專利名稱：絮凝包含真菌的發酵液的方法
技術領域：
本發明涉及一種改進包含真菌的培養液的絮凝作用的方法。另外，本發明涉及一種改進下游加工能力的方法。
背景技術：
在產業中用真菌表達目的產物時，產率的最優化是一個關鍵因素。通過改進生產菌株的生產能力和/或改進目的產物的下游回收率能夠改善這一點。低回收率可以被分為兩類i)在初級分離和二級過濾期間通量低(lowflux)，和ii)濾液(filtrates)和制成品中出現沉淀物。主要問題是由于轉鼓式過濾期間分離不徹底，培養液中微粒的存在，以及被繼續帶到下游處理步驟中的無機沉淀物的存在而引起的。通過絮凝作用可以改善下游加工步驟，但絮凝作用不是很適合真菌，尤其是絲狀真菌，在絲狀真菌中，生物質(biomass)由菌絲體形式的高度有組織的部分和難以用過濾除去的一定程度的膠狀體組合組成。因此，仍需要研究出能改進真菌發酵期間所產生的目的終產品的下游回收率的步驟。
發明概述本發明通過在收獲培養液以后，進行絮凝作用之前進行裂解(fragmentation)/碎裂步驟提供了這樣一種改進下游回收率的方法，因此，我們要求一種從真菌發酵液中純化細胞外目的產物的方法，包括a)對包含真菌的發酵液進行斷裂/破裂步驟；b)絮凝發酵液；c)實施至少一個分離步驟。
發明詳述在本發明中，通過在收獲真菌發酵培養基以后，進行絮凝作用之前引入斷裂/破裂步驟已經解決了上述的由于分離不徹底(poor separation)，例如轉鼓過濾期間分離不徹底，以及轉鼓濾液中微粒和被繼續帶到下游處理步驟中的無機沉淀物的存在而引起的問題。由于發酵液粒徑差異大，因此很難對真菌發酵液只實施單獨的絮凝步驟。
通常的嘗試都集中在改進生產菌株的特性，從而改進它的絮凝性能上。
然而，在本發明中，在從發酵罐中收獲發酵液之后，通過引入斷裂/破裂步驟已經獲得優良絮凝性能的真菌培養物。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及一種改進包含真菌的發酵液的絮凝作用的方法，其中，在絮凝之前實施斷裂/破裂步驟。
若對真菌發酵液使用絮凝將使下游加工發生改進，因此將獲得更優良的終產品產率和更高的初級分離能力。
本發明因此涉及一種從真菌發酵液中純化細胞外目的產物的方法，包括a)對包含真菌的發酵液進行斷裂/破裂步驟；b)絮凝得到的發酵液；和c)實施至少一個分離步驟。
分離步驟是常規分離步驟，包括不同種類的過濾和用于進一步濃縮的可能的蒸發。
碎裂/破碎作用參照本發明，真菌，尤其是其中生物質由菌絲體形式的高度有結構的部分和一定程度的膠狀體組合組成的絲狀真菌能夠被裂解成在絮凝之后足以通過過濾除去的更小的片。
需要的裂解度取決于所選擇的生產菌株的堅固性。在本發明的一個實施方案中，可以通過對發酵液施用剪切力來獲得合適的裂解度。這種剪切力足以導致裂解，在一個實施方案中，通過混和，攪拌和/或抽吸來提供這種剪切力。
可以利用任何適合的混合器/攪拌器來提供混合和/或攪拌，其中可依照操作期間的流量來調整混合器/攪拌器的尺寸。對于象實驗室發酵規模一樣的小體積，可以使用手持混合器或者廚房攪拌器，對于生產規模中較大的發酵體積，象IKA Ultra TURRAXU混合器可能比較合適。泵也適合于給發酵液施加剪切力，而且也可如上所述，依照操作期間的流量來調節泵的功率。適于本發明的合適的泵的實例有高剪切泵(high shear pumps)和分散泵(dispersion pumps)，例如用于生產規模的IKA模型UTL-150和用于中試(pilot)規模的UTL-25。
依照本發明，可利用加熱發酵液使真菌細胞壁破裂從而產生裂解，來提供其他的破碎方式。因此，在本發明的一個實施例中，通過加熱來提供裂解/破碎。加熱應至少超過34℃，更特別地超過39℃。由想得到的終產物來確定上限，選擇將不會使產物被降解或喪失活性的溫度作為上限。應當注意，為獲得合適的裂解度，熱處理通常需要一定的保持時間。
在另一個實施方案中，通過酶處理或化學處理來提供的斷裂/破裂。這種酶或者化學制劑的實例可以是溶菌酶。
可以通過研究已成碎片的和未成碎片的發酵液樣品來確定裂解度，例如通過顯微鏡來確定。依照本發明，典型的情況是真菌菌絲的平均長度將被降低到小于原有長度的70％，尤其是小于原有長度的60％，優選的是小于原有長度的50％，更優選的是小于原有長度的40％，進一步優選的是小于原有長度的30％。
絮凝在實施斷裂/破裂步驟之后，優選將發酵液稀釋25-300％。稀釋的目的是通過增加懸浮粒子之間的距離，從而讓聚合物(絮凝劑)能夠與膠狀體接觸而使絮凝作用更容易進行。然而，過高的稀釋將導致膠狀體和聚合物之間接觸不良。
絮凝劑選自鹽和聚合物。絮凝劑可以是陽離子，陰離子和/或非離子絮凝劑。首先通過添加，例如氯化鈣或鋁鹽來中和通常帶負電的生物質。由于氯化鈣帶有正電荷，因此可作為電荷中和劑。當生物質的凈電荷達到中性時，生物質將通過疏水性相互作用形成團，這是絮凝過程的第一步。加入的氯化鈣的最少量應為36％溶液的0-5％v/v。加入鋁鹽引起的效果與鈣的效果相似，但鋁鹽也可作為顏色粘合劑起作用。鋁鹽也會產生作為附加濾色鏡的晶格(lattice)，但是這種作用很弱。加入的鋁鹽可以是100％溶液的0-2％(v/v)。
用氯化鈣或鋁鹽或兩者中和生物質之后，生物質的凈電荷接近中性。陽離子聚合物結合這些成團的物質形成后來變得帶正電荷的更大的粒子。加入的陽離子聚合物可達20％溶液的0-6％v/v。最后用陰離子聚合物將這些與陽離子聚合物結合的帶明顯正電荷的大粒子絮凝成更大些的大粒子，依需要加入的陰離子聚合物的量典型地是0.13％溶液的6-8％v/v。
依照本發明，在一個實施方案中，絮凝劑包含GC850(Gulbrandsen，SC，USA)，A130(Cytec Industries，NJ，USA)，C521Cytec(Industries，NJ USA)和CaCl2。
在本發明進一步的實施例中，聯合使用了GC850和C521。在更進一步的實施例中，聯合使用了CaCl2和C521。在更進一步的實施例中，聯合使用了CaCl2和C521，而且pH被調節至7。
當參照本發明選擇可使用的絮凝劑時，必須考慮發酵液的pH，因為pH的變化將改變生物質和加入的化學制劑的凈電荷。在較低的pH，凈電荷變為帶更多正電荷，然而在較高的pH，凈電荷變為帶更多的負電荷。因此，用于生產的化學制劑的有效性決定了是否需要改變pH。
在一個實施方案中，沒有調整pH，因此pH就是發酵液的pH。例如，在絮凝作用中使用GC850和熱凝的情形。在進一步的實施例中，調整了pH。例如，在絮凝作用中使用C521和CaCl2的情形。
因此，在另一個實施例中，pH被調節到pH為4到8的范圍內，特別地被調節到pH為5.5到7.0的范圍內。
本發明的方法適合于改進絮凝作用和純化目的產物，例如純化真菌中產生的蛋白質。在一個特別的實施例中，真菌包含絲狀真菌。
真菌可以從本領域已知的任何真菌獲得目的產物，特別地，可以從本領域已知的任何絲狀真菌獲得目的產物。
在一個優選實施例中，可以從絲狀真菌菌株中獲得目的產物，例如從枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢菌屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、稻瘟菌(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢菌(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節菌屬(Talaromyces)、耐熱子囊屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌株，特別地，可以從尖刺曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、Aspergillus foetidus、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Fusariumbactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、鐮刀菌谷虱螨(Fusarium graminum)、異孢鐮刀菌(Fusarium heterosporum)、Fusariumnegundi、尖芽孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、網狀鐮刀菌(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮刀菌(Fusarium roseum)、接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)、Fusarium sarcochroum、擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、類絲孢鐮刀菌(Fusarium trichothecioides)、Fusarium venenatum、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、產紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)菌株中獲得目的產物。
在一個特別優選的實施方案中，可以從曲霉屬，腐質霉屬或木霉屬，優選從米曲霉菌株，Humicola insolens菌株，或從瑞氏木霉(Trichodermareesei)菌株獲得目的產物。
公眾很容易從許多菌種保藏單位，例如美國典型微生物保藏中心(ATCC)，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和農業研究服務專利收藏，北方區域研究中心(NRRL)獲得這些種的菌株。
對本發明來說，這里使用的與約定來源有關的術語″從...處獲得″指通過該來源或已經插入了該來源的基因的細胞來產生有價值的化合物。
目的產物依照本發明，目的產物是細胞外產物。可以是抗菌素，例如青霉素或頭孢菌素(cephalosporin)或紅霉素(erythromycin)，或者是日用化學制劑，例如檸檬酸。有價值的化合物也可以是多肽，特別是治療性蛋白質，例如胰島素或酶(例如水解酶，轉移酶，裂解酶，異構酶，或連接酶，特別是糖水解酶，纖維素酶，氧化還原酶，蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶或糖酶)。
在下面實施例中，更進一步地舉例解釋了本發明，但實施例決不是對本發明所要求的范圍的限制。
實施例實施例1.絮凝方法的規程和工藝操作條件在分級分批培養絲狀真菌黑曲霉(A.niger)生產淀粉葡萄糖苷酶時測試了本發明的絮凝方法。在收獲以后，將采用絮凝作用的轉鼓過濾機通量與未采用絮凝和/或熱凝進行預處理的轉鼓過濾機通量進行比較。
在預處理期間使用了下列參數稀釋度(在調整水中)是150％，添加的GC850為20％溶液的0.5％(v/v)，加入的CaCl2的濃度為36％w/v溶液的1.5％(v/v)，加入的A130為0.13％w/v溶液的10％(v/v)。
在轉鼓過濾機運行期間對介于6-12.2范圍中間的NTU(比濁法濁度單位)值進行了測量。回收之前未進行絮凝作用的部分培養物的NTU值在15-32的范圍中，但觀察到的其他批次的NTU值在30-60的范圍中。這表明混濁的降低是由絮凝作用引起的。進行了絮凝的部分培養物中的淀粉葡萄糖苷酶活性也改進了16.5％。
當施加絮凝時，在轉鼓過濾期間觀察到的通量與未施加絮凝時的通量相比有顯著的改進。這相當于38-44％的改進。
產品參數的比較顯示產品質量沒有下降。
從施加和沒有施加絮凝時實施的試驗，可以設計出下表1中所示的絮凝條件總準則表1
以發酵液為基礎表明以收獲的培養液的體積為基礎來計算百分比。
實施例2.大規模地測試本發明的方法分別利用下列B1，B2，B3，B4批次來對絮凝方法進行大規模地測試。使用的高剪切泵是由IKA-Machinenbau Janke & Knukel GmbH u.Co KGP79219 Staufen提供的ULTRA TURRAX型ULT-150NR95-1562。B1到B4的每一種培養物代表表達細胞外淀粉葡萄糖苷酶的黑曲霉培養物，以分級分批培養方式對培養物進行發酵。
在所有試驗中都使用了下列安排方式進程圖收獲＝＞通過高剪切泵或分散泵分散＝＞預處理＝＞轉鼓過濾＝＞拋光過濾(polish filtration)＝＞除菌過濾＝＞超濾＝＞蒸發＝＞保存和穩定化在上述進程圖中，通過高剪切泵或分散泵分散代表本發明中破碎/碎裂步驟的一個實例。換句話說或作為補充處理方法，通過熱凝或通過酶或化學處理也可以實現破碎。預處理步驟包含絮凝。
在收獲期間沒有添加CaCl2到發酵液中，并且在收獲5-10小時后開始回收。在預處理期間，稀釋度是200％，溫度未調節，pH被磷酸或氫氧化鈉調節到7.1。在預處理期間加入的CaCl2的濃度為36％溶液到2.1％(v/v)，加入的C521為18％溶液到1.8％(v/v)。在36m2的轉鼓過濾機上實施轉鼓過濾。用Perlite decalite 4208(Dicalite)作為轉鼓過濾機和主體加料(body feed)的預涂層，在操作過程中加入的助濾劑為0-8％之間。將噴水量設置為2.0m3，轉鼓過濾機轉速設置20rpm。A130的量是0.13％(w/v)溶液的6.2％。用磷酸或氫氧化鈉將轉鼓內濾液的pH調節為4±0.2。在拋光過濾(polish filtration)期間，用Celite 512(World Minerals)作為預涂層和主體加料，過濾溫度維持在35℃。用HS 200過濾器墊(Begerow)進行除菌過濾，過濾溫度保持在5℃。在保持濃縮溫度低于10℃的條件下，通過繼續超濾對濾液進行濃縮，直到濾液折射指數達25(RI 25)，接下來在36℃的蒸發溫度為下進行蒸發直到RI 47。在這些試驗中生產的液體產物還沒有熟化，因此所有批次都沒有進行第二次過濾。在中試規模時會實施第二次過濾。
效率改善(up-scaling)方面在實驗室試驗中發現，預處理之前的一個關鍵參數就是裂解水平。在實驗室試驗期間，使用廚房攪拌器以確保發酵液的大小分布平均。在大規模試驗期間，利用ULTRA TURRAX動力混合器來切割真菌的分支結構直至大小分布平均。在兩種情況下，接下來的預處理和絮凝都完成得很好。在大規模實驗期間，因為來源于泵，配管(piping)等的大量剪切力而實現了較好的攪拌混合，而且利用諸如用于生產規模的轉鼓過濾機和用于實驗室規模的濾紙可以實現較好的過濾。觀察到濾液的NTU值比實驗室試驗中濾液的NTU值低已經說明這一點。
絮凝的堅固性是回收處理的一個關鍵方面。通過轉鼓濾液的質量和獲得的最大通量進行判斷發現，在這些試驗期間觀察到的絮凝的堅固性似乎是精細的。
在實驗室規模對絮凝后的發酵液進行了過濾測試，其中觀察到高通量。盡管實驗室試驗到生產規模的設備總體布置存在差異，但在轉鼓過濾期間也觀察到全部批次的高通量。在轉鼓過濾中對NTU進行了監控，并將其作為與實驗室實驗相比較時的過濾效率的評價指標。這表明這一方法的效果是可評估的。
在轉鼓過濾期間觀察到的最顯著的差異是過濾期間絮凝作用除去微粒(fine particles)及其他生物質碎片的效率。沒有進行絮凝的轉鼓過濾顯示涂層慢慢地被生物質碎片及其他微粒滲透。而這最終會使濾液的質量差，也會降低轉鼓過濾機的利用度。
相反，當在試驗期間施加絮凝作用時，沒有觀察到生物質碎片對涂層的滲透。因為預涂層的多孔結構保持開放，而且沒有被生物質碎片污染，因此它對容量的影響是廣泛的。高效除去生物質碎片及其他微粒確保了濾液的低NTU值，因此使下游的過濾更容易進行。
在全部的絮凝試驗中，挑戰了轉鼓過濾機的容量和發酵液通量。將沒有進行破碎和絮凝作用的轉鼓過濾機通量與依照本發明獲得的轉鼓過濾機通量進行了比較。試驗是在36m2的轉鼓過濾機上進行的，通量逐漸增加。在正常回收(沒有進行破碎和絮凝作用)時，平均發酵液通量在40-60L/(m2h)之間變化。在本發明的試驗中，在轉鼓過濾機上實現的最大發酵液通量是125L/(m2h)，并在轉鼓管中保持穩定水平達1.5小時。在所有試驗中，發酵液通量達到110(m2h)是可能的。這相當于通量改進至少90％。
雖然觀察到容量改進和較高的濾液質量，但是過量的絮凝劑A130可以在某種程度上影響絮凝后的發酵液粘到轉鼓預涂層上的能力。必須基于一個一個的實驗(a case by case)來確定其適當用量。
利用在本發明的試驗中觀察到的通量計算出的平均處理時間(預處理和轉鼓過濾)為14.90小時。與正常過程(沒有絮凝作用)相比，利用平均值計算的預處理和初級分離時間縮短了最少10小時，這相當于縮短了40％。
隨后在primus(空白過濾器)上進行的拋光過濾(polish filtration)和在HS 200過濾器墊上進行的除菌(germ)過濾都完成的比較好。通量通常都保持在10-20m3/h的較高范圍。主要因為轉鼓濾液的NTU值低，因此在試驗的拋光或除菌過濾期間沒有觀察到任何問題。降低轉鼓濾液的pH(從pH 7.1到pH 4.0)不會引發任何脂肪酸或無機鹽沉淀。而且，在超濾或蒸發期間也沒有遇到問題。在穩定化期間用稀釋的磷酸再一次進行大的pH調整會引發膠狀(jelly-like)的沉淀物，推測其可能為變性蛋白質。在批次B 3中觀察到這一現象，但沒有出現任何明顯的產率損失。
在全部試驗中，為了計算步產率(step yields)，以每單位操作方式對酶活性進行了測量。依照本發明的方法而改善的平均累積產率相當于產率改進大約10％。
轉鼓過濾機中淤泥(sludge)的較少實質損失或超濾滲透活性下降能夠解釋觀察到的產率增加。絮凝后的發酵液在轉鼓過濾期間除去的淤泥更容易通過下水道排出，也就是說，絮凝后的發酵液的多孔結構似乎更開放。
表2中列出了所有步驟的節約(savings)情形。
表2估計的利用本發明的方法引入絮凝對生產淀粉葡萄糖苷酶(amyloglycosiloase)的可能的減少作用
權利要求
1.一種從真菌發酵液中純化細胞外目的產物的方法，包括a)對包含真菌的發酵液進行斷裂/破裂步驟；b)絮凝發酵液；c)實施至少一個分離步驟。
2.權利要求1所述的方法，其中通過給發酵液施加剪切力來提供斷裂。
3.權利要求1所述的方法，其中通過加熱來提供斷裂/碎裂。
4.權利要求1所述的方法，其中通過酶或化學處理來提供斷裂/碎裂。
5.權利要求3所述的方法，其中發酵液被加熱到34℃以上。
6.權利要求3所述的方法，其中發酵液被加熱到39℃以上。
7.權利要求2所述的方法，其中通過攪拌，混和和/或抽吸來提供這種剪切力。
8.權利要求1所述的方法，其中通過加入絮凝劑來提供絮凝。
9.權利要求8所述的方法，其中絮凝劑選自鹽和聚合物。
10.權利要求1所述的方法，其中發酵液的pH被調節到pH為5.5到7.0的范圍內。
11.權利要求1所述的方法，其中真菌是絲狀真菌。
12.權利要求11所述的方法，其中絲狀真菌選自枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢菌屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬和木霉屬。
全文摘要
一種從真菌發酵液中純化細胞外產物的方法，包括a)對包含真菌的發酵液進行斷裂/破裂步驟；b)絮凝發酵液；c)實施至少一個分離步驟。
文檔編號C12N1/16GK1902321SQ200480039604
公開日2007年1月24日 申請日期2004年10月29日 優先權日2003年10月31日
發明者本杰明·R·克努森, 普拉尚特·艾耶 申請人:諾維信公司