本發明屬于農業微生物
技術領域：
，具體涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122在制備淀粉酶、抗細菌藥物和飼料添加劑中的應用。
背景技術：
：：在過去的幾十年中，飼用抗生素的使用對養殖業的發展做出了突出的貢獻，同時，養殖業濫用抗生素導致食品安全和環境問題頻發。因此，隨著社會和科技的發展，人們對食品安全越來越重視，減少飼料中抗生素的使用是大勢所趨。養殖業中濫用抗生素造成負面問題諸多，比如病原菌耐藥性產生、動物機體抵抗力下降、疫病頻發和肉類品質下降等等，導致飼料用藥及治療用藥量越來越高，并且過量使用抗生素容易導致動物生產能力降低。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，其在自然界廣泛分布，所產孢子能分泌許多種酶類物質和生長因子，穩定性極好，同時具有耐氧化、抗擠壓、耐高溫、耐酸等特征，有望成為一種環境友好型飼用微生物。飼料級微生物添加劑是近年來發展起來的一類新型飼料添加劑，研究表明其在提高飼料利用率，增加生產性能，調節腸道微生態平衡，增強免疫力等方面具有顯著的促進作用。目前在飼料及動物生產上使用較多的微生物有乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌及光合細菌，其中芽孢桿菌因其具有抗逆性強、耐高溫高壓、耐酸堿膽鹽、易貯存等獨特的生物學特性，從動物生產和飼養工業角度來說，芽孢桿菌比其它微生物添加劑具有更大的優勢，能更好地滿足飼用微生物現代工業生產的要求。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是我國農業部允許作為飼料添加劑的芽孢桿菌之一，一方面，由于其具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產生抗菌素、促進動物營養的消化吸收、提高動物的飼料轉化率和防病和促進生長等方面起到重要作用，已被越來越多的研制成微生物制劑。另一方面，其制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色”添加劑，現已在畜牧業、飼料行業中有望成為部分替代抗生素，顯示出了重要的社會效益和生態效益。技術實現要素：：本發明的第一個目的是提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122在制備淀粉酶中的應用，所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122，該菌于2016年8月30日保藏于廣東省微生物研究所菌種保藏中心，地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號大院59號樓，保藏編號為：GIM1.1122。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的生物學特征如下：1、菌株形態特征：菌株在NA培養基平板上培養24小時后的菌落呈白色，圓形，表面光滑不透明，邊緣缺刻；革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，具有端生鞭毛，運動，無夾膜，芽孢中生，橢圓形。2、生理生化特征：本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122V-P試驗為陰性；吲哚試驗為陰性；硝酸鹽還原陽性；檸檬酸鹽利用陽性；碳源產酸中的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖為陽性；能水解淀粉、明膠、七葉苷。生長溫度范圍20～55℃，最適pH為6.5～7.5。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的分子分類學地位：提取枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的基因組DNA并對其16SrDNA進行測序，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。將該序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較分析，并從數據庫獲得相關種屬的16SrDNA序列，構建系統發育樹。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122與菌株BacillussubtilisNBRC13719親緣關系最近。因此，確定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122。本發明的第二個目的是提供上述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122在制備抗細菌藥物中的應用。優選，所述的抗細菌藥物為抗金黃色葡萄球菌藥物。本發明的第三個目的是提供上述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122在制備飼料添加劑中的應用。本發明的第四個目的是提供一種飼料添加劑，其特征在于，以上述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122作為活性成份。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122能夠產生淀粉酶，經搖瓶發酵培養48小時后，淀粉酶活性達15.23U/mL；抑菌試驗表明其對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用；經耐受性試驗表明其能耐酸達到pH2.5，耐膽鹽能力為0.6g/mL，能很好的在腸道中生存。因此，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122可作為飼用微生物，應用于飼料添加劑的生產。本發明的實現，為研究與開發新的抗菌藥物和飼料添加劑提供了候選原料，在抗菌藥物和飼料添加劑產業方面具有廣泛的應用前景和重要作用。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122于2016年8月30日保藏于廣東省微生物研究所菌種保藏中心，地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號大院59號樓，保藏編號為：GIM1.1122。附圖說明：圖1是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的透射電子顯微鏡照片(6000倍)；圖2是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122依據16SrDNA序列構建的系統發育樹；圖3是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122水解淀粉效果圖；圖4是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122抑制金黃色葡萄球菌的效果圖。具體實施方式：以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。所用方法及技術，如無特別說明，均為常規方法和技術。實施例1：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的生物學性狀及生理生化和分子鑒定S1.1形態特征枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122在NA培養基平板上培養24小時后，菌落白色，圓形，表面光滑不透明，邊緣缺刻；革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，具有端生鞭毛，運動，無夾膜，芽孢中生，橢圓形(透射電子顯微鏡照片見圖1)。S1.2生理生化特征經生理生化測定，本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122V-P試驗為陰性；吲哚試驗為陰性；硝酸鹽還原陽性；檸檬酸鹽利用陽性；碳源產酸中的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖為陽性；能水解淀粉、明膠、七葉苷。生長溫度范圍20～55℃，最適pH為6.5～7.5，結果見表1。表1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122生理生化特征注：+，陽性；－，陰性；WH，白色；R，桿狀S1.3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的16SrDNA的序列測定與分析S1.3.1DNA模板的快速準備：將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122劃線接種在NA培養基平板上，37℃培養24小時。取單一菌落懸浮于10μL無菌蒸餾水中，于沸水中加熱5min，離心，取上清作為DNA模板。S1.3.216SrDNA基因PCR擴增引物：PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’。PCR反應體系如表2所示：表2.PCR反應體系10×PCR緩沖液5μL2mmol/LdNTP4μL10pmol/LPrimerA1μL10pmol/LPrimerB1μL2U/LTap酶0.4μLDNA模板1μL滅菌ddH2O37.4μL總體積50μLPCR擴增條件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30個循環；72℃，7min。S1.3.3序列測定：PCR產物純化后，測序，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。該序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較分析，并從數據庫獲得相關種屬的16SrDNA序列，構建系統發育樹，如圖2所示。經比較發現，本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122與菌株BacillussubtilisNBRC13719親緣關系最近。因此，確定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122。實施例2：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122水解淀粉試驗淀粉培養基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，可溶性淀粉2.0g，瓊脂20.0g，水1000mL；pH7.2±0.2。盧戈氏碘液：碘1.0g，碘化鉀2.0g，水300mL。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。將滅菌好的淀粉培養基冷卻至45℃左右開始倒平板，待平板冷卻凝固后倒置于37℃恒溫培養箱中放置24小時，目的是控干培養基表面水分和驗證平板沒有污染雜菌。將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122點接于干燥且無菌的淀粉培養基平板上，倒置放置于37℃培養箱中培養24小時。將盧戈氏碘液均勻添加到平板表面，觀察菌落周圍水解圈情況，結果見圖3。從圖3中可知，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122菌落周圍均出現了無色水解圈，說明淀粉培養基中的可溶性淀粉已經被水解，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122能夠產生淀粉酶。實施例3：淀粉酶活力測定營養肉湯培養基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，水1000mL。可溶性淀粉溶液(20g/L)：稱取2.000g(精確到0.001)于燒杯中，加少量水調成獎狀物，邊攪邊拌加入到70mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻后加水定容至100mL。現配現用。原碘液：稱取碘11g，碘化鉀22g，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加水定容至500mL，置于棕色瓶中保存。稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加碘化鉀20g，用水溶解并定容至500mL，置于棕色瓶中保存。磷酸緩沖液(pH6.0)：稱取45.23g磷酸氫二鈉和8.07g檸檬酸，用水溶解并定容到1000mL。現配現用。將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122于營養肉湯培養基中37℃搖瓶發酵48小時后，離心取發酵上清液。取20mL可溶性淀粉溶液于試管中，再加入磷酸緩沖溶液5mL混合均勻后，置于60℃恒溫水浴鍋中預熱8分鐘。加入1mL發酵上清液，立即計時，搖勻反應5分鐘。立即用移液器吸取1mL反應液加入到預先盛有0.5mL鹽酸和5mL稀碘液的試管中，并以0.5mL鹽酸和5mL稀碘液為空白。于600nm波長下用10mm比色皿迅速測其吸光度(A)，從而計算出上清液淀粉酶濃度。經過三次重復實驗，上清液的淀粉酶酶活達到15.23U/mL。實施例4：抑菌試驗將常見的病原菌(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單孢菌，沙門氏菌)用營養肉湯培養好后，混入到滅菌好冷卻到45℃左右的營養瓊脂中，混勻后倒平板，待平板冷卻凝固后用打孔器在上面打孔，整個過程保證無菌操作。然后將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122的發酵液加入到孔中，不要溢出。小心置于37℃培養箱中培養24小時，觀察其現象，若孔洞周圍的病原菌不能生長，說明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122能對該種病原菌有抑制作用。經抑菌試驗，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，見圖4。實施例5：耐酸性試驗以營養肉湯培養基(與實施例3的營養肉湯培養基配方相同)配方為基礎，用稀鹽酸調節pH，使pH分別為1.5，2.5，3.5，4.5四個梯度，將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122接種于營養肉湯培養基中，培養24小時。觀察其生長情況，若能生長，說明能耐受該pH值。經耐酸性試驗，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122能在pH2.5的環境中生存。實施例6：耐膽鹽試驗在營養肉湯培養基(與實施例3的營養肉湯培養基配方相同)中，添加牛膽鹽，使其濃度分別為0.3g/100mL，0.4g/100mL，0.5g/100mL，0.6g/100mL四個梯度，將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122接種于營養肉湯培養基中，培養24小時后，觀察其生長情況，若能生長，說明能耐受該濃度膽鹽值。經耐膽鹽試驗，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122能耐受0.6g/100mL的膽鹽能力，完全能適應動物腸道0.3g/100mL的膽鹽環境中。綜上所述，本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122能夠產生淀粉酶，經搖瓶發酵培養48小時后，淀粉酶活性達15.23U/mL；抑菌試驗表明其對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用；經耐受性試驗表明其能耐酸達到pH2.5，耐膽鹽能力為0.6g/mL，能很好的在腸道中生存。因此，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1.1122可作為飼用微生物，應用于飼料添加劑的生產。本發明的實現，為研究與開發新的抗菌藥物和飼料添加劑提供了候選原料，在抗菌藥物和飼料添加劑產業方面具有廣泛的應用前景和重要作用。當前第1頁1 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