<400>1gtccgaggtgcataacgaggatatgtacaacgcaattgatctcgcaacaaacaaactgga60acgtcaaatccgtaagcataaaacgaaagtaaaccgtaaattccgtgagcagggctctcc120aaaatatttattggcaaacggtcttggctctgatacagatattgcggttcaggatgacat180agaagaggaggagagcttggacatcgtccgtcagaaacgctttaatttaaagccgatgga240tagtgaagaagcgatcttgcaaatgaatatgctcggccataatttctttgttttcacaaa300tgcggaaacaaaccttacaaatgtcgtgtaccgcagaaatgacgggaaatatggcttaat360tgaaccgactgaataatgaagagaagccttccgtgatgtccgcggaaggtttttgttttt420cttatttgcaaattctttggaaataacaaaaggtatgatatgataatgagaggtatacat480ggactagtaaattatttatacatgcctctaaaataggcgtgtgatgatagaggagcgtta540taaatgcttggaattttaaataaaatgtttgatccaacaaaacgtacg588MetLeuGlyIleLeuAsnLysMetPheAspProThrLysArgThr151015ctgaatagatacgaaaaaattgctaacgatattgatgcgattcgcgga636LeuAsnArgTyrGluLysIleAlaAsnAspIleAspAlaIleArgGly202530gactatgaaaatctctctgacgacgcattgaaacataaaacaattgaa684AspTyrGluAsnLeuSerAspAspAlaLeuLysHisLysThrIleGlu354045tttaaagagcgtcttgaaaaaggggcgacaacggatgatcttcttgtt732PheLysGluArgLeuGluLysGlyAlaThrThrAspAspLeuLeuVal505560gaagctttcgctgttgttcgagaagcttcacgccgcgtaacaggcatg780GluAlaPheAlaValValArgGluAlaSerArgArgValThrGlyMet657075tttccgtttaaagtccagctcatggggggcgtggcgcttcatgacgga828PheProPheLysValGlnLeuMetGlyGlyValAlaLeuHisAspGly80859095aatatagcggaaatgaaaacaggggaagggaaaacattaacgtctacc876AsnIleAlaGluMetLysThrGlyGluGlyLysThrLeuThrSerThr100105110ctgcctgtttatttaaatgcgttaaccggtaaaggcgtacacgtcgtg924LeuProValTyrLeuAsnAlaLeuThrGlyLysGlyValHisValVal115120125actgtcaacgaatacttggcaagccgtgacgctgagcaaatggggaaa972ThrValAsnGluTyrLeuAlaSerArgAspAlaGluGlnMetGlyLys130135140attttcgagtttctcggtttgactgtcggtttgaatttaaactcaatg1020IlePheGluPheLeuGlyLeuThrValGlyLeuAsnLeuAsnSerMet145150155tcaaaagacgaaaaacgggaagcttatgccgctgatattacttactcc1068SerLysAspGluLysArgGluAlaTyrAlaAlaAspIleThrTyrSer160165170175acaaacaacgagcttggcttcgactatttgcgtgacaatatggttctt1116ThrAsnAsnGluLeuGlyPheAspTyrLeuArgAspAsnMetValLeu180185190tataaagagcagatggttcagcgcccgcttcattttgcggtaatagat1164TyrLysGluGlnMetValGlnArgProLeuHisPheAlaValIleAsp195200205gaagttgactctattttaattgatgaagcaagaacaccgcttatcatt1212GluValAspSerIleLeuIleAspGluAlaArgThrProLeuIleIle210215220tctggacaagctgcaaaatccactaagctgtacgtacaggcaaatgct1260SerGlyGlnAlaAlaLysSerThrLysLeuTyrValGlnAlaAsnAla225230235tttg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764公開日2006年4月5日申請日期2004年2月27日優先權日2003年3月4日發明者馬倫·欣茨,羅朗德·弗羅伊德爾,約爾格·費舍,羅朗德·布雷韋斯申請人:漢高兩合股份公司