用于從固定的樣品中制備rna的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于從固定的樣品中制備rna的方法和組合物的制作方法
背景技術：
本申請要求2003年7月25日提交的美國臨時專利申請序列號60/490,325的優先權，將其納入本文作為參考。
1.發明領域本發明一般涉及分子生物學領域。更具體涉及從固定的組織中以高質量和高產量分離RNA的方法和組合物。
2.相關領域描述常常從固定的組織中分離RNA，然而，由于組織的固定過程中涉及的方法，如采用甲醛，所以所獲RNA是片段化的。為了使對RNA樣品的研究有意義，需要維持RNA的完整性。因此，片段化的RNA可能使所分析的RNA的解釋水平，如特定基因的表達水平發生偏差。
采用甲醛作為動物組織的防腐劑已經有超過一個世紀的歷史。它提供的優點是，通過使組織“硬化”維持組織結構，以及起到抗生素的作用以放置組織自然腐爛。這種雙重作用是由它與組織分子，主要是蛋白的迅速發生化學反應而使組織高度交聯產生的。這提供了結構剛性并阻止較大分子在細胞間和細胞內擴散。這能有效放置阻止腐爛，因為它阻止了組織本身及其中攜帶的任何微生物的所有代謝。用可用于采用抽提的RNA和DNA檢測基因和基因表達的現有方法，存檔樣品如動物學和臨床標本能夠提供可用來進行回顧研究大量材料。不幸的是，保藏組織的相同反應也起到使RNA或DNA難于抽提的作用。科學文獻中已經報道了應對這種作用的方法。然而，這些方法受限于它們以非常高的質量或產率獲得RNA的能力(通過類似來源的未固定組織的產率來判斷)。
甲醛通過在生物大分子的氮原子之間形成亞甲基交聯而固定組織。這些化學加合物大多數在蛋白中，小百分數的加合物也涉及核酸堿基。通過形成高度交聯的蛋白“籠”，以及核酸本身參與到有限數量的交聯中將核酸捕獲在固定組織中。從固定組織中回收RNA的公開方法主要集中在通過酶方法去除所有蛋白殘余，但一些方法也嘗試用化學-物理方法。采用蛋白水解降解的方法主要依賴于蛋白酶K，可以在中等變性條件下起作用的氨基酸特異性很低的蛋白酶。該方法的最常見形式是在存在2％SDS的高溫(37℃-65℃)條件下使用它。
文獻中報道了許多聲稱能夠從甲醛固定的組織樣品中回收和分析RNA的方法(參見Masuda等，1999；Danenberg等，美國專利6,248,535和6,428,963；Fang等，2002；Abrahamsen等，2003；Liu等，2002；Van Deerlin等，2002；Karsten等，2002；Godfrey等，2000；Coombs等，1999；Koopmans等，1993；Specht等，2001)。在大多數這些方法中，通過查看經逆轉錄的抽提RNA的PCR產物(“RT-PCR”)進行最終分析。不可避免的是，這些方法中擴增的區域(“擴增子”)的最長僅有幾百個核苷酸，如果采用這些方法的變化形式，即實時PCR或定量PCR，擴增子通常是100個核苷酸或更小。
當應用這些方法并通過電泳分析抽提的RNA時，顯然所獲RNA是高度片段化的，其平均大小在幾百個核苷酸的范圍。估計這些片段提供了RT-PCR分析的模板。通過保證僅去除片段化的RNA，可以容易地實現該結果，其中捕獲交聯物比所獲平均大小片段分離得更開。雖然一些作者主張福爾馬林固定本身使RNA片段化(Krafft等，1997)，但其他人對此表示反對(Masuda等，1999)。
采用檸檬酸鹽和胍鹽的方法也能從固定的組織中獲得高度片段化的RNA(Bock等，2001)。此外，該方法采用高濃度的蛋白酶K、檸檬酸鹽和去污劑，包括還原劑如β-巰基乙醇，這會提高片段化RNA的產生。該方法的缺點是不能維持RNA的完整性(非全長)，也不能以高質量和高產率提供RNA。
趨向于影響細胞中存在的RNA的具體亞組的任何方法均可使RNA的翻譯水平發生偏差。顯然，在盡可能維持完整性的情況下使產率最大化的方法是分離RNA和DNA所最需要的方法。因此，除了獲得高質量的全長和基本全長的RNA外，需要有新的或改進方法以使從固定的組織樣品中獲得全長RNA的產率最大。
發明概述本發明涉及從已固定的生物樣品中獲得核酸—具體是RNA—的方法和組合物。本發明用含有聚陰離子的消化緩沖液或溶液從樣品中分離、抽提和富集RNA(包括全長和基本全長的RNA)而有效獲得RNA。
因此認為，本發明方法和組合物不僅可用于以更佳產率從樣品中獲得RNA，還可用于以更佳產率從樣品中獲得全長RNA。在一些實施方式中，本發明允許從樣品中抽提約或至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或其中任何范圍的任何一種RNA。在一些實施方式中，本發明也允許從樣品中抽提的RNA中約或至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或其中任何范圍是全長或基本全長。術語“基本全長”指RNA看起來或經測定長度至少為350個核苷酸。也認為，本發明方法和組合物允許所抽提的RNA中至少約50％、60、70％、80％、90％或更多RNA是至少約50％、60％、70％、80％、90％或更多完整的。
“消化緩沖液或溶液”應理解為含有一種或多種分解或消化生物樣品內一種或多種物質(如一種或多種細胞組分)的化合物或試劑的緩沖液或溶液(緩沖液是溶液的一種類型)。在本發明的實施方式中，可將消化緩沖液或溶液用于整個細胞以產生裂解物，裂解物指從裂解細胞中釋放的內容物。
以“聚陰離子”的普通和簡單含義使用該術語，即有一個以上，如-2、-3、-4或更多負電荷的化合物。
在特定實施方式中，消化緩沖液所含的聚陰離子是多羧化物(polycarboxylate)，多羧化物指具有至少一個羧酸根(COO-)的化合物。本發明的多羧化物包括檸檬酸鈉、反式-烏頭酸、1，2，4-丁烷三羧酸、1，4-環己烷二羧酸、1，2，3，4，5，6-環己烷六羧酸、異檸檬酸、丙三羧酸、琥珀酸和/或戊二酸。在有一些情況下，消化緩沖液中的多羧化物選自檸檬酸鈉、1，4-環己烷二羧酸、1，3，5-環己烷六羧酸、異檸檬酸和琥珀酸。應理解，在溶液中發現的化合物酸形式可以是聚陰離子，因此，稱酸形式即相當于稱聚陰離子形式的酸。在某些實施方式中，消化緩沖液含有檸檬酸鈉(NaCitrate)。認為消化緩沖液可含有一種以上聚陰離子化合物，消化緩沖液中可含有至少1、2、3、4或更多種這種化合物。
在一些實施方式中，聚陰離子在消化緩沖液中的濃度約在1mM和100mM之間，或約在5mM和50mM之間。在消化緩沖液中或作為樣品終濃度的聚陰離子濃度約為、至少約為或至多約為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多mM，或其中任何范圍。
當將消化緩沖液施加于全細胞、組織或器官時，可用其產生細胞裂解物。當細胞被裂解或其完整性被破壞時產生裂解物。消化緩沖液的組分可包括蛋白酶、核酸酶(尤其是非RNA酶)和/或以化學或酶學方式破壞細胞組分的其它化合物。消化緩沖液可包括一種或多種這種組分。在本發明的具體實施方式
中，消化緩沖液包括蛋白酶(也稱為肽酶或朊酶)，它是一種催化肽鍵斷裂(即蛋白水解)的酶。認為本發明消化緩沖液中蛋白酶的量是能夠使樣品中的細胞裂解的有效量。在其它實施方式中，蛋白酶是蛋白酶K，但本發明不限于此實施方式。蛋白酶濃度可以約為、至少約為或至多約為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000μg/ml或其中任何范圍。
本發明消化緩沖液還可包括鹽，在本發明的一些實施方式中該鹽是鈉鹽。鈉鹽的濃度約為、至少約為或至多約為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500mM或更高，或其中任何范圍。可在緩沖液中提供鈉鹽，如NaCl。此外，可通過多種途徑在緩沖液中提供鈉鹽，如加入一種以上含有鈉的化合物。
認為消化緩沖液的pH，或消化緩沖液的緩沖組分的pH，或含有樣品的消化緩沖液的pH約在6.5和9.5之間，但它可約為、至少約為或至多約為6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5或其中任何范圍。
在本發明的其它實施方式中，消化緩沖液中的緩沖液是TrisCl，它在緩沖液中的濃度可約為、至少約為或至多約為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500mM或其中任何范圍。盡管也可考慮使用其它緩沖液。
在其它實施方式中，消化緩沖液含有去污劑。去污劑，尤其是非變性溫和去污劑可起到溶解樣品的作用。去污劑可以是離子型或非離子型的。尤其認為離子型去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)可用于本發明溶液。去污劑在緩沖液中的濃度可以約為、至少約為或至多約為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％或其中任何范圍。認為去污劑的濃度可以高達使去污劑在緩沖液中可溶的量。
在一個
具體實施例方式
中，消化緩沖液包含2％SDS、200mM TrisCl(pH 7.5)、200mM NaCl和10mM檸檬酸鈉以及500μg/ml的蛋白酶K。在其它實施方式中，尤其考慮到本發明的消化緩沖液和/或任何其它步驟包括變性劑如胍鹽(guanidinium)。在一些實施方式中，消化緩沖液包括的變性劑的濃度約為或至多約為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5M或更高，或其中任何范圍。可以理解本發明方法和組合物將排除導致RNA分子片段化或截短的化合物，或限制它們的量。
可以加入濃縮形式的用于本發明方法的溶液或在試劑盒中以濃縮形式提供它們。該溶液可以是2×、3×、4×、5×、10×或20×。
在一些實施方式中，本發明涉及從固定的組織樣品中獲得RNA的方法，該方法包括(a)將固定的組織樣品與含有聚陰離子和蛋白酶的消化緩沖液接觸以產生裂解物；(b)從裂解物中抽提RNA。在具體實施方式
中，所述聚陰離子是多羧化物，如檸檬酸鈉。這種方法可用于已經固定的生物樣品，可以或可以不將生物樣品包埋在非反應性物質如石蠟中。術語“接觸”應理解為其簡單和普通的涵義，即將溶液和樣品混合在一起。還應理解，它包括術語“孵育”、“暴露”、“浸沒”和“混合”。
在本發明的一些實施方式中，固定的組織樣品和消化緩沖液的比例約為1克組織/5毫升消化緩沖液到1克組織/25毫升消化緩沖液，或者約為1克組織/10毫升消化緩沖液到1克組織/20毫升消化緩沖液。認為任何待抽提RNA的生物樣品與消化緩沖液的比例約為、至少約為或至多約為1克組織對應1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30毫升或更多的消化緩沖液，或其中任何范圍。
可通過任何方法固定組織，可從任何生物來源獲得樣品。也可將樣品包埋在非反應性物質如石蠟中。本發明也包括在產生細胞裂解物之前清除該物質。在一些實施方式中，通過讓樣品與含有有機溶劑的溶液接觸來清除石蠟，這是本領域技術人員熟知的。
將樣品與本發明消化緩沖液接觸的時間量可約為1-6小時或約為4小時。認為該時間量可約為、至少約為或至多約為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分鐘和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多個小時，或其中任何范圍。
可以在包括，或者至少或至多約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃或其中任何范圍的溫度下將樣品和消化緩沖液互相接觸。在一些實施方式中，該溫度約在40℃和55℃之間。在整個孵育期間可以維持或不維持這種溫度。
與消化緩沖液孵育后，可通過，如物理或機械裝置對裂解物進行勻漿。
本發明其它方法涉及用含醇溶液和/或含有非醇有機溶劑(如酚和/或氯仿)的溶液從裂解物中抽提RNA。認為醇溶液至少含有一種醇。醇溶液的醇濃度可以約為、至少約為或至多約為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％，或其中任何范圍。在某些實施方式中，將醇加入裂解物中使裂解物中的醇濃度約為、至少約為或至多約為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90％，或其中任何范圍。在特定實施方式中，加入裂解物中的醇的量使其醇濃度約為33％。在其它實施方式中，加入含有裂解物的混合物的醇量使混合物中的醇濃度為55％。醇包括，但不限于，乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇和甲醇。特別認為乙醇可用于本發明的某些方面。在本發明的一些實施方式中，從裂解物中抽提RNA包括用醇沉淀RNA。可從美國申請序列號10/667,126中獲得分離小RNA分子的方法和組合物，將其納入本文作為參考。
應理解非醇有機溶劑溶液含有至少一種非醇有機溶劑，但它也可含有醇。上述醇溶液的濃度也可適用于含有非醇有機溶劑的溶液的濃度。在特定實施方式中，將等量的1)裂解物和2)酚和/或氯仿混合。
在一些實施方式中，在消化和/或勻漿裂解物后，但在進一步的分離步驟之前，可加入其它化合物。在具體實施方式
中，除醇之外，還向裂解物中加入鹽。該鹽可以是任何鹽，但在某些實施方式中，該鹽是胍鹽或鈉鹽，或其組合。加入裂解物混合物的鹽的量(在加入醇之前)可以使混合物中一種或多種鹽的濃度約為、至少約為或至多約為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5M或更高，或其中任何范圍。在某些實施方式中，將胍鹽加入裂解物中使胍鹽的濃度約在0.5和3M之間。因此，勻漿后加入裂解物的胍鹽的量使胍鹽濃度約為、至少約為或至多約為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0M，或由其衍生的任何范圍。在其它實施方式中，勻漿后將鈉鹽如醋酸鈉或氯化鈉加入裂解物中使該鹽的濃度約為、至少約為或至多約為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5M，或由其衍生的任何范圍。在某些實施方式中，在進行進一步分離步驟之前將以下物質加入裂解物1體積的4M胍鹽，0.2體積pH 4的醋酸鈉，然后是2.75體積(終體積的1.25倍)乙醇。
從裂解物中抽提RNA還可包括使用無機支持物。在一些本發明方法中，將混合了或未混合醇或非醇有機溶劑溶液的裂解物施加于無機支持物上，從支持物上洗脫RNA。無機支持物包括含硅支持物。在一些實施方式中，所稱硅是玻璃。支持物包括但不限于柱和濾器。在其它實施方式中，無機支持物是玻璃纖維濾器或柱。
或者，在一些實施方式中，從裂解物中抽提RNA可包括非硅支持物。該支持物可包括非反應性材料，即不與待分離或待抽提RNA發生化學反應的材料。這種材料包括帶有負電性基團的聚合物或非聚合物。在一些實施方式中，該材料是或含有聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氯乙烯、甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸甲酯。
因此，一些本發明方法包括(c)將醇溶液加入裂解物中；(d)將裂解物施加到無機支持物上；和(e)用洗脫液從無機支持物上洗脫RNA。施加裂解物后，可以洗滌該無機支持物1、2、3、4、5或更多次。在一些實施方式中，洗滌溶液包括醇，在一些情況下，它也包括鹽。在其它實施方式中，該溶液所含的醇濃度約為或至少約為50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％。在特定實施方式中，醇是乙醇。在另外一些實施方式中，洗滌溶液中的鹽濃度約為或至少約為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0M或更高，或其中任何范圍。進行洗滌的溫度約為或至少約為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃，或由其衍生的任何范圍，包括環境溫度。
可用洗脫液從無機支持物上洗脫RNA。在一些實施方式中，洗脫液包括EDTA。洗脫液中EDTA濃度約在0.01mM和1.0mM之間，或者約在0.05mM和0.5mM之間。在特定實施方式中，洗脫液中EDTA的濃度約為0.1mM。當施加洗脫液時，洗脫液和/或無機支持物可以是室溫或將其加熱到約在80℃和100℃之間的溫度。在一些實施方式中，該溫度約為或至少約為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃，或由其衍生的任何范圍。
抽提RNA之后，可對單個或特定RNA分子和/或RNA分子庫(以及分離RNA的整個群體)進行其它反應和/或測定。在有一些情況下，這些反應和/或測定包括擴增RNA或擴增由該RNA產生的DNA分子。例如，可采用RT-PCR產生可以特征鑒定的分子。
在一些實施方式中，可以定量具體RNA分子或RNA群體，尤其是全長RNA。定量包括本領域技術人員已知的任何方法，如包括一種或多種擴增反應或RNA酶保護測定的方法。這些方法包括定量逆轉錄酶-PCR(qRT-PCR)。在一些實施方式中，對分離的RNA進行特征鑒定。從抽提RNA產生cDNA分子。也考慮到，其它特征鑒定和定量測定也可作為本發明的一部分。本發明方法和組合物允許定量和特征鑒定全長RNA。
也可用RNA進行測定，或用其產生用于測定的cDNA。其它測定包括采用分光光度測定、電泳和測序。
本發明也包括實施上述方法的試劑盒和/或包含上述組合物的試劑盒。在一些實施方式中，本發明試劑盒包括以下物質(與上述組合物一致)的一種或多種含有多羧化物和蛋白酶的消化緩沖液；玻璃纖維濾器或柱；洗脫緩沖液；洗滌緩沖液；醇溶液；RNA酶抑制劑；和cDNA構建試劑(如逆轉錄酶)；RNA擴增試劑。
特別認為，關于本發明組合物和/或方法所討論的任何實施方式，以及實施例中的任何實施方式都可以是試劑盒的一部分。
認為可根據本文所述的任何方法或組合物的任何其它實施方式來實施本文所述的任何方法或組合物的任何實施方式。
雖然本公開支持僅指替代項和“和/或”的定義，但是除非明確指出僅為替代項或替代項是互斥的，權利要求書中的術語“或”指“和/或”。
整個本申請中，術語“約”用來指包括用于確定值的裝置或方法的標準差的值。
根據專利法的長期規定，當詞語“一個”和“一種”在權利要求書或說明書中與詞語“包含”結合使用時，指一種或多種，除非特別注明。
通過下面的詳細描述可以明顯看出本發明的其它目的、特征和優點。然而應理解，雖然詳述和具體實施例指出了本發明的具體實施方式
，但是僅以示范性方式給出，因為本領域技術人員從本詳述中可以明顯看出在本發明精神和范圍內的各種改變和修改。
附圖簡要說明下述附圖構成了本說明書的一部分，包括這些附圖是為了進一步說明本發明的某些方面。通過與本文具體實施方式
的詳述結合，參照這些附圖的一幅或多幅，可以更好地理解本發明。


圖1.顯示了用兩種不同的電泳方法-瓊脂糖凝膠系統(OD)和毛細管電泳系統(Aglient)估計的質量的緩慢增加。
圖2.用qRT-PCR測定樣品的GAPDH、FAS、Reccl和DDPK，循環數閾值(cyclethreshold)沒有顯示降低。繪制各樣品的循環數閾值與消化時間圖。
圖3.生物分析儀電泳圖譜顯示了方法之間的比較，用Masuda等(1999)所述的精確方法在檸檬酸鈉的存在下對固定了14周的小鼠肝進行蛋白水解消化，然后用固相抽提步驟終止反應。
圖4.不同溫度下檸檬酸鹽與Mg++的作用。
圖5.在不同溫度下消化的效果。
圖6.NaCl對消化的影響。用OD260估算法來定量所有樣品，推導出每克組織的RNA質量產率。
圖7.根據qRT-PCR測定的Reccl和FAS RNA水平顯示出0.2和0.4M NaCl在2、3和4小時時間點上對所獲RNA質量的影響。
圖8.在Agilent生物分析儀2100 RNA芯片上分析得到的RNA樣品并測定28rRNA的百分數。′Y′柱顯示四個肝的平均數和′S′柱顯示標準差。在這些條件下，優化的檸檬酸鹽濃度是約50mM(log＝1.7)，而在這些條件下SDS的優化濃度為約3.5％。
示例性實施方式的說明本發明克服了本領域已知的現有RNA分離方法的缺陷，提供了在聚羧酸的存在下用蛋白酶K以高質量(如全長RNA)和高產率從固定組織中分離RNA的優化方法。
I.固定含有RNA的組織樣品本發明方法所考慮的組織樣品是固定的組織樣品。可以采用的固定劑包括但不限于沉淀性或非沉淀性固定劑。兩種常用固定劑是甲醛和多聚甲醛。然而，也可將其它固定劑用于固定組織樣品，這些固定劑包括但不限于醋酸、福爾馬林、四氧化鋨、重鉻酸鉀、三氧化鉻、乙醇、氯化汞、甲醇、戊二醛和苦味酸。固定劑及其用途的例子可見于Sambrook等(2000)；Maniatis等(1989)；Ausubel等(1994)；Jones等(1981)；美國專利5,260,048、4,946,669、5,196,182，各自納入本文作為參考。
可固定組織樣品約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時或更多小時；或者約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約1周、約2周、約3周；或者約1月、約2月、約4月、約6月、約8月、約10月；或者約1年或更多年。
固定的組織樣品的例子包括但不限于心、腦、睪丸、肺、骨骼肌以及脾、肝和腎。
而且，可以或可以不將固定組織包埋在非反應性物質如石蠟中。可將本發明方法和組合物施用于任何固定細胞或組織樣品，無論其是否被包埋。
II.消化緩沖液采用消化緩沖液分解細胞組分。本發明認為，在抽提和分析RNA之前可消化固定的組織樣品。為完成此步驟，可采用各種消化緩沖液，可將各種濃度和pH的各種組分用于消化緩沖液以產生裂解物。
用于產生緩沖液如消化緩沖液的各種堿是本領域熟知的。消化緩沖液可包含Tris、TrisHCl、Tris硼酸、Hepes或磷酸鹽緩沖的堿，但不限于此。這種堿的濃度可約為10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250mM或更高。這種堿可以是不同pH。
消化緩沖液或其組分的pH可約為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或更高。
可將鹽，例如但不限于NaCl、LiCl或KCl，用于消化緩沖液中。消化緩沖液中也可以至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000mM或更高的不同濃度包括這些鹽。在一些情況下可以不用鹽。例如，參見Harlow和Lane(1988)；Sambrook等(2000)；Maniatis等(1989)中一系列制成消化緩沖液的合適緩沖液和方法。
認為可將各種去污劑用于從固定的組織樣品中產生裂解物的消化緩沖液中。去污劑可以是離子型去污劑，包括陰離子和陽離子去污劑，或者是非離子型去污劑。非離子型去污劑的例子包括曲通如Triton X系列(Triton X-100、Triton X-100R、TritonX-114、Triton X-450、Triton X-450R)、辛基葡糖苷、聚氧乙烯(9)十二烷基醚、洋地黃皂苷、IGEPAL CA630、正辛基-β-D-葡糖吡喃糖苷(βOG)、正十二烷基-β、C12EO7、吐溫20、吐溫80、聚多卡醇、正十二烷基β-D-麥芽糖苷(DDM)、NP-40、C12E8(八乙二醇正十二烷基單醚)、六乙二醇單正十四烷基醚(C14EO6)、辛基-β-硫代葡糖吡喃糖苷(辛基硫葡糖苷，OTG)、Emulgen和聚氧乙烯10月桂基醚(C12E10)。離子型(陰離子或陽離子)去污劑的例子包括脫氧膽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N-月桂酰肌苷酸和溴化十六烷三甲基銨(CTAB)。在一些實施方式中，可在消化緩沖液中與或不與另一去污劑或表面活性劑一起加入脲。去污劑可以是各種濃度，如至少0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、10％、20％或更高。可用于消化緩沖液的去污劑的例子可見于Harlow和Lane(1988)；Sambrook(2000)；Maniatis等(1989)，各自納入本文作為參考。
消化還可包括具有多個酸基團的聚陰離子，以提高裂解物的質量。這種聚陰離子可包括但不限于多羧化物如反式-烏頭酸；1，2，4-丁烷三羧酸；1，4-環己烷二羧酸；1，2，3，4，5，6-環己烷六羧酸；1，3，5-環己烷三羧酸；異檸檬酸；丙三羧酸；琥珀酸；和戊二酸。
消化緩沖液還可包含蛋白酶或肽酶以裂解細胞，從而分離細胞中的核酸。蛋白酶或者是從蛋白質鏈末端切下氨基酸的外肽酶，或者是在蛋白質內切割肽鍵的內肽酶。一般地，通過作用機理可將蛋白酶進一步分類，如絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和蛋白酶K)；半胱氨酸(硫羥)蛋白酶(如菠羅蛋白酶、木瓜蛋白酶、組織蛋白酶、寄生生物蛋白酶和細菌毒力因子)；天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶、組織蛋白酶、腎素、真菌和病毒蛋白酶)；以及金屬蛋白酶(如嗜熱菌蛋白酶)。市售的蛋白酶K即可用于核酸分離和抽提步驟，因為認為它是切割特異性非常低的高度熱穩定的蛋白酶。采用市售的蛋白酶K制劑，終濃度一般在0.05-1.0mg/ml的范圍內。認為蛋白酶K在待裂解樣品中的終濃度可約為、至多約為或至少約為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50或更多毫克/毫升。
III.RNA抽提方法本發明還提供了從石蠟包埋組織中分離RNA的方法。分離總RNA的許多方法是本領域技術人員所熟知的。參見例如，Chomczynski和Sacchi(1987)。完成該任務的方法可采用Trizol試劑(Gibco Life Technologies)抽提總RNA。Trizol方法包括在攪拌機中勻漿樣品，然后用酚基Trizol試劑抽提。然后，用異丙醇沉淀RNA，用乙醇洗滌，然后再溶解于不含RNA酶的水或0.5％SDS中。
其它方法可采用本領域已知的產品，如RNAzol(Gibco BRL)、TriReagentTM(Molecular Science)、Qiagen的RNEasy總RNA分離試劑盒(Qiagen)、QuickprepTM總RNA抽提試劑盒(Amersham Bioscience)或分離RNA的任何其它生產方法。抽提RNA的其它方法包括但不限于硫氰酸胍和三氟乙酸銫(CSTFA)方法、鹽酸胍方法或氯化鋰-SDS-脲方法。參見Sambrook等(2000)；Maniatis等(1989)；Ausubel等(1994)中RNA抽提方法的例子。
可從各種固定的組織樣品中抽提RNA。這種組織樣品可包括腦、頭、頸、胃腸道、肺、肝、胰、乳腺、睪丸、子宮、膀胱、腎、心的組織，但不限于這些組織。
也可將固體支持物用于從固定的組織樣品中抽提RNA，和用于維持或儲存所抽提的RNA。這種固體支持物可包括但不限于離心柱、離心濾器、小瓶、試管、燒瓶、罐、洗脫柱或裝置、過濾柱或裝置、注射器和/或其它容器。這種支持物還可包括塑料或玻璃珠或聚合物如纖維素。例如參見Sambrook等(2000)或Maniatis等(1989)。
IV.來自固定的組織樣品的RNA的用途A.來自固定的組織樣品的RNA的定量可用各種方法分析或定量獲自固定的組織樣品的RNA，以確定獲得了全長產物。本文提供了定量和分析RNA的方法。定量或分析RNA的總方法可見于Sambrook等(2000)或Maniatis等(1989)。下面提供了采用來自固定的組織樣品的RNA的例子，然而，這些例子并非旨在限制。
1.定量PCR本發明依賴于定量PCR-更具體說是定量RT-PCR-對樣品中的RNA進行定量。該方法可以是半定量或完全定量的。
兩種方法，競爭性定量PCRTM和實時定量PCRTM通過與由連續稀釋的標準RNA的擴增所建立的標準曲線進行比較都能估算出樣品中的靶基因濃度。然而，它們在這些標準曲線產生方法方面具有很大不同。在競爭性QPCR中，將已知濃度的內部競爭者RNA加入連續稀釋的標準樣品和未知(環境)樣品中。共同擴增后，計算標準稀釋度和未知樣品中內部競爭者RNA和靶PCRTM產物的比例，通過用競爭者RNA-靶PCRTM產物比例對標準稀釋度的起始RNA濃度作圖建立標準曲線。假定競爭者RNA和RNA的擴增效率相等，從該標準曲線即可推知后者在環境樣品中的濃度。
在實時QPCR中，標準稀釋度的RNA和含有未知量的RNA的樣品中連續測定擴增產物的累積。將標準樣品中的起始模板濃度與產生特定閾值濃度產物所必需的PCRTM循環數(Ct)關聯建立標準曲線。在測試樣品中，在達到相同Ct后測量靶PCRTM產物累積，它允許從標準曲線內插得到靶RNA濃度。雖然實時QPCR允許在常規分析期間更快速和更容易地測定RNA，但是競爭性QPCR仍然是在環境樣品中定量的重要替代方法。由于存在顯然從標準稀釋度中無法看出的抑制底物和大量背景RNA，已知量的競爭者RNA與靶RNA的共同擴增是校正樣品之間擴增效率的差異的直觀方式。
另一類型QPCR是應用定量PCRTM。常常稱為“相對定量PCR”，此方法測定了特定核酸的相對濃度。在本發明內容中，對分離自固定的組織樣品的RNA進行RT-PCR。
在PCRTM中，每個反應循環中，擴增的RNA的分子數以接近2的因子增加，直到一些試劑變得有限。然后，擴增速率越來越低，直到循環之間擴增靶不再增加。如果以循環數作為X軸并以擴增RNA濃度的對數作為Y軸作圖，通過連接這些繪制點即可形成具有特征形狀的曲線。從第一個循環開始，該線的斜率為正并保持不變。這被稱為曲線的線性部分。某個試劑變得有限后，該線的斜率開始降低，最終變成零。在該點上，擴增RNA的濃度變得漸近于某個固定值。這被稱為曲線的平臺部分。
在PCRTM擴增的線性部分中，RNA濃度與起始靶濃度在反應開始前成正比。通過測定在完成相同循環數量并在其線性范圍內的PCRTM反應中RNA擴增產物的濃度，能夠確定具體靶序列在初始RNA混合物中的相對濃度。如果RNA混合物是由分離自不同組織的RNA合成的cDNA，可針對各組織測定從中獲得靶序列的特定mRNA的相對豐度。PCRTM產物濃度和RNA相對豐度之間的這種正比關系僅存在于PCRTM反應的線性范圍中。
在該曲線的平臺部分，RNA終濃度是由反應混合物中試劑的可用性測定的，并且不依賴靶DNA的初始濃度。因此，在用RT-PCR測定RNA群體中RNA種類的相對豐度之前，必須滿足的第一條件是當PCRTM反應在曲線的線性部分時必須得到擴增PCRTM產物濃度。
對于用定量RT-PCR實驗成功測定具體RNA種類的相對豐度而言，必須滿足的第二條件是必須將可擴增cDNA的相對濃度標準化到某個獨立標準上。RT-PCR實驗的目的是測定具體RNA種類相對于樣品中所有RNA種類的平均豐度的豐度。
大多數競爭性PCRTM方法采用幾乎與靶豐度相同的內部PCRTM標準。如果在其線性相期間取樣PCR擴增產物，那么這些方案是有效的。如果在反應接近平臺相時取樣產物，那么相對過多代表了較低豐度的產物。當檢測RNA樣品的不同表達時，對許多不同RNA樣品的相對豐度的比較有所扭曲，這使RNA相對豐度的不同看起來比它們的實際不同小。如果內標比靶的豐度高得多，這就不是主要問題了。如果內標比靶的豐度高，那么可在RNA樣品之間進行直接線性比較。
上述討論描述了將RT-PCR測定用于從臨床上獲得的材料的理論想法。臨床樣品固有的問題是它們數量不同(標準化成問題)，而且它們質量不同(必須共同擴增一個可靠的內部對照，優選比靶大)。如果以帶有內標的相對定量RT-PCR進行RT-PCR，這兩個問題都可以克服，其中內標是大于靶cDNA片段的可擴增cDNA片段，其中編碼內標的RNA的豐度約比編碼靶的RNA高5-100倍。該測定測量各RNA種類的相對豐度，而不是絕對豐度。
可用具有外部標準操作步驟的更常規的相對定量RT-PCR測定進行其它研究。這些測定它們擴增曲線的線性部分取樣PCRTM產物。必須憑經驗測定各靶cDNA片段的取樣最佳的PCRTM循環數。此外，必須仔細地將從各種組織樣品中分離的各RNA群體的逆轉錄酶產物標準化到可擴增cDNA的相同濃度。這種考慮非常重要，因為該測定測量了mRNA絕對豐度。RNA絕對豐度僅可用作標準化樣品中不同基因表達的測量手段。雖然經驗式地確定擴增曲線的線性范圍和cDNA制劑的標準化是煩瑣和耗時的方法，但是產生的RT-PCR測定比獲自帶有內標的相對定量RT-PCR測定優越。
此優點的一個原因是沒有內標/競爭者的話，可以在擴增曲線的線性范圍中將所有試劑轉化為單PCRTM產物，從而提高該測定的靈敏性。另一原因是僅用一個PCR產物，在電泳凝膠上展示產物或另一顯示方法的復雜性變得更低，背景更低并更容易解釋。
2.變性瓊脂糖凝膠電泳可用變性凝膠系統的瓊脂糖凝膠電泳定量抽提自固定的組織樣品的RNA。凝膠上應包括陽性對照，使任何不尋常結果可歸因于凝膠問題或所分析RNA的問題。可將RNA分子量標記，已知是完整的RNA樣品，或二者用于此目的。包括富集步驟中所用啟動RNA樣品也是一個好主意。
用于Northern印跡的Ambion的NorthernMaxTM試劑包括了變性瓊脂糖凝膠電泳所需的所有試劑。優化這些產品，使其易于使用、安全和背景低，它們包括詳細的使用說明書。采用NorthernMaxTM試劑的替代方式是采用《現代分子生物學方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第4.9部分(Ausubel等，1994)中所述的方法，納入本文作為參考。它比Northern-Max方法更加困難和費時，但它給出相似結果。
3.Agilent 2100生物分析儀也可通過采用毛細管電泳系統的電泳方法分析從固定的組織樣品中抽提的RNA。在本發明中，采用了Caliper RNA 6000 LabChip試劑盒和Agilent 2100生物分析儀。該系統與濃度在50和250納克/微升之間的RNA溶液一起使用最好。通常，加入1微升典型的富集RNA樣品足以獲得良好性能。按照RNA 6000 LabChip試劑盒提供的說明書進行RNA分析。
4.通過UV吸光度評價RNA產率可通過在TE(10mM Tris-HCl pH 8，1mM EDTA)或水中稀釋等分的制備物(通常是1∶50-1∶100的稀釋度)，用分光光度計在260nm和280nm處讀吸光度來測定RNA的濃度和純度。
A260值中1等于40微克RNA/毫升。因此，用A260×稀釋倍數×40微克/毫升來計算RNA濃度(微克/毫升)。下面是一個典型例子10微克總RNA的典型產量是3-5微克。如果將樣品重懸于25微升，這意味著濃度將在120納克/微升和200納克/微升之間變化。用49微升TE以1∶50稀釋一微升制備物。A260＝0.1。RNA濃度＝0.1×50×40微克/毫升＝200微克/毫升或0.2微克/微升。由于用1微升測定濃度后，剩下24微升制備物，所以剩余RNA的總量是24微升×0.2微克/微升＝4.8微克。
5.用RiboGreen評價RNA產率也可采用基于熒光的測定法定量RNA。例如，可采用用于RNA定量的MolecularProbes的RiboGreen基于熒光的測定法測量RNA濃度。RiboGreen試劑對結合核酸顯示出＞1000倍的熒光增強和高量子產率(0.65)，其激發和發射最大值接近熒光素。未結合染料基本上沒有熒光并且具有大消光系數(67,000cm-1 M-1)。RiboGreen測定允許在標準熒光計、濾光片熒光計或熒光小板閱讀儀中檢測低至1.0納克/毫升的RNA-其靈敏性超過溴化乙錠200倍。RiboGreen試劑的線性定量范圍延伸在三個數量級的RNA濃度中。
B.來自固定的組織樣品的RNA的其它用途可用微陣列技術分析獲自固定組織的RNA。例如，陣列，如基因陣列是將一群基因特異性探針打點到其規定位置上的固體支持物。該探針通過雜交定位于來自核酸樣品如RNA樣品群體的互補標記靶上。基因陣列的最常見的用途之一是比較RNA群體的整體表達模式。一般地，可采用分離自兩種或多種組織樣品的RNA。用標記的核苷酸和靶特異性、寡聚dT或隨機序列引物逆轉錄RNA產生標記的cDNA群體。由模板RNA變性得到cDNA，并雜交于相同陣列上。檢測和定量各陣列中的雜交信號。在各個群體之間比較從各基因特異性斑點發射的信號。在樣品中以不同水平表達的基因產生不同量的標記cDNA，這導致陣列上的斑點產生的信號量不同。
廣泛采用從RNA群體到標記cDNA的直接轉化，因為它簡單并基本不受酶偏差的影響。然而，為了使中等稀少的靶能夠被陣列分析檢測，直接標記需要大量RNA來產生足夠的標記產物。大部分陣列操作程序推薦將2.5克聚A或50克總RNA用于逆轉錄(Duggan，1999)。對于不能從他們的樣品中分離這么多RNA的工作人員而言，可采用整體擴增步驟。
這些整體擴增方案中最常引用的是反義RNA(aRNA)擴增(美國專利5,514,545和5,545,522)。反義RNA擴增包括用5′端具有轉錄啟動子如T7 RNA聚合酶共有啟動子序列的寡聚dT引物逆轉錄RNA樣品。第一條鏈的逆轉錄產生單鏈cDNA。第一條cDNA鏈合成后，與cDNA雜交的模板RNA被部分降解，產生RNA引物。然后RNA引物延伸產生具有轉錄啟動子的雙鏈DNA。用合適的RNA聚合酶轉錄該群體產生具有來自cDNA的序列的RNA群體。因為轉錄導致從各DNA模板產生成百上千RNA，所以基本上可實現擴增。在轉錄期間RNA可被標記并直接用于陣列分析，或者可用標記的dNTP逆轉錄未標記的aRNA，產生用于陣列雜交的cDNA群體。在另一情況下，標記靶的檢測和分析是本領域熟知的。可采用的其他擴增方法包括但不限于聚合酶鏈反應(稱為PCRTM；參見美國專利4,683,195、4,683,202和4,800,159，以及Innis等，1988)；和連接酶鏈反應(“LCR”)，公開于歐洲申請號320 308，美國專利4,883,750、5,912,148。PCT申請號PCT/US87/00880中所述的Qβ復制酶也可用作擴增方法。擴增核酸如RNA的其他方法公開于美國專利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291、5,916,779和5,942,391，GB申請號2202328，PCT申請號PCT/US89/01025、PCT申請WO 89/06700、PCT申請WO 88/10315、歐洲申請號329822，Kwoh等，1989；Frohman，1994；Ohara等，1989；和Walker等，1992，各自全文納入本文作為參考。
也可構建cDNA文庫，并用于分析抽提自固定的組織樣品的RNA。這種文庫的構建并用這種文庫分析RNA可見于Sambrook等(2001)；Maniatis等(1990)；Efstratiadis等(1976)；Higuchi等(1976)；Maniatis等(1976)；Land等(1981)；Okayama等(1982)；Gubler等(1983)；Ko(1990)；Patanjali等(1991)；美國專利申請20030104468，各自納入本文作為參考。
可將本方法和試劑盒用于大量篩選。可用本發明方法和組合物產生RNA文庫或DNA文庫。然后可將該文庫用于高通量測定，包括微陣列。本發明者尤其考慮了基于芯片的核酸技術如Hacia等(1996)和Shoemaker等(1996)所述的技術。簡要說，這些技術包括用于快速和準確分析大量基因的定量方法。通過用固定探針陣列，可以采用芯片技術隔離靶分子作為高密度陣列，并根據雜交篩選這些分子(也參見Pease等，1994和Fodor等，1991)。本文所用術語“陣列”指核酸的順序排列。例如，將代表所需來源(如成年人腦)的核酸群體分成可采用所需篩選步驟檢測或耗盡靶基因的最小數量的庫，并可將該庫分布到單個多孔板中。陣列可以是可獲自所需mRNA來源的核酸群體水性懸液，包含包含多個單孔的多孔板，各單孔含有不同核酸群體內容的水性懸液。在美國專利號6,329,209、6,329,140、6,324,479、6,322,971、6,316,193、6,309,823、5,412,087、5,445,934和5,744,305中發現了陣列、它們的用途和它們的實施的例子，將其納入本文作為參考。
微陣列是本領域已知的，它包含在已知位置上特異性雜交或結合了其序列與基因產物(如cDNA、mRNA、cRNA、多肽及其片斷)相對應的探針的表面。在一個實施方式中，微陣列是其中各位置代表用于基因編碼產物(如蛋白或RNA)的獨立結合位點的陣列(即基質)，其中結合位點對應于生物體基因組中大部分或幾乎所有基因的產物。在優選實施方式中，“結合位點”(以下稱為“位點”)是可與特定關聯cDNA特異性雜交的核酸或核酸類似物。結合位點的核酸或類似物可以是，例如合成寡聚物、全長cDNA、比全長短的cDNA或基因片段。
將核酸或類似物連接到可由玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龍)、聚丙烯酰胺、硝酸纖維素或其他材料制成的固體支持物上。將核酸連接到表面上的優選方法是印刷在玻璃板上，總地由Schena等，1995a所述。也參見DeRisi等，1996；Shalon等，1996；Schena等，1995b。也可采用制作微陣列地其他方法，如通過掩蔽(Maskos等，1992)制作。原則上可采用任何類型的陣列，例如尼龍雜交膜上的斑點印跡(參見Sambrook等，2001，將其全文納入用于所有目的)。但是正如本領域技術人員所知，優選非常小的陣列，因為雜交體積會更小。
也考慮到采用生物芯片，它涉及標記分子或分子庫與固定在生物芯片上的靶的雜交。
V.試劑盒在本發明的其它實施方式中，提供了從固定的組織樣品中分離全長RNA的試劑盒。試劑盒中可包含本文所述的任何組合物。在非限制性例子中，試劑盒中可包括固定的組織樣品、從固定的組織樣品中消化和抽提RNA，以及分析或定量所獲RNA的試劑。因此，該試劑盒在合適的容器中包含本文所公開的任何試劑。它也可包括一種或多種緩沖液，如消化緩沖液或抽提緩沖液，以及用于分離得到的RNA的組分。該試劑盒中也可包含用于固定組織的試劑和用于包埋組織的試劑。
可將試劑盒組分包裝在含水介質或凍干形式中。試劑盒的容器通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、罐、注射器或其它容器，將一個組分，優選為合適等分的一個組分置入其中。當試劑盒中組分多于一種時(可將它們包裝在一起)，該試劑盒通常也包含第二個、第三個或其它附加容器，其中分別置入附加組分。然而，一個小瓶中可含有各種組分組合。本發明試劑盒一般也包括裝RNA的容器，和禁止用于商業出售的任何其它試劑容器。這種容器可包括注射成模或吹模塑料容器，其中保留了所需小瓶。當以一種和/或多種溶液的形式提供試劑盒組分時，溶液是含水溶液，尤其優選無菌含水溶液。
然而，可以干燥粉末的形式提供試劑盒組分。當以干燥粉末的形式提供試劑和/或組分時，可通過加入合適溶劑而重建粉末。預計也可在另一容器中提供溶劑。該容器通常包括至少一個小管、試管、燒瓶、罐、注射器和/或其它容器，其中置入了核酸制劑，優選合適分裝的核酸制劑。該試劑盒也可包含第二個容器，含有無菌、藥學上可接受的緩沖液和/或其它稀釋劑。
這種試劑盒也可包括有助于分離抽提的RNA的組分。它也可包括保藏或維持RNA的組分或保護RNA不降解的組分。這種組分可以是不含RNA酶或抗RNA酶的組分。這種試劑盒通常包含適用于各個試劑或溶液的不同容器。
試劑盒也包括使用試劑盒組分以及使用試劑盒中未包括的任何其它試劑的說明書。說明書可包括可實施的改變。
VI.實施例包括以下實施例是為了說明本發明的優選實施方式。本領域技術人員應理解，以下實施例中所公開的技術代表了本發明者發現在本發明實踐中起到良好作用的技術，因此可認為這些技術構成了本發明實踐的優選方式。然而，本領域技術人員根據本公開應理解，對所公開的具體實施方式
進行許多改變仍能獲得相似或類似的結果，而不背離本發明精神和范圍。
實施例1方法固定含有RNA的組織測試了兩種固定劑，甲醛和多聚甲醛。多聚甲醛用磷酸緩沖鹽水(PBS，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.5，150mM NaCl)配成終濃度為4％的溶液使用，甲醛用類似的緩沖液(“10％中性緩沖福爾馬林”，NBF，Fisher Diagnostics，Middletown，VA的Protocol(TM)福爾馬林(目錄號305-510))配成終濃度為3.7％的溶液使用。對任何一種固定劑而言，所用固定程序必須將剛剛從處死的小鼠剪下的組織樣品浸入其中，在0-8℃放置一段特定時間。根據各個例子確定固定時間。將樣品保存在固定劑中或在對標準方法中的乙醇和二甲苯進行一些變化之后將樣品轉移到石蠟塊中。在以下溶液中使組織樣品脫水i) 70％乙醇1小時，ii). 80％乙醇1小時，iii).90％乙醇1小時，iv). 100％乙醇(I)2小時，v). 100％乙醇(II)2小時，vi). 100％乙醇(III)過夜。
該步驟之后是清潔組織和將組織置入以下溶液中的步驟i). 乙醇/二甲苯(1∶1)1小時ii). 二甲苯2小時，iii). 二甲苯2小時，iv). 二甲苯/石蠟(1∶1；55-60℃)2小時，v). 石蠟；55-60℃2小時，vi). 石蠟；55-60℃2小時，vii). 石蠟；55-60℃1小時。
最后一個步驟包括在石蠟模子中用石蠟包埋該樣品塊。這使樣品至少在半年中是穩定的。
RNA抽提對于從石蠟中抽提而言，將組織浸入兩種不同的二甲苯中，50℃ 5分鐘，然后將樣品置入消化緩沖液中。對于仍貯存在固定劑中的組織而言，將樣品浸入一系列乙醇溶液中，如下所述將樣品置入2-5毫升(較大組織需要5毫升)冰上預冷的30％乙醇中，在冰上孵育10分鐘，然后轉移到相同體積冰上預冷的40％乙醇中，再在冰上孵育10分鐘。重復該過程，每次增加10％乙醇，直到達到100％。將組織浸入100％乙醇中，4℃至少過夜。在最后的步驟中，從溶液(乙醇、福爾馬林或二甲苯)中取出組織，在紙巾上干燥。然后將組織樣品轉移到含有200mM TrisCl，pH 7.5，200mMNaCl，10mM檸檬酸鈉，2％SDS和0.5mg/mlPK的消化緩沖液中。
組織與消化緩沖液的比例(克/毫升)在1∶10-20的范圍中。勻漿樣品，直到樣品完全分散，通常需要10-30秒。最方便的是用轉子-定子勻漿器高速勻漿進行該操作。然后在50-52℃孵育樣品4小時，有效范圍是1-6小時，使蛋白酶K能夠消化掉大多數蛋白。這次孵育后，通過加入一半體積的100％乙醇使裂解物中乙醇的濃度為33％。或者，孵育后，將胍鹽和鈉鹽如醋酸鈉(pH 4)加入裂解物，產生約2M的胍鹽濃度(將400微升4M GuSCN加入400微升裂解物)和約0.1-0.2M的醋酸鈉濃度(將80微升pH 4的2M醋酸鈉加入400微升裂解物)；然后，加入乙醇(1.1毫升乙醇)，使溶液的乙醇濃度為55％，然后將裂解物混合物施加到玻璃纖維濾器上。
混合樣品，然后將其施加于RNA水溶性玻璃纖維濾器中，在室溫(RT)下以最大轉速(13,200rpm)離心1分鐘。棄去流出物。將700微升洗滌液1(1.6M硫氰酸胍，0.2％N-月桂酰肌氨酸，10mM檸檬酸鈉，40mM 2-巰基乙醇，0.3M醋酸鈉pH 7.2)施加于濾器，然后在室溫(RT)下以最大轉速(13,200rpm)離心1分鐘。將500微升洗滌液2/3(80％乙醇，0.1M NaCl，4.5mMM EDTA，10mM Tris pH 7.5)施加于濾器，在室溫(RT)下以最大轉速(13,200rpm)離心1分鐘。將500微升洗滌液2/3施加于濾器并在室溫(RT)下以最大轉速(13,200rpm)離心1分鐘。棄去各次洗滌的流出物，以最大速度離心含有樣品的濾器1分鐘。然后將濾器轉移到新的收集管中。將30微升加熱到95-100℃的0.1mM EDTA施加于濾器。樣品在室溫下以最大速度離心30秒。重復該洗脫步驟(施加30微升熱的0.1mM EDTA溶液，以最大離心速度離心30秒)，立即分析洗脫物或儲存于-20℃直到分析。如以下部分所述進行分析。沒有看出延長在-20℃的儲存時間有任何不同。
實施例2電泳分析RNA通過兩種不同的電泳方法檢測RNA樣品。第一種是瓊脂糖凝膠系統(NorthernMax Gly，Ambion)，它提供乙非啶染色圖，并能夠建立Northern印跡以探測特定mRNA(具體是GAPDH和β-肌動蛋白)判斷條帶的存在。第二種是毛細管電泳系統(RNA芯片，Caliper Technologies Corp.，用于2100 Bioanalyzer，Agilent)。根據以下討論的實施例進行此分析。
實施例3用定量RT-PCR(實時或QRT-PCR)分析RNA用定量或實時RT-PCR(Higuchi等，1993；Bustin，2000)定量存在的特定mRNA。通過監測在實際擴增反應期間存在的起初以特定mRNA為模板的PCR產物，能夠確定這些特定mRNA在不同樣品中的相對水平。對本研究而言，靶向四種mRNAGAPDH、Reccl、FAS和DDPK。對各mRNA使用下述RT-PCR引物和探針。
GAPDH-小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapd)，mRNA。登錄號-NM_008084；擴增子-60nt；mRNA大小-1.23kb；mRNA中的靶區域396-455；探針415-434[5’FAM-TGCCGATGCCCCCATGTTTG-3’TAMRA](SEQ ID NO1)；引物-正向5’TCATCATCTCCGCCCCTT(SEQ ID NO2)和反向5’TCTCGTGGTTCACACCCATC(SEQ ID NO3)。Reccl-小鼠復制因子C(Reccl)，mRNA；登錄號-NM_011258；擴增子-83nt；mRNA大小-4.68kb；mRNA中的靶區域2122-2204；探針-2156-2176[5’FAM-CCTTCCGTGAGTGCGAGGCAC-3’TAMRA](SEQ ID NO4)；引物-正向5’CAGCATCAAAGGCTTTTATACAAGTG(SEQ ID NO5)和反向5’TGCCATCGACCTCATCCA(SEQ ID NO6)。FAS-小鼠脂肪酸合酶(Fasn)，mRNA；登錄號-NM 007988；擴增子-122nt；mRNA大小-8.36kb；mRNA中的靶區域6857-6978；探針-6915-6937[5’FAM-CCTGAGGGACCCTACCGCATAGC-3’TAMRA](SEQ ID NO7)；引物-正向5’CCTGGATAGCATTCCGAACCT(SEQ ID NO8)和反向5’AGCACATCTCGAAGGCTACACA(SEQ ID NO9)。DDPK-小鼠蛋白激酶，活化DNA，催化多肽(Prkdc)，mRNA；登錄號-NM_011159；擴增子-127nt；mRNA大小-12.65kb；mRNA中的靶區域3101-3227；探針-3157-3179[5’FAM-AGCAAGTCACTTTTCAAGCGGCT-3’TAMRA](SEQ ID NO10；引物-正向5’TCAAATGGTCCATTAAGCAAACAA(SEQ ID NO11)和反向5’GCTGCACCTAGCCTCTTGAAA(SEQ ID NO12)。
為了比較樣品，將10微升RNA樣品(由等量組織制備的)與2微升RandomDecamers(來自RetroScript試劑盒，Ambion)混合，并在80℃孵育3分鐘。孵育后，加入8微升主要RT混合物(每8微升∶2微升10×RT緩沖液，4微升dNTP混合物(各2.5mM)，1微升(10U)RNA酶抑制劑(RIP)，和1微升(100U)莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV-RT；全部來自RetroScript試劑盒，Ambion))，并在50℃孵育1小時使所有RNA轉錄為cDNA。qPCR之前，通過在92℃孵育10分鐘或儲存于-20℃使MMLV-RT失活。
對qPCR而言，將2微升這種cDNA混合物，以及用于待定量特定mRNA的引物和探針加入采用SuperTaq RealTimeTM試劑盒(Ambion)中所提供組分的18微升PCR主要混合物中[每18微升，2微升10×RealTime緩沖液，2微升dNTP混合物(各2.5mM)，3微升25mM MgCl2，0.4微升50×ROX，0.2微升SuperTaq(1U)，0.4微升探針(終濃度5μM、100nM)，1微升特定引物組(各10μM，終濃度各500nM)，和9微升水]。然后用ABI 7000實時機器監測PCR期間的過程，下面是熱循環條件95℃10分鐘；然后是40輪95℃ 15秒接60℃ 60秒的循環。
實施例4固定的小鼠肝臟的消化時程對固定了27天的小鼠肝樣品進行消化。根據標準條件在50℃下進行消化，在不同時間點上取出200微升等分，如前所述抽提RNA。然后通過在Agilent生物分析儀2100 RNA芯片上電泳和分光光度法定量來分析從各時間點上采集的等量RNA樣品。2100 RNA芯片數據允許定量總RNA質量，將它與由各樣品的OD260所計算的質量比較。圖1顯示了由這兩種方法估計的質量的緩慢增加。樣品質量在2小時前迅速增加，然后在3-5小時時增加速度大大放慢。7小時和過夜(o/n)消化時間似乎能夠提供額外量的RNA。然而，當對等量的這些樣品(代表增加的質量輸入)進行qRT-PCR，測定其GAPDH、FAS、Reccl和DDPK時，循環數閾值并不因此而降低，如圖2所示，其中將循環數閾值對各樣品的消化時間作圖。顯然，在消化過程中，3小時后活性模板mRNA的產率僅有少量增加。在此平臺相期間，注意到基因之間的ΔCt相對保持不變，說明消化時間對各種基因的群體代表性影響很小。
實施例5方法比較Masuda等(1999)報道，能夠用他們的方法從固定樣品中獲得全長RNA(如通過電泳凝膠上rRNA條帶的存在所判斷的)，該方法包括含有MgCl2的蛋白酶K消化溶液，用有機抽提和乙醇沉淀終止。因此，將在檸檬酸鈉的存在下進行蛋白酶水解消化和用如上所述的固相抽提步驟終止的本發明方法與Masuda等(1999)所述用于固定了14周的小鼠肝的準確方法比較。將組織分離，并在消化溶液中勻漿，消化條件按照各方法的說明Masuda法中是45℃ 1小時，本發明中是50℃ 4小時。消化后，用各方法所述的有機或固相抽提來抽提RNA，將Masuda制備中產生的乙醇沉淀物再溶解于相同體積(60微升)中本發明方法中用于洗脫的溶液中。在乙非啶染色的凝膠上和通過Agilent生物分析儀2100 RNA芯片電泳方法用等量(來自等量組織)重復檢測各樣品。圖3中顯示了生物分析儀電泳圖。也顯示了來自由RNA水溶性方法獲得的非固定組織樣品的RNA的性質，以提供參考。從未固定和本發明樣品中能夠明顯看出存在較高分子量范圍的物質，可以看出，樣品中有類似于在標準性質中看到的rRNA峰的峰。
除此直接定量評價外，Agilent 2100 RNA芯片方法也用于定量總RNA質量，將它與由各樣品的OD260計算的質量比較。從這些方法中，由Masuda法通過OD測得的產率是0.187±0.027微克RNA/毫克組織，由生物分析儀測得的產率是0.083±0.025，而由本發明方法用相同方法測得的產率是0.183±0.064和0.191±0.047。從Masuda法獲得的生物分析儀數據較小說明有大量片段化，含有的單-和二核苷酸在生物分析儀分析中不可見。用qRT-PCR分析FAS水平進一步支持了這一推測。通過此方法，Masuda樣品的循環數閾值是35.1±2.4，但本發明樣品僅有26.8±2.1，說明本發明樣品中可擴增FAS mRNA的量約高出2^(35.1-26.8)＝315倍。
而且，Masuda法對每毫克組織提供0.101微克RNA，峰值大小為131nt，僅有1％的曲線下面積的大小范圍大于350nt。這是為了與從未固定(“冷凍”)組織制備的制備物作對比，雖然其產率相似(0.153微克/毫克組織)，但是它約在1830和3130nt處顯示出兩個峰，代表18S和28S rRNA(28S的實際大小應該約為5000nt)，并且區域中86％的曲線下面積大于350nt。用我們的技術處理的樣品也給出相似產率(0.191+/-0.047微克/毫克組織)，但79.1+/-1.3％的面積大于350nt，峰顯示在約2060和約3390處，修飾rRNA的合理大小(小峰甚至更大)。
實施例6在不同溫度下檸檬酸鹽與MG++的作用制成具有相同組分(200mM TrisCl，pH 7.5；200mM NaCl；2％SDS；0.5毫克/毫升PK)的兩種消化緩沖液，他們還含有1.5mM的MgCl2或10mM的檸檬酸鈉。將同一固定的小鼠肝臟的不同塊分別置入這些緩沖液中并勻漿，然后各自以三種途徑分開，并在42℃、50℃和65℃這三種不同溫度下孵育4小時。消化步驟后，用上述固相方法抽提RNA。
在瓊脂糖凝膠和生物分析儀2100上電泳檢測樣品。由生物分析儀和260納米處吸光度定量的結果說明樣品基本相等，OD260測定每克組織中約含有0.8毫克RNA，生物分析儀測定的結果約為它的一半。表象是可變的，在65℃孵育的樣品顯然被降解。將等量的42℃和50℃樣品進行qRT-PCR，測定其GAPDH mRNA，在這兩種溫度下，檸檬酸鈉孵育的樣品中存在更多的活性mRNA(較低Ct，圖4)。
實施例7不同pH的消化作用制成另外兩種消化緩沖液，除了TrisCl外所有組分都與標準緩沖液相同(200mM TrisCl，pH 7.5；200mM NaCl；10mM檸檬酸鈉，2％SDS；0.5毫克/毫升PK)。這兩種緩沖液中用200mM pH 9.0的TrisCl或200mM pH 6.0的MES(Na+)代替了200mM pH 7.5的TrisCl，提供pH 6、7.5或9的替代消化緩沖液。將同一固定小鼠腎樣品的三塊切分，各自在這三種消化緩沖液中勻漿，然后在50℃孵育。孵育4小時和過夜后取出樣品，如上所述在玻璃纖維濾器中抽提RNA。通過瓊脂糖凝膠、生物分析儀2100 RNA芯片和OD260估算質量產率來檢測樣品。pH 6樣品迅速降解，但pH 7.5和9樣品在孵育4小時時相當，但pH 9樣品在孵育過夜后明顯降解得更多。由OD260和Agilent生物分析儀數據得到的質量產率也說明pH 7.5最佳(圖5)。
實施例8NaCl對消化的影響制成另外三種消化緩沖液，除了NaCl外所有組分都與標準緩沖液相同(200mMTrisCl，pH 7.5；200mM NaCl；10mM檸檬酸鈉，2％SDS；0.5毫克/毫升PK)。這三種緩沖液用100mM、400mM或無鹽代替了200mM NaCl。在這些消化緩沖液中分別勻漿四塊固定的小鼠肝臟樣品(最終組織緩沖液比相同)，50℃孵育這些樣品。在特定時間，從各消化物中取出等分，如上所述在玻璃纖維濾器中抽提RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品，樣品之間RNA的質量似乎變化不大，但是沒有見到零鹽樣品的產物。用OD260估算法定量所有樣品，推倒出每克組織的RNA質量產率。此結果見圖6，說明有一些NaCl是良好地抽提RNA所必需的，但任一含鹽緩沖液的產率之間差異很小。為了看到對所獲RNA質量的可能影響，選擇了兩個最佳濃度，0.2M和0.4M NaCl，在2、3和4小時時間點上觀察由如上所述qRT-PCR測定的Reccl和FAS RNA水平。此數據見圖7，顯示出在這兩種濃度之間影響很小，但是0.2M可能稍優。
實施例9檸檬酸鹽的替代物檸檬酸鈉是三羧酸檸檬酸的鈉鹽。也測試了含有多個酸基團的其它常用試劑，以檢測他們是否也具有這種增強效果。選擇了九種化合物反式烏頭酸；1，2，4-丁烷三羧酸；1，4-環己烷二羧酸；1，2，3，4，5，6-環己烷六羧酸；1，3，5-環己烷三羧酸；異檸檬酸；丙三羧酸；琥珀酸和戊二酸。制成一種不含檸檬酸鈉的消化溶液(200mM TrisCl，pH 7.5；200mM NaCl；2％SDS；0.5毫克/毫升PK)，將一塊固定的小鼠肝臟在此溶液中勻漿。然后將勻漿分解成10等分，向各分的1/10體積中加入1M待測試多酸母液。將所有樣品在50℃孵育4小時，然后用正常方法制備RNA。檢測這些樣品各自的產率和在生物分析儀2100上的表現。下表給出了對它們相對于檸檬酸鹽樣品的表現的評價，以及各自的質量產率。

(0＝與檸檬酸鈉相當；+＝優于檸檬酸鈉；-至---＝逐步差于檸檬酸鈉)化合物1，4-環己烷二羧酸和異檸檬酸在本方法中都表現出良好的作用，預計其它多羧化物也是如此。
實施例10石蠟包埋的組織將固定了3個月的小鼠肝和腎組織的樣品如上所述地放入石蠟塊中。用剃刀將這些樣品切片，并以三種不同方式在消化溶液中勻漿直接勻漿石蠟鑲嵌塊；勻漿在50℃的二甲苯中浸沒兩次、每次5分鐘并經過脫蠟的塊；以及勻漿在50℃的二甲苯中浸沒20分鐘然后轉移到乙醇中并在純乙醇中浸沒3次每次3分鐘并經過脫蠟的塊。所有這三種方法都能提供各組織的服從分析的RNA。本方法中已經成功采用了小鼠心、腦、睪丸、肺、骨骼肌和脾，以及如上述實施例所述的肝和腎的固定樣品。
實施例11檸檬酸鹽濃度和SDS的作用收獲四(4)個小鼠肝，在NBF中固定24小時，根據標準方法包埋在石蠟中。包埋在石蠟中一周后，刮掉各肝上過多的石蠟，然后在液氮中完全磨碎。對石蠟/組織粉末進行兩次二甲苯浸沒和兩次乙醇浸沒，以完全去除石蠟，然后將第二次乙醇漿分到九個試管中，每管約100毫克，讓組織沉淀，去除過多乙醇，然后加入消化介質。以含有0.5mg/ml蛋白酶K的各上述緩沖液加上200mM TrisCl pH 7.5，50℃消化3小時。
消化后，加入等體積的4M異氰酸胍(GuSCN)和十分之一體積的2M pH 4的醋酸鈉，然后與1.25體積的乙醇混合。將其施加于玻璃纖維濾器裝置(AmbionRNAqueous試劑盒)上，用1.7M GuSCN/70％乙醇洗滌一次，然后用洗液2和3洗滌，如RNAqueous操作程序和上述實施例1中所述地洗脫。在Agilent生物分析儀2100 RNA Chip上分析產生的RNA樣品，測定28 rRNA百分數(圖8)。‘Y’柱表示四個肝的平均值，‘S’柱表示標準差。在這些條件下，檸檬酸鹽的最佳濃度為約50mM(log＝1.7)，而在這些條件下SDS的最佳濃度為約3.5％。

*******************根據本公開，無需進行額外實驗即可制成和實施本文所公開和要求權利的所有組合物和/或方法和/或裝置。雖然按照優選實施方式描述本發明組合物和方法，但是本領域技術人員能夠明顯看出，可對本文所述組合物和/或方法和/或裝置以及方法中的步驟或步驟順序進行改變，而不背離本發明概念、精神和范圍。更具體說，顯然可用某些化學和生理學相關的試劑替代本文所述的試劑，而實現相同或相似的結果。本領域技術人員明白，所有這種相似替代和修飾注定在如所附權利要求書所限定的本發明精神、范圍和概念內。
參考文獻特別將下述參考文獻納入本文作為參考。
美國專利4,683,195美國專利4,683,202美國專利4,800,159美國專利4,883,750美國專利4,946,669美國專利5,196,182美國專利5,260,048美國專利5,514,545美國專利5,545,522美國專利5,843,650美國專利5,846,709美國專利5,846,783美國專利5,849,497美國專利5,849,546美國專利5,849,547美國專利5,858,652美國專利5,866,366美國專利5,912,148美國專利5,916,776美國專利5,916,779美國專利5,922,574美國專利5,928,905美國專利5,928,906美國專利5,932,451美國專利5,935,825美國專利5,939,291美國專利5,942,391美國專利6,284,535美國專利6,428,963
美國專利申請20030104468美國申請序列號10/667,126。
Abrahamsen等，J.Mol.Diagn.，5(1)34-41，2003。
Ausubel等，《現代分子生物學方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John，Wiley & Sons，Inc，New York，1994。
Bock等，Anal Biochem.，295(1)116-7，2001。
Bustin，J.Mol.Endocrinol.，25(2)169-193，2000。
Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.，162(1)156-159，1987。
Coombs等，Nucleic Acids Res.，27(16)E12，1999。
Efstratiadis等，Cell，7279-3680，1976。
歐洲申請320 308歐洲申請329 822Fang等，Biotechniques，33(3)604，606，608-610，2002。
Frohman，《PCR操作程序方法和應用指南》(PCR ProtocolsA Guide To MethodsAnd Applications)，Academic Press，N.Y，1994。
GB申請2 202 328Godfrey等，J.Mol.Diagn.，2(2)84-91，2000。
Gubler等，Gene，25263-269，1983。
Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring harbor，NY，553-612，1988。
Higuchi等，Biotechnology，11(9)1026-1030，1993。
Higuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，733146-3150，1976。
Innis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(24)9436-9440，1988。
Jones，等，Laboratory Investigations 4432A，1981。
Karsten等，Nucleic Acids Res.，30(2)E4，2002。
Ko，Nucleic Acids Res.，185705-5711，1990。
Koopmans等，J.Virol.Methods，43(2)189-204，1993。
Krafft等，Mol.Diagn.，2(3)217-230，1997。
Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173，1989。
Land等，Nucleic Acids Res.，92251-2266，1981。
Liu等，Diagn.Mol.Pathol.，11(4)222-227，2002。
Maniatis等，Cell，8163-182，1976。
Maniatis，等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988。
Masuda等，Nucleic Acids Res.，27(22)4436-4443，1999。
Ohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865673-5677，1989。
Okayama等，Mol.Cell.Biol.，2161-170，1982。
Patanjali等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881943-1947，1991。
PCT申請PCT/US87/00880PCT申請PCT/US89/01PCT申請WO 88/10315PCT申請WO 89/06700Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，2000。
Specht等，Am.J.Pathol.，158(2)419-429，2001。
Van Deerlin等，Neurochem.Res.，27(10)993-1003，2002。
Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89392-396 1992。
序列表<110>R.C.康拉德(CONRAD，RICHARD)E.策林格(ZERINGER，EMILY)<120>從固定的樣品中制備RNA的方法和組合物<130>AMBI088CN<140>PCT/US2004/024155<141>2004-07-26<150>10/899,386<151>2004-07-26<150>60/490,325<151>2003-07-25<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>1tgccgatgcc cccatgtttg 20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>2tcatcatctc cgcccctt18
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>3tctcgtggtt cacacccatc 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>4ccttccgtga gtgcgaggca c21<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>5cagcatcaaa ggcttttata caagtg 26<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>6tgccatcgac ctcatcca18<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>7cctgagggac cctaccgcat agc 23<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>8cctggatagc attccgaacc t21<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>9agcacatctc gaaggctaca ca 22<210>10<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>10agcaagtcac ttttcaagcg gct 23<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>11tcaaatggtc cattaagcaa acaa 24<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成引物<400>12gctgcaccta gcctcttgaa a2權利要求
1.一種從固定的組織樣品中分離RNA的方法，所述方法包括(a)將固定的組織樣品與含有聚陰離子和蛋白酶的消化緩沖液接觸以產生裂解物；(b)從裂解物中抽提RNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子是多羧化物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多羧化物選自檸檬酸鈉、1，4-環己烷二羧酸、1，3，5-環己烷六羧酸、異檸檬酸和琥珀酸。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述多羧化物是檸檬酸鈉。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化緩沖液含有至多約5％的SDS、約200mM pH 7.5的TrisCl、約200mM NaCl和至多約100mM的檸檬酸鈉，該檸檬酸鈉含有約500μg/ml的蛋白酶K。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子在消化緩沖液中的濃度在約1mM和約100mM之間。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子在消化緩沖液中的濃度約為50mM。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化緩沖液還含有鈉。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化緩沖液中的蛋白酶是蛋白酶K。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化緩沖液的pH在約7.0和約9.5之間。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定的組織樣品和所述消化緩沖液的比例約為1克組織/5毫升消化緩沖液到1克組織/25毫升消化緩沖液。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述固定的組織樣品和所述消化緩沖液的比例約為1克組織/10毫升消化緩沖液到1克組織/20毫升消化緩沖液。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述固定的組織樣品與所述消化緩沖液接觸約1-6小時。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，將所述固定的組織樣品與所述消化緩沖液接觸約4小時。
15.如權利要求13所述的方法，其特征在于，接觸溫度在約40℃和約55℃之間。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，抽提的RNA包括全長RNA。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述抽提的RNA中至少約20％基本是全長的。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述抽提的RNA中至少約50％基本是全長的。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述抽提的RNA中至少約70％基本是全長的。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過以下步驟從裂解物中抽提RNA(c)將醇溶液加入裂解物中；(d)將裂解物施加到無機支持物上；和，(e)用洗脫液從無機支持物上洗脫RNA。
21.如權利要求20所述的方法，其還包括在施加裂解物后洗滌所述無機支持物。
22.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述無機支持物是玻璃纖維濾器或柱。
23.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述洗脫液含有EDTA。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，EDTA的濃度約為0.01mM-1.0mM。
25.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述洗脫液的溫度在約80℃和約100℃之間。
26.如權利要求20所述的方法，其還包括在步驟(c)中在裂解物中加入一種或多種鹽。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，在加入醇溶液之前加入所述一種或多種鹽。
28.如權利要求26所述的方法，其特征在于，加入裂解物的鹽是胍鹽。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，加入裂解物的胍鹽的量使裂解物中胍鹽濃度在約0.5M和約3.0M之間。
30.如權利要求28所述的方法，其特征在于，還將鈉鹽加入裂解物。
31.如權利要求1所述的方法，其特征在于，用含有非醇有機溶劑的溶液從裂解物中抽提RNA。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述非醇有機溶劑是酚。
33.如權利要求1所述的方法，其還包括對從裂解物中抽提出的RNA定量。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，用擴增反應定量RNA。
35.如權利要求1所述的方法，其還包括從抽提的RNA產生cDNA分子。
36.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定的組織樣品是包埋在石蠟中的。
37.如權利要求36所述的方法，其還包括從樣品中清除石蠟。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于，從樣品中清除石蠟包括使包埋的樣品接觸有機溶劑。
39.一種從固定的組織樣品中確定全長RNA的量的方法，所述方法包括(a)將固定的組織樣品與含有多羧化物和蛋白酶的消化緩沖液接觸以產生裂解物；(b)將醇溶液加入裂解物中；(c)將裂解物施加到無機支持物上；(d)用洗脫液從無機支持物上洗脫全長RNA；和，(e)擴增洗脫的RNA。
40.一種從固定的組織樣品中分離全長RNA的試劑盒，它包含(a)含有多羧化物和蛋白酶的消化緩沖液，用來產生裂解物；和，(b)玻璃纖維濾器或柱。
41.如權利要求40所述的試劑盒，其特征在于，所述消化緩沖液約含有至多約5％的SDS、約200mM pH 7.5的TrisCl、約200mM NaCl、至多約100mM的檸檬酸鈉和500μg/ml的蛋白酶K。
全文摘要
本發明提供了用于RNA分離的改進的方法和組合物。在具體實施方式
中，本發明涉及該方法和組合物在從固定的組織樣品中分離全長RNA中的應用。本發明提供了從固定的組織樣品中消化和抽提RNA的方法。
文檔編號C12N15/10GK1878866SQ200480025133
公開日2006年12月13日 申請日期2004年7月26日 優先權日2003年7月25日
發明者R·C·康拉德, E·策林格 申請人:安比恩股份有限公司