專利名稱：長春花第三組晚期胚胎豐富蛋白的基因序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因領域，具體涉及長春花抗旱基因晚期胚胎豐富蛋白的基因序列。
背景技術：
晚期胚胎豐富蛋白LEA(late embryogenesis abundant Protein，LEA)廣泛存在于高等植物中，具有較強的抗旱能力。不同類型的LEA在高等植物種子胚胎發生的不同階段種胚中表達或在干旱脅迫條件下表達。它們可以被ABA(abscisic acid)誘導。同時，LEA蛋白在植物耐寒、耐鹽性方面也發揮著重要作用。
LEA蛋白共同的結構特征是偏性氨基酸組成形成高度親水性的多肽。大多數LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸殘基，但富含賴氨酸和甘氨酸。根據它們氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列，LEA蛋白可分為6組。
第3組LEA蛋白通常含有多拷貝的11個氨基酸組成的基元序列(TAQAAKEKAGE)。該組LEA蛋白大小差異很大，所含基元序列的拷貝數少的只有5個，如棉花LEA D7蛋白，多的則有幾十個，如油菜LEA 76蛋白(13個)，大豆cDNApGmPM8和pGmPM10編碼蛋白含有超過30個相連的基元序列。該組蛋白可依其基元序列的羧基端有無特定的氨基酸延伸區段可分為兩種類型，一類是11個氨基酸組成的重復基元序列被與之相似的序列所分離，稱第3組LEA蛋白(I)，如大麥的HVA1與小麥的PMA2005，胡蘿卜的DC3和棉花的D7；另一類是在羧基末端被特定氨基酸延伸區段的出現而分隔，稱第3組LEA蛋白(II)，如小麥的PMA1949，胡蘿卜DC8和大豆的pGmPM2等。
在干旱脫水過程中細胞液的離子濃度會迅速升高。高強度的離子濃度會造成細胞的不可逆傷害。第3組LEA蛋白中的11個氨基酸殘基組成的基元序列可形成兼性α2螺旋結構，提供一個具疏水條區的親水表面，螺旋的疏水面可形成同型二聚體，處在親水表面的帶電基團可螯合細胞脫水過程中濃縮的離子，如Na+和PO3-4。此外，組成該蛋白的大多數氨基酸殘基為堿性、親水性氨基酸，無半胱氨酸和色氨酸，這些高電荷的氨基酸殘基可以重新定向細胞內的水分子，束縛鹽離子，從而避免干旱脅迫時細胞內高濃度離子的累積所引起的損傷，同時也可防止組織過度脫水。
目前，在多種植物中都有關于第3組LEA蛋白或基因的研究報道。這些基因的表達或蛋白累積與植物的滲透脅迫抗性正相關。萌芽3天的大麥幼苗經011mmol/LABA或干旱處理后，幼苗的所有器官中均有高水平的HVA1 mRNA和蛋白質出現，它可被干旱等環境脅迫和ABA誘導表達。Xu等將HVA1 cDNA全序列導入水稻，獲得了抗旱、抗鹽的轉基因水稻，從而直接證實了第3組LEA基因可能具有干旱保護功能。
經檢索，未發現任何公開或報道過長春花LEA蛋白的基因序列及氨基酸序列。
發明內容
本發明的第一目的在于提供一種來自于長春花的第三組LEA蛋白的核苷酸序列，其特征在于，它包括編碼據有LEA(晚期胚胎發生豐富蛋白)第3組的LEA蛋白的功能區序列，它包含6個由11個氨基酸殘基構成的基元序列。所述的核苷酸序列與胡蘿卜LEA DC3有69％的同源性，與雞豆LEA蛋白同源性達51％。
本發明的第二目的在于提供一種快速獲得脅迫相關基因全長序列的方法。
本發明的cDNA分子是通過如下的方法獲得的首先通過測定植物葉片水勢來尋找植物中度脅迫的處理條件。使植物干旱脅迫下表達蛋白的豐度富集。
其次，采用最適處理材料進行總RNA的提取及mRNA的純化，用mRNA進行全長cDNA表達文庫的構建。構建后cDNA處于真核表達載體質粒pCMV上，可直接進行克隆cDNA的表達文庫的篩選。
最后，采用3730測序儀，對隨機挑選的克隆進行測序。EST標簽在與NCBI數據庫進行比對后，對相關克隆測通全長，得到完整的LEA基因的完全編碼序列。
本發明的重要應用價值在于該基因在抗旱過程中具有以下優點LEA蛋白作為脫水保護劑，一方面與胞內的其他蛋白發生作用，使他們的結構保持穩定，另一方面為親水的α螺旋結構，給細胞內的束縛水提供一個結合襯質，使細胞在脫水中免受迫害；并存在著周期性的荷電離子空間結合位點，在脫水時荷電離子結合于這些位點，從而緩沖了因脫水使離子強度提高造成的細胞傷害；另外，它是植物滲透調節機制的一部分是糖醇、脯氨酸、甜菜堿等滲透調節物質合成和運輸的調節蛋白，因而LEA蛋白具有較強的抗旱能力，區別與其他基因單一調節的抗旱機制。
圖1是不同植物來源LEA蛋白的同源性比對2是長春花與胡蘿卜LEA蛋白的同源性比對圖及基元序列
具體實施例方式實施例1 長春花抗旱基因晚期胚胎豐富蛋白全長基因的克隆步驟1，植物材料處理長春花幼苗播種在珍珠巖中，在光照培養箱中培養，每天澆水，取1個月苗齡的長春花植株在光培箱中自然脫水，沒隔一小時測葉片水勢及滲透勢，以達-1.0MPa為標準取材。取葉片液氮速凍，立即放入-70度的超低溫冰箱中。
步驟2，總RNA的提取及mRNA的純化1.利用Trizol(Gibco)一步法提取總RNA，根據試劑盒說明書步驟進行。對總RNA定量并進行變性電泳質量分析。
2.mRNA的純化利用Oligotex mRNA Purification Kit(Qiagen)從總RNA中純化mRNA并進行定量。
步驟3，λZAPExpresscDNA文庫的構建(Stratagene)1.cDNA第一鏈的合成(1)冰上建立如下體系5.0μL 10×buffer 3.0μLdNTP Mix，2.0μL Link-Primer 12.5μL DEPC-H2O，1.0μLRNAsin，混勻，加入mRNA 5μg，加入1.5μL反轉錄酶。
(2)輕輕混勻，42℃溫育1hr。
2.cDNA第二鏈的合成(1)在第一鏈反應體系中順序加入20μL 10×buffer，6.0μL dNTP Mix，116μLDEPC-H2O，2.0μL RNAseH(1.5U/μL)，11.0μL DNA polymerase I(9.0U/μL)(2)置16℃水浴保溫2.5hr。
3.cDNA末端補平(1)冰上加如下試劑23μL dNTP Mix，2.0μL pfu DNA pol(2.5U/μL)。
(2)72℃溫育30min。
(3)用200μL酚/氯仿抽提一次，室溫高速離心2min，轉上清于另一新管中。
(4)用等體積氯仿抽提一次，轉上清于另一新管中。
(5)加20μL 3mol/LNaAc，400μL 100％乙醇，混勻，-20℃過夜。
(6)4℃ 16000g離心60min，收集cDNA沉淀。
(7)加500μL 70％乙醇輕輕洗。
(8)全速離心2min，室溫下抽真空使沉淀干燥。
(9)沉淀重懸于9.0μL EcoR I adapters中。4℃保溫至完全溶解。
4.EcoR I銜接子的連接(1)順序加入1.0μL 10×buffer(Ligase Buffer)。
1.0μL 10mmol/L rATP1.0μL T4DNA ligase(4U/μL)4℃連接2天.
(2)70℃水浴30min，以滅活Ligase.
5.EcoR I連接子末端的磷酸化.
(1)室溫離心2s并放置5min，加入1.0μL 10×Ligase Buffer2.0μL 10mmol/L rATP5.0μL sterile H2O2.0μL T4 Kinase(5U/μL)37℃保溫30min。
(2)70℃加熱30min滅活Kinase6.Xho I消化加入下列成分28.0μL Xho I buffer3.0μL Xho I(40U/μL)37℃保溫1.5hr。
7.載體連接7.1使用Wizard SV Gel and PCR CLEAn System kit(Promega)回收cDNA片段，對回收的cDNA進行EB定量。
7.2 cDNA與ZAP Express Vector連接在1.5ml離心管中加入
2.0μL重懸cDNA0.5μL 10×ligase buffer0.5μL 10mM rATP1.0μL ZAP Express Vector0.5μL ddH2OT4 DNA ligase(4U/μL)0.5μL，4℃連接2天。
8.λ重組DNA的體外包裝(1)加入目的DNA 100ng至包裝蛋白中，混勻，離心匯于管底。
(2)22℃溫育2hr后，加入500μL SM Buffer，在加20μL氯仿，輕輕混勻。
9.λ噬菌體的轉染9.1噬菌體文庫滴度的測定(1)劃線培養XL1-blue MRF’，37℃過夜，培養基為LB(含12.5μg/ml Tet).
(2)接種至LB broth，30℃，200rpm過夜搖(OD＜1)，1000×g離心收集菌體，加10mmol/L MgSO4重懸菌體至OD600＝0.5。
(3)在上述包裝體系中各取1.0μL做一系列稀釋，即1→10-2→10-4，各取1.0μL稀釋液于宿主菌中，吸附15min后，加3mL頂層瓊脂，迅速鋪在提前育溫至37℃的底層瓊脂，待凝固后37℃過夜倒置培養.
(3)待噬菌斑長出后，計算滴度。經檢測，初級文庫的庫容達到1×106pfu/ml。
9.3噬菌體文庫的擴增(1)宿主菌制備同前。
(2)鋪好板后37℃過夜倒置培養。噬菌斑不超過1～2mm。
(3)用4mL SM Buffer涂蓋菌板，4℃貯存過夜。
(4)吸出SM Buffer于無菌管中，在加1mL SM Buffer洗菌板一次，吸到管中加氯仿至終濃度5％，混勻置室溫培養15min，500g離心10min，移走細胞碎片。
(5)轉上清于另一管中，加氯仿至終濃度0.3％，4℃存放。
(6)測滴度。經擴增，文庫的滴度達1×108pfu/ml10噬菌體文庫的體內剪切(1)劃線培養XL1-blue MRF’和XLOLR菌于LB培養基(含12.5μg/ml Tet).挑單菌落接種至50mL LB broth，30℃，200rpm過夜培養。
(2)1000×g離心收集XL1-blue MRF’和XLOLR cells，用10mM MgSO4重懸至OD600＝1。
(3)在離心管中加入100倍于初級庫的噬菌體量。按10∶1(cells-to-lambdaphage)加入宿主菌XL1-blue在按(10∶1 helper phage-to-cells ratio)加入輔助噬菌體。
(4)37℃吸附15min，加20ml NZY broth with supplements，37℃搖培3hr，65℃熱激20min，1000×g離心10min，轉上清于另一管中。
(5)測滴度取上清1.0μL分別加到200μL XLOLR菌中，37℃吸附15min，再加200μL NZY broth 37℃搖培45min。
(6)從中取出100μL鋪LB(50μg/ml，kana)37℃過夜培養，得到菌落。
11應用PCR反應體系檢測平均插入片段的長度取載體引物，挑單克隆進行PCR驗證插入片斷，PCR反應條件為95.0℃預變性5min，然后94.0℃變性30s，50.0℃模板退火30s，72.0℃延伸2min，共30個循環，最后，72.0℃最終延伸7min，反應結束后，取PCR產物在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。經檢驗，平均插入片斷長為1.2kb。
步驟4，采用3730測序儀進行測序(ABI)采用T7引物進行單向測序，每個反應可達800-1200bp。得到的EST序列進入NCBI進行比對后，對干旱脅迫相關基因質粒測通，得到全長基因序列。
實施例2 長春花LEA的序列信息與同源性分析以下部分為克隆的長春花LEA蛋白的核苷酸序列ggcacgaggc aaaatcaaag tcgaatcgat cgagtttaat attcttcagc aagtaagttt 60ggattagtta attaattact catagttaaa ttaacagtag agagagaaag taagcgcagt120gcaaaaatgg catcccacga gcagagctat aaagctggtg aagccaaggg tcaagctcag180gaaaaaactg gccaaatgat gggcgacgta aaggagaaga ctcaacaagc caaagacaag240gcttccgaaa cagcccagtc ggcacaaggc cgtgcgcagg agaagaaaga tcaaaccggc300agttacgtct cggacaaagc cggcgctgca aaggacaagc tttcagagac tactcaatct360gcaaaagaga gagcttctgg agcagctgaa gctacaaagc aaaaggcatc ggaaatggca420caatcgggca aagagacagc agaggcaggg aaagagaaga caggtgggtt tctgcagaag480acaggtgaac aagttaaagg catggctcaa ggtgctgctg atgctgtgaa acataccttt540ggtatggctg aaagtgagga aggtttcgaa aataagggcg gagcggcaga agccacgggg600aggaagcgta taacttgagt tattttgggg agaaatggtg ttcgatttcc ttggtttctt660tgttgatttc tgggttaatt tcggtatttc ttgatgttta tgcacctgaa tgatgatacc720tcatctgttt cctttgaggt attgctgtac gttgtatgaa taaatactga gttctcttgg780taataatatt gtagaatttc tattcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa829全編碼序列為從127位的atg到618位的tga。第806位具有polyA附加信號。其編碼的氨基酸序列為MASHEQSYKAGEAKGQAQEKTGQMMGDVKEKTQQAKDKASETAQSAQGRAQEKKDQTGSYVSDKAGAAKDKLSETTQSAKERASGAAEATKQKASEMAQSGKETAEAGKEKTGGFLQKTGEQVKGMAQGAADAVKHTFGMAESEEGFENKGGAAEATGRKRIT
LEA沒有假定的保守域，由11個氨基酸殘基構成的基元序列是第3組LEA蛋白的結構特征。該基元序列是親水親脂兼的，呈α-螺旋結構，是形成第3組LEA蛋白高級結構的基礎，是其具有抗旱功能的基礎。同源性比對分析結果標明，與胡蘿卜(Daucus carota)全長基因Lea Dc3同源性高達69％，與雞豆(Cicer arietinum)LEA蛋白同源性達51％。
本發明從長春花中分離該基因，即從新的物種中分離該基因，因而具有創新性；長春花屬耐干旱、耐鹽堿植物，因而預知該基因有更強的抗旱、耐鹽堿功能，有更新的實用價值。
權利要求
1.一種編碼長春花抗旱基因晚期胚胎豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein，LEA)的核苷酸序列，其特征在于它具有如下的核苷酸序列及相應的氨基酸序列ggcacgaggc aaaatcaaag tcgaatcgat cgagtttaat attcttcagc aagtaagttt60ggattagtta attaattact catagttaaa ttaacagtag agagagaaag taagcgcagt120gcaaaaatgg catcccacga gcagagctat aaagctggtg aagccaaggg tcaagctcag180gaaaaaactg gccaaatgat gggcgacgta aaggagaaga ctcaacaagc caaagacaag240gcttccgaaa cagcccagtc ggcacaaggc cgtgcgcagg agaagaaaga tcaaaccggc300agttacgtct cggacaaagc cggcgctgca aaggacaagc tttcagagac tactcaatct360gcaaaagaga gagcttctgg agcagctgaa gctacaaagc aaaaggcatc ggaaatggca420caatcgggca aagagacagc agaggcaggg aaagagaaga caggtgggtt tctgcagaag480acaggtgaac aagttaaagg catggctcaa ggtgctgctg atgctgtgaa acataccttt540ggtatggctg aaagtgagga aggtttcgaa aataagggcg gagcggcaga agccacgggg600aggaagcgta taacttgagt tattttgggg agaaatggtg ttcgatttcc ttggtttctt660tgttgatttc tgggttaatt tcggtatttc ttgatgttta tgcacctgaa tgatgatacc720tcatctgttt cctttgaggt attgctgtac gttgtatgaa taaatactga gttctcttgg780taataatatt gtagaatttc tattcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa829MASHEQSYKAGEAKGQAQEKTGQMMGDVKEKTQQAKDKASETAQSAQGRAQEKKDQTGSYVSDKAGAAKDKLSETTQSAKERASGAAEATKQKASEMAQSGKETAEAGKEKTGGFLQKTGEQVKGMAQGAADAVKHTFGMAESEEGFENKGGAAEATGRKRIT
2.一種如權利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于127bp處具有起始密碼子ATG，618bp處具有終止密碼子TGA，在806bp處具有polyA附加信號。該序列無內含子，具有492bp完整的開放讀碼框，編碼163個氨基酸。
3.一種如權利要求1所述的長春花晚期胚胎豐富蛋白的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于首先使用適度的干旱處理條件，使植物抗旱基因表達富集；然后通過構建全長的cDNA文庫，及測序，在最短的時間內得到抗旱相關的全長脅迫基因。獲得的抗旱基因直接構建在真核表達載體pCMV質粒上，可通過真核生物表達來直接進行篩選。基因可以使用t3、t7通用引物進行測序。
全文摘要
一種長春花第三組晚期胚胎豐富蛋白及其編碼產物的氨基酸序列。它涉及一種新的基因序列。其特征在于該基因全長829bp，在127bp處具有起始密碼子ATG，618bp處具有終止密碼子TGA，在806bp處具有polyA附加信號。該序列無內含子，具有492bp完整的開放讀碼框，編碼163個氨基酸。所述的核苷酸序列與胡蘿卜LEADC3的同源性達69％的，與雞豆晚期胚胎豐富蛋白同源性達51％。它包含6個由11個氨基酸殘基構成的基元序列。本發明還提供了一種快速得到全長脅迫基因的方法。首先使用適度的干旱處理條件，使植物抗旱基因表達富集；然后通過構建全長的cDNA文庫及測序，在最短的時間內得到抗干旱脅迫相關的全長基因。獲得的抗旱基因直接構建在真核表達載體pCMV質粒上，可使用t3、t7通用引物進行測序。同時，可通過真核生物表達來直接進行篩選。本發明從植物cDNA中分離出了第三組晚期胚胎豐富蛋白的全長基因，該基因具有較強的抗旱功能，同時，對植物耐寒、耐鹽性方面也起到重要的作用。該基因的克隆擴大了植物抗旱研究的基因資源，為運用基因工程技術提高植物抗干旱脅迫及品質改良提供了更加豐富的優良候選基因。
文檔編號C12N15/29GK1687417SQ200510009938
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月27日 優先權日2005年4月27日
發明者祖元剛, 聶明珠, 于景華, 唐中華, 王慧梅, 郭曉瑞, 房思梁 申請人:東北林業大學, 祖元剛