專利名稱：功能性絲狀真菌檢測方法、含有功能性絲狀真菌制品的評價方法和引物對的制作方法
技術領域：
本發明涉及功能性絲狀真菌檢測方法、含有功能性絲狀真菌制品的評價方法和引物對。
背景技術：
已知絲狀真菌，即霉，具有各種功能，還已知例如病原性絲狀真菌引起植物病害。 病原性絲狀真菌是使圓白菜、黃瓜、西紅柿、茄子、油菜等許多蔬菜、稻等農產品，以及花、樹木、草坪等中發生枯萎病、根腐病、葉腐病、枯萎病等病害的原因。作為這些絲狀真菌，熟知的有絲核菌屬、鐮刀菌屬、腐霉屬、木霉屬、核盤菌屬等。作為針對這種病原性絲狀真菌的有效的植物病害防除方法，可以列舉使用微生物、尤其是絲狀真菌的植物病害防除劑(例如，國際公開第97/31521號小冊子和國際公開第2006/085567號小冊子)。人們已經了解，一般來說，細菌類與絲狀真菌類中，增殖和活性所適宜的生長條件不同。因此，人們希望使用在適于病原性絲狀真菌的生長的條件下可以發揮植物病害防除功能的功能性絲狀真菌來代替細菌的植物病害防除劑比使用細菌類的植物病害防除劑有更大的效果。其中，使用屬于墨汁鬼傘科的絲狀真菌的植物病害防除劑， 其功能高(參照國際公開第2006/085567號小冊子)。可是，為了使用這種功能性絲狀真菌作為植物病害防除劑，需要使之以適度的密度存在于土壤或堆肥中，使之發揮適當的植物病害防除功能，并使這種功能得以維持。為了簡便地利用功能性絲狀真菌的規定功能，有時也在土壤或堆肥、固體培養基或固定化載體中接種功能性絲狀真菌，制造含有功能性絲狀真菌制品。在制造這種含有功能性絲狀真菌制品時，在制造、保管或搬運等過程中，必須適當監控功能性絲狀真菌濃度。近年來，開發了使用分子生物學的手法進行菌的鑒定、檢測的技術。例如，在特開 2007-268471號公報中，通過提供一種檢測存在于有機性廢棄物或廢水等沼氣發酵處理污泥中的與沼氣生成相關的沼氣生成細菌和酸生成細菌，評價其活性的方法，公開了沼氣發酵裝置的適當運轉管理指標和運行控制方法。該方法利用了綜合性地定量檢測屬于酸生成細菌的真正細菌群或具有沼氣生成能力的沼氣生成菌群的方法，其包括使用PCR法定量檢測DNA和RNA濃度，經時監控的步驟。此外，特開2007-174973號公報公開了能夠高精確度、迅速、簡便且便宜地對農產物(谷類、蔬菜)、畜產品(肉類)、水產品(魚類和貝類)、毛發、體液、微生物等試樣中所含的DNA進行DNA擴增和分析的技術。該方法包括通過PCR反應擴增試樣中的DNA的工序， 該PCR擴增工序使用SSR引物對，通過多重PCR進行。然而，在土壤和堆肥中，除了作為目的物的功能性的絲狀真菌以外，還存在各種絲狀真菌和細菌類。為了從這種土壤或堆肥等中，只監控特定的功能性絲狀真菌，就需要呈現出特異性極高的檢測方法。而且，需要適當進行接種功能性絲狀真菌而獲得的含有功能性絲狀真菌制品的評價的評價方法。
發明內容
本發明的目的是提供能夠以高精確度檢測功能性絲狀真菌短矮鬼傘 (Coprinellus curtus)的功能性絲狀真菌檢測方法和含有功能性絲狀真菌制品的評價方法。本發明的第一個方式是提供功能性絲狀真菌檢測方法，其使用選自(1)具有序列號1所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，( 具有序列號2所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，( 具有序列號3所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，和(4)具有序列號4所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸中的至少1 個多核苷酸，檢測試樣中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘。本發明的第二個方式是含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，該方法是含有功能性絲狀真菌短矮鬼傘的含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，其包括對來源于前述含有功能性絲狀真菌制品的試樣，使用由序列號1或序列號3所示的堿基序列或與其實質相同的堿基序列構成的多核苷酸，和由序列號2或序列號4所示的堿基序列或與其實質相同的堿基序列構成的多核苷酸所構成的引物對，進行定量PCR，基于前述定量的PCR的結果，評價前述含有功能性絲狀真菌制品中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘的存在或濃度。本發明的第三個方式是提供由下述多核苷酸構成的引物對(1)具有序列號1或序列號3所示的堿基序列或與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸、(2)具有序列號2或序列號4所示的堿基序列或與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸。本發明的第四個方式是提供下述任意一個多核苷酸或選自下述多核苷酸中的至少2個構成的多核苷酸組(1)具有序列號1所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸、(2)具有序列號2所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸、( 具有序列號3所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸、(4)具有序列號4所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸。
圖1是為了獲得本發明引物組而使用的GM-21株的序列。圖2是表示使用實施例1中這種GM-21株的實時PCR的Ct值的圖。圖3是表示使用實施例1中這種超純水樣品的實時PCR的Ct值的圖。圖4是表示實施例1中這種GM-21株濃度與引物組A的實時PCR的Ct值之間的關系的圖。
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圖5是表示實施例3中這種不同種類的微生物與引物組A的實時PCR的Ct值的圖。圖6是表示通過實時PCR測定實施例4中這種GM-21株接種懸浮液、堆肥中的 GM-21株濃度的圖。圖7是經時表示實施例5中的這種功能性堆肥制造工序中的堆肥內的細菌類濃度的變化的圖。圖8經時表示實施例5中的這種功能性堆肥制造工序中的堆肥內的GM-21株濃度變化的圖。
具體實施例方式本發明的檢測功能性絲狀真菌短矮鬼傘的方法為，使用選自下述中的至少1個多核苷酸檢測試樣中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘(1)具有 GTGTTGCATGTAGCTGCCTCCTC(GM2125F 序列號1)所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，( 具有T GACGCGAGAGTTATCCAGACCTAC (GM2152R 序列號2)所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，( 具有 GTGTTGGTTGTAGCTGCCTCCTC(GM2127F 序列號3)所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，和(4)具有 TGGTAATTCGAGGAGAGGCAC(GM2172R 序列號4)所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸。由于這些多核苷酸表現出對功能性絲狀真菌短矮鬼傘的高特異性，因此通過使用這些多核苷酸，可以高精確度檢測到試樣中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘。此外，本說明書中所謂“工序”的術語，不僅是獨立的工序，而且在無法與其它工序明確區別的情況下，如果可以達到本工序的預期的作用，也都包含在該術語中。此外，本說明書中所示數值范圍包括其左右的數值。由于可以明確地將上述GM2125F、GM2127F、GM215^ 或GM217^ 或它們的組合與近緣種區別開，進行檢測，因此非常適于高精確度且特異性地檢測作為目的物的功能性絲狀真菌短矮鬼傘。GM2125F、GM2127F、GM2152R 和 GM2172R 對應于圖 1 所示的包含 GM-21 株的 18S ( — 部分)、幾51、5.85、幾52、洸5(—部分)的序列(序列號12)的663個堿基區域中，第46位到第68位(序列號1和序列號3)和第119位到第143位的序列(序列號2)，和第168位到第188位(序列號4)。該區域是保守性較低的區域，對短矮鬼傘的特異性特別高。因此， 通過使用對應于該區域的GM2125F、GM2127F、GM2152R或GM2172R或它們的組合，可以高精確度檢測短矮鬼傘。而且，與這些序列分別互補的序列和與這些互補序列實質相同的序列，也可以用于高精確度檢測功能性絲狀真菌短矮鬼傘，與GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R—樣， 可以在本發明的檢測方法中使用。這里所稱的實質相同的序列，是指與GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R的各序列或與它們各自互補的序列同等程度、具有可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的同源性的序列，作為這種序列，可以列舉取代、缺失、添加了 1 5個堿基左右的數個堿基的序列。 這種數個堿基不同的實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列，可以列舉例如，具有在4XSSC 65°C下雜交，然后在0. IXSSC 65°C下1小時清洗這種一般雜交條件下，與GM2125F、GM2127F、GM2152R、GM2172R或與它們互補的序列雜交的堿基序列的多核苷酸。與GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R的各序列或與它們各自互補的序列實質相同的序列中，作為更優選的序列，可以列舉下述表1記載的PCR條件下可以擴增的序列， 它們是對上述GM2125F、GM2127F、GM2152R和GM2172R的各序列或與它們各自互補的序列， 在其3’末端側取代或添加1 3個堿基，在5’末端側取代或添加1 5個堿基，或在各個末端側連續缺失1 5個堿基的序列。如果是這種實質相同的序列，它們與上述GM2125F、 GM2127F、GM2152R和GM2172R的序列一樣，可以用于包括PCR技術在內的各種檢測方法。[表 1]
權利要求
1.功能性絲狀真菌檢測方法，使用選自(1)具有序列號1所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，(2)具有序列號2所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，(3)具有序列號3所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸，和(4)具有序列號4所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸中的至少1個多核苷酸，檢測試樣中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘。
2.根據權利要求1所述的功能性絲狀真菌檢測方法，包括使用由序列號1或序列號3 所示的堿基序列或與其實質相同的堿基序列構成的多核苷酸，和由序列號2或序列號4所示的堿基序列或與其實質相同的堿基序列構成的多核苷酸所構成的引物對，進行PCR。
3.根據權利要求1所述的功能性絲狀真菌檢測方法，包括使用由序列號1所示的堿基序列構成的多核苷酸，和由序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸所構成的引物對， 進行PCR。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的功能性絲狀真菌檢測方法，所述功能性絲狀真菌短矮鬼傘是短矮鬼傘GM-21 (NITE BP-37)。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的功能性絲狀真菌檢測方法，所述試樣是選自土壤試樣、堆肥試樣、培養物試樣和固定化物試樣中的至少1種。
6.含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，該方法是含有功能性絲狀真菌短矮鬼傘的含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，包括對來源于所述含有功能性絲狀真菌制品的試樣，使用由序列號1或序列號3所示的堿基序列或與其實質相同的堿基序列構成的多核苷酸，和由序列號2或序列號4所示的堿基序列或與其實質相同的堿基序列構成的多核苷酸所構成的引物對，進行定量PCR，基于所述定量的PCR的結果，評價所述含有功能性絲狀真菌制品中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘的存在或濃度。
7.根據權利要求6所述的含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，所述引物對是由序列號1所示的堿基序列構成的多核苷酸，和由序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸所構成的引物對。
8.根據權利要求6或7所述的含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，所述含有功能性絲狀真菌制品是通過包括以下步驟的方法獲得的功能性堆肥對處于細菌類活動限制狀態的堆肥接種所述功能性絲狀真菌短矮鬼傘，在所述堆肥內培養所述絲狀真菌，使之選擇性增殖。
9.根據權利要求6 8中任一項所述的含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，所述功能性堆肥還含有在絲狀真菌的生長發育條件下可以活動的能夠與絲狀真菌共存生長的細菌類。
10.根據權利要求6 8中任一項所述的含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，所述功能性堆肥還包括在絲狀真菌的生長發育條件下可以活動的能夠與絲狀真菌共存生長的細菌嗜鹽枝芽孢桿菌130-1 (FERM BP-10975)。
11.由下述多核苷酸構成的引物對(1)具有序列號1或序列號3所示的堿基序列、或與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(2)具有序列號2或序列號4所示的堿基序列、或與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸。
12.下述任意一個多核苷酸(1)具有序列號1所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(2)具有序列號2所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(3)具有序列號3所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(4)具有序列號4所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸。
13.由選自下述多核苷酸中的至少2個構成的多核苷酸組(1)具有序列號1所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(2)具有序列號2所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(3)具有序列號3所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸，(4)具有序列號4所示的堿基序列或與其互補的堿基序列的多核苷酸、或具有與它們實質相同的可以識別功能性絲狀真菌短矮鬼傘的堿基序列的多核苷酸。
全文摘要
本發明提供一種功能性絲狀真菌檢測方法，其采用選自具有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的堿基序列的多核苷酸和具有與其互補的堿基序列的多核苷酸和具有與它們實質相同的堿基序列的多核苷酸中的至少1個多核苷酸，檢測試樣中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘(Coprinus curtus)，還提供了一種含有功能性絲狀真菌制品的評價方法，其評價含有功能性絲狀真菌制品中的功能性絲狀真菌短矮鬼傘的存在或濃度。
文檔編號C12Q1/68GK102203247SQ200980132700
公開日2011年9月28日 申請日期2009年8月20日 優先權日2008年8月22日
發明者中崎清彥 申請人:國立大學法人靜岡大學