專利名稱：固定化核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及固定化含核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的應用。
背景技術：
核苷類化合物是許多重要的抗病毒抗腫瘤核苷藥物和其它生化試劑的中間體。其中腺苷可用于合阿糖腺苷和腺苷三磷酸；2，6-二氨基嘌呤核苷DAPR可作為生化試劑用于分子生物學研究；2’-脫氧腺苷dAR是合成2-氯脫氧腺苷的重要中間體；2，6-二氨基嘌脫氧核苷DAPdR為合成2’-脫氧鳥苷的重要中間體。
核苷的制備一般可以由下列方法獲得a.RNA或DNA水解法最初獲得脫氧或非脫氧核苷的方法是通過水解RNA或DNA等天然物質，得到多種核苷的混合物，然后從中分離出所需的核苷。例如，以小牛胸腺脫氧核糖核酸為原料，經脫氧核糖核酸酶(或磷酸二酯酶)和磷酸酯酶水解后，柱層析分離精制可得2’-脫氧腺苷，2’-脫氧鳥苷，2’-脫氧胞苷和胸苷；以酵母核糖核酸亦可以類似的方法獲得四種天然的不脫氧核苷。但這種方法有許多缺點，因為，各種天然生物中含DNA或RNA的量非常有限，而且降解后為多種核苷的混合物，分離提取十分復雜，因此限制了大規模的工業化生產核苷，且所得的核苷僅為天然核苷。
b.發酵法近年來有很多文獻報道了發酵法生產不脫氧的五種天然核苷(腺苷，肌苷，尿苷，胞苷，鳥苷)，并已經取得了很大的進展。其中肌苷和鳥苷已經能夠實現工業化生產，但是對于腺苷，由于生產菌種存在嚴重的不穩定，極大的限制了工業中的應用。
c.化學合成法大多數核苷均可以通過全化學合成來獲得，如一些重要的抗艾滋病藥物齊多夫定、司他夫定和一些抗腫瘤藥物如氟鐵龍等。化學合成法需要對堿基和核糖基的活性基團進行保護和去保護；并且存在光學異構體極難從最終產品中完全去除，影響最終收率；工藝過程中亦需要使用大量有毒有害的有機溶劑，對環境污染亦存在危險；某些嘌呤類脫氧核苷如2’-脫氧腺苷和2’-脫氧鳥苷等，還不能用現行的方法進行合成。
d.酶轉化法很多文獻報道了利用核苷磷酸化酶或N-脫氧核糖轉移酶酶法合成核苷類化合物，詳情請見文獻1“Boorganic Chemistry，1999，27135-154”、文獻2“Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic.1999，6(3)215-222”、文獻3“中國醫藥工業雜志，1999；30(10)474-478”等。
其中文獻“Biocatalysis and Biotransformation，2002，20(5)347-351”報道了用Escherichia coli BL21做催化劑催化合成2’-脫氧核苷，2’-脫氧腺苷的轉化率在45℃下達到了94％，但是所用的尿苷和腺嘌呤的濃度分別為30mM和10mM，而且反應溫度也不是很高，不利于底物的溶解，因此得到的目標產物的終濃度較低，亦即工業上的生產能力較低，另外其采用的是游離菌體，不適合于多次重復利用。在另一篇文獻“Journal of MolecularCatalysis BEnzymatic 10(2000)207-213”中也報道了2’-脫氧核苷的合成，用Enterobacter aerogenes做酶源，其中2’-脫氧腺苷能在較高的濃度下得到較高的轉化率，但是由于使用游離菌體，存在酶易失活等不利因素。文獻“Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic 30(2004)219-227”報道了用聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、瓊脂和瓊脂糖作為固定化微生物的載體，可以酶法高轉化率合成得到各種嘌呤類核苷，其中聚丙烯酰胺固定化Citrobacteramalonaticus CECT863可以重復利用50次以上，但是因所用底物濃度太低，只有0.15mmol/L的尿苷和0.05mmol/L的腺嘌呤，幾乎沒有任何實用價值。
本發明需要解決的技術問題是公開一種固定化核苷磷酸酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的應用，以克服以上技術存在的缺點。
本發明的構思是這樣的采用具有高活力核苷磷酸酶微生物的濕菌體，然后用κ-卡拉膠等作為固定化載體，得到固定化菌體，再直接進行酶催化反應，得到目標產物。其原理是利用微生物產生的胞內嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶進行酶催化反應。將易得的核苷轉化成目標核苷。
本發明的固定化核苷磷酸酶微生物由核苷磷酸化酶微生物和固定化載體構成，其中，核苷磷酸化酶微生物濕菌體的含量為相對于制備好的固定化顆粒的重量的10～30％；所說的濕菌體是指將處于對數生長后期的微生物，在10,000r/min的轉速下進行離心20min，傾去水份，下層的菌泥即可備用。
所說的核苷磷酸化酶微生物選自大腸桿菌、產氣腸桿菌、胡羅卜軟腐歐文氏菌、乙酰短桿菌或乳生分枝桿菌等，這些微生物可以購自各菌種保藏機構，或從自然界中按一定的程序得到，優選的微生物為乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylium)QD96來自于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.0472；所用的固定化載體選自海藻酸鈣、卡拉膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或膠原蛋白等中的一種或一種以上，優選卡拉膠或聚丙烯酰胺，其中以卡拉膠效果最佳；本發明的固定化核苷磷酸化酶微生物的制備方法非常簡單，如采用卡拉膠，可采用包埋法，包括如下步驟
將卡拉膠加入水，沸水浴中攪勻溶脹后，于40℃-45℃保溫備用；離心收集處于對數生長期后期的核苷磷酸化酶微生物濕菌體，加入等量的生理鹽水混勻后，升溫至40℃-45℃，然后與上述卡拉膠載體的備用液混合；攪拌均勻后，倒入盤中，鋪成2-4mm的膜，再置于4℃冰箱冷卻2h，之后切成2-4mm的小顆粒，浸泡于3％的KCl溶液2小時，再用3％的KCl洗兩次，再浸泡于1％的戊二醛溶液1小時，用pH7.0、50mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，瀝去水份(以上操作均在10℃以下進行)，然后密封儲存于4℃冰箱中備用；如采用聚丙烯酰胺，包括如下的步驟在29ml生理鹽水中溶入4.5g丙稀酰胺和0.5g甲叉雙丙稀酰胺，然后加入10g濕菌體，攪勻，再加入5％的β-二甲氨基丙睛和2.5％的K2S2O8各3ml，從而形成聚丙稀酰胺凝膠。用刀具將凝膠切成3mm的顆粒，用1％戊二醛浸泡30min，再用pH7.0、50mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗兩次，瀝去水份(以上操作均在10℃以下進行)，然后密封儲存于4℃冰箱中備用。
采用上述方法制備的固定化核苷磷酸酶微生物，可用于制備核苷類化合物，如腺苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、2’-脫氧腺苷、2，6-二氨基嘌脫氧核苷。
采用所述及的固定化核苷磷酸化酶微生物制備核苷類化合物的方法包括如下步驟將上述固定化核苷磷酸化酶微生物與核糖供體和核糖受體在磷酸鉀緩沖液中進行進行酶催化反應，pH為6.5～7.5，反應溫度為45～55℃，反應時間為1～3h，10mL的反應液中含30～50mmol/L的核糖供體，30～50mmol/L的核糖受體，上述反應體系中，固定化核苷磷酸酶微生物的用量相當于0.5g濕菌體，磷酸鉀緩沖液的用量為40～60mmol/L，然后從反應產物中收集核苷類化合物。
所說的核糖受體選自腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤或次黃嘌呤；
所說的核糖供體選自為肌苷、尿苷、胞苷、5-甲基尿苷、胸苷、脫氧尿苷或脫氧胞苷等。
本發明所述的固定化核苷磷酸酶微生物，可以得到較高的轉化率和較好的酶穩定性。應用以上固定化方法固定的乙酰短桿菌QD96，其酶反應的轉化率與游離乙酰短桿菌的相差不大。在底物濃度為40mmol/L，溫度為50℃，pH7的磷酸鉀緩沖液50mmol/L時，其轉化率都能夠達到60％以上。
固定化菌體反應達到平衡所需的時間需要兩小時(游離菌體為1h)，這可能存在傳質障礙所致，但這并不影響其應用。固定化的乙酰短桿菌重復利用次數明顯高于游離菌體，也即其酶穩定性明顯得到改善。游離的乙酰短桿菌在重復利用3次后，其胞內的核苷磷酸化酶已基本失活，而且即使在上述3次重復利用過程中，每一次都比上一次的轉化率降低，因此游離的乙酰短桿菌并不適合于多次重復利用。固定化的乙酰短桿菌基本上可以重復利用20次左右，而且每兩次之間酶反應轉化率降低較少。因此，這有利于節省培養乙酰短桿菌所需的成本。
所說的轉化率是通過HPLC法測定。方法如下島津液相色譜儀；柱YWG-C18(200mm×4.6mm)；流動相5％乙腈+50mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液；流速1.0ml/min；波長254nm。
圖1為卡拉膠固定化菌體合成2’-脫氧腺苷的重復反應曲線。
圖2為聚丙烯酰胺固定化菌體合成2’-脫氧腺苷的重復反應曲線。
圖3為應用固定化菌體合成DAPdR反應曲線。
圖4為固定化細胞合成DAPR反應曲線。
圖5為固定化細胞合成腺苷反應曲線。
具體實施例方式
實施例1將1.2g卡拉膠加入28.8mL去離子水中，再在沸水浴中溶脹，然后置于40℃水浴中保溫。取10g乙酰短桿菌濕菌體，加入10mL生理鹽水攪勻，然后在40℃水浴中加熱升溫，待溫度達到40℃后，立即與上述卡拉膠保溫液混合，攪勻。倒入盤中，鋪成2-4mm的膜，放置于4℃冰箱中凝固2h，再切成3mm的顆粒，將這些顆粒在3％的KCl溶液中浸泡2h后，再用3％的KCl洗兩次，再浸泡于1％的戊二醛溶液1小時，用pH7.0、50mM的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，瀝去水份(以上操作均在10℃以下進行)，固定好的菌體可以在4℃冰箱中保存備用。
取2.5g固定化的菌體(相當于0.5g濕菌體)進行酶催化反應，反應在下述條件下進行10mL的反應液中含40mmol/L的胸苷(Thymidine)、40mmol/L的腺嘌呤和pH7.0的磷酸鉀緩沖液50mmol/L，反應溫度為50℃，時間為2h。反應完后用紗布過濾收集固定化菌體，再用上述磷酸鉀緩沖液洗兩次，然后重復上述反應。反應結束后于10000r/min離心出菌體，結果見圖1。圖中，曲線a為固定化細胞，曲線b為游離菌體。
實施例2在29ml生理鹽水中溶入4.5g丙稀酰胺和0.5g甲叉雙丙稀酰胺，然后加入10g濕菌體，攪勻，再加入5％的β-二甲氨基丙睛和2.5％的K2S2O8各3ml，從而形成聚丙稀酰胺凝膠。用刀具將凝膠切成3mm的顆粒，用1％戊二醛浸泡30min，再用pH7.0的磷酸鉀緩沖液洗兩次，瀝去水份(以上操作均在10℃以下進行)，固定化好的固定化菌體可儲存于4℃冰箱中備用。
取固定化菌體2.5g，按實施例1所述的方法進行反應。結果見圖2。
實施例3取實施例1和實施例2所制備的固定化細胞各2.5g，按下述反應配方進行反應10mL的反應液中含40mmol/L的胸苷(Thymidine)、40mmol/L的2，6-二氨基嘌呤和pH7.0、50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，反應溫度為50℃，時間為2h。反應完后用紗布過濾收集固定化菌體，再用上述磷酸鉀緩沖液洗兩次，然后重復上述反應。每次反應結束后，都取樣測定生成的2，6-二氨基嘌呤脫氧核苷(DAPdR)。另取濕菌體0.5g，按同樣反應，但是反應時間為1h，反應結束后于10000r/min離心出菌體，重復反應。結果見圖3。
圖中曲線1為卡拉膠，曲線2為聚丙稀酰胺，曲線3為游離菌體。
實施例4同實施例3，但是將胸苷換成肌苷。結果同圖4。圖中，曲線4為卡拉膠，曲線5為聚丙稀酰胺，曲線6為游離菌體。
實施例5同實施例3，但將胸苷和2，6-二氨基嘌呤分別換成肌苷和腺嘌呤。結果如圖5。圖中，曲線7為卡拉膠，曲線8為聚丙稀酰胺，曲線9為游離菌體。
權利要求
1.一種固定化核苷磷酸酶微生物，其特征在于，由核苷磷酸化酶微生物和固定化載體構成，其中，核苷磷酸化酶微生物濕菌體的含量為相對于制備好的固定化顆粒的重量的10～30％；所說的產核苷磷酸化酶微生物選自大腸桿菌、產氣腸桿菌、胡羅卜軟腐歐文氏菌、乙酰短桿菌或乳生分枝桿菌；所用的固定化載體選自海藻酸鈣、卡拉膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或膠原蛋白中的一種或一種以上。
2.根據權利要求1所述的固定化核苷磷酸化酶微生物，其特征在于，核苷磷酸化酶微生物選自乙酰短桿菌CGMCC No.0472。
3.根據權利要求2所述的固定化核苷磷酸化酶微生物，其特征在于，所用的固定化載體選自卡拉膠或聚丙烯酰胺。
4.根據權利要求1、2或3所述的固定化核苷磷酸化酶微生物的應用，其特征在于，用于制備核苷類化合物，如腺苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、2’-脫氧腺苷或2，6-二氨基嘌脫氧核苷。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，包括如下步驟將固定化核苷磷酸化酶微生物與核糖供體和核糖受體在磷酸鉀緩沖液中進行酶催化反應，pH為6.5～7.5，反應溫度為45～55℃，反應時間為1～3h，10mL的反應液中含30～50mmol/L的核糖供體，30～50mmol/L的核糖受體，上述反應體系中，固定化核苷磷酸化酶微生物的用量相當于0.5g濕菌體，磷酸鉀緩沖液的用量為40～60mM，然后從反應產物中收集核苷類化合物；所說的核糖受體選自腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤或次黃嘌呤；所說的核糖供體選自為肌苷、尿苷、胞苷、5-甲基尿苷、胸苷、脫氧尿苷或脫氧胞苷。
全文摘要
本發明公開了一種固定化核苷磷酸酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的應用。本固定化方法具有操作簡單，重復利用性好，載體不易被微生物破壞，反應時間短，酶轉化率高等優點。使用40mmol/L的腺嘌呤或2，6－二氨基嘌呤為核糖或脫氧核糖受體，以40mmol/L的胸苷或肌苷為脫氧核糖或核糖供體，以固定化乙酰短桿菌為酶催化劑，在磷酸鹽存在下，經2h反應可以獲得60％(mol)以上的轉化率，且固定化微生物可以反復使用15－20次左右，能夠很好的應用于工業生產。
文檔編號C12N11/02GK1670207SQ200510024218
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月4日 優先權日2005年3月4日
發明者邱蔚然, 歐伶, 丁慶豹, 洪云海 申請人:上海秋之友生物科技有限公司, 華東理工大學