專利名稱：：與雞胚胎死亡相關的nmi基因片段克隆及作為分子標記的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬T家禽分子標記制備
技術領域：
，具體涉及一種與雞胚胎死亡性狀相關的JVAf/基因片段的克隆及其作為輔助選擇的雞分子標記的應用。
背景技術：
：我國是世界上的養雞人國，雞蛋產量連續多年居世界第一位，雞肉產量僅次于美國。種蛋孵化效果、性別比例是重要的生產性狀，直接影響養雞生產效率和經濟效益。關于種蛋孵化率的影響因素已有大量的研究。研究表明雞品種、年齡、種蛋品質、孵化條件等對孵化效果都有影響，控制這些因素可以提高孵化率。研究報道認為孵化期間胚胎死亡呈現一定規律。隨著分子生物學和生物技術的發展，人們開展了家禽的性別鑒定和調控研究，并取得了一定的進展；同時也從分子水平開展了有關胚胎發育的研究。很明顯，myc基因在細胞增殖方面發揮著重要的調節作用(IngvarssonS，Themycgenefamilyproteinsandtheirraleintransformationanddifferentiation.SeminCancerBiol,19%,1:359-69)。N-myc的功能在胚胎發生過程中是必需的，并且病例學觀察與N-myc的正常表達方式相符合。(StantonBR等，LossofN-mycfunctionresultsinembryoniclethalityandfailureoftheepithelialcomponentoftheembryotodevelop.GenesDev,1992,6:2235-47)。NMI基因是利用酵母雙雜交的方法掃描發現的一個新的基因，它結合于N-myc和C-myc基因上，NM1的羧基末端顯示與干擾素誘導的亮氨酸蛋白IFP35有同源性，其氨基末端顯示與線蟲蛋白59(CEF59)的巻曲螺旋的七個重復單位有同源性。共沉淀研究顯示，NMI與N-myc和C-myc在哺乳動物細胞中有相互作用(BaoJ等，IsolationandcharacterizationofNmi，anovelpartnerofMycproteins.Oncogene,1996,12:2171-6)。然而，在體內，較少的數量的MycN和NMI可能參與了MycN/NMI的木目互4乍用(BannaschD等，NmiproteininteractswithregionsthatdifferbetweenMycNandMycandislocalizedinthecytoplasmofneuroblastomacellsincontrasttonuclearMycN.O"cogewe,1999,18:6810-7》有研究顯示，NMI能夠促進STAT依賴的轉錄，同樣顯示能夠促進共活化蛋白的補充(ZhuM等，FunctionalassociationofNmiwithStat5andStatlinIL-2-andIFNgamma-mediatedsignaling.Ce//，1999,96(1):121-30.)。NMI是一個IFN誘導的類似于IFN誘導蛋白35(IFP35)的蛋白質，缺失分析顯示NMI必須與IFP35相互作用以阻止其降解并且NMI的氨基酸末端是必須的，該研究顯示，IFN誘導的NMI/IFP35斑點的分解是編程性細胞死亡發生過程中的一個新的已經確定了的事件(ChenJ等，Intracellularredistributionofinterferon-inducibleproteinsNmiandIFP35inapoptoticcells.JInterferonCytokineRes,2002,22:237-43)。研究結果顯示，STAT1和NMI在人乳腺癌細胞7系(MCF-7)人的乳腺癌細胞中是Ets-1的下游目才示(JungHH等，STAT1andNmiaredownstreamtargetsofEts-1transcriptionfactorinMCF-7humanbreastcancercell.FEBSLett,2005,579:3941-6)。ScMerf等的研究顯示，在不同的SoxlO目標基因中，NMI產生的效應是不一樣的，暗示著NMI基因的功能是啟動子特異性的(SchlierfB等，Thehigh-mobilitygrouptranscriptionfactorSoxlOinteractswiththeN-myc-interactingproteinNmi.JAfo/fi/o/，2005,353:1033-42)。研究基因突變位點在群體中的多態性，并進行性狀關聯分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以申請人對這個基因的部分的外顯子進行了多態研究和關聯分析，以期能夠發現它的功能。
發明內容本發明的目的在于擴增雞A^f/基因的部分DNA序列，尋找該基因突變位點多態性，篩選作為雞胚胎死亡性狀相關基因片段分子標記的應用。本發明通過以下技術方案實現-申請人克隆得到一種與雞胚胎死亡性狀相關的JVMJ基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所述。PCR擴增的iWlf/基因組序列全長為336bp，其中包含如序列表SEQIDNO:1所述外顯子序列和內含子的序列。在序列表SEQIDNO:1的第131bp處有一個A131-T131的堿基突變，導致州"http://-1^1^多態性。其中克隆iVM/基因片段所用的引物序列如SEQIDNO:l所示。一種篩選雞胚胎死亡相關基因A^W7分子標記的方法，按照以下步驟用GenBank報道的雞胚胎發育相關基因WM/(GeneID:LOC424314)的DNA序列設計引物；從雞胚組織中提取基因組DNA，PCR擴增，應用PCR-RFLP的方法檢測雞Mtf/基因如序列表SEQIDNO:l所示的A131-T131的堿基突變，導致州'"http://-111^多態性，并進行其基因型與雞胚胎相對死亡率的關聯分析。本發明為雞的分子標記輔助育種提供了一個新的遺傳標記。更詳細技術細節如《具體實施方式》所述。本發明的效果是1、雞WM/基因部分DNA序列的擴增及其多態性檢測PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均為特異的PCR產物。將PCR產物回收純化后測序，測序結果顯示PCR產物的長度為336bp。其中包括序列表SEQIDNO:l所示的外顯子和內含子。測序結果表明在該片段在序列表SEQIDNO:1的第131bp處有一個A131-T131的堿基突變，測序峰圖見圖5。2、標記性狀關聯分析在竹絲雞和矮腳黃雞中，死亡雞胚和正常發育雞胚的WM/基因exon5的基因型和等位基因頻率及其與胚胎死亡的關聯分析見表1所示。在矮腳黃雞中，TT基因型的相對死亡率是AA基因型的3.5倍，差異顯著(PO.05);在竹絲雞中，A^W基因exon5的州'"http://-1^1^多態性對雞胚胎成活沒有影響，差異不顯著。序列表SEQIDNO:1是本發明擴增出的與雞胚胎死亡性狀相關的WM/基因片段的核苷酸序列。圖l:是本發明的技術流程圖。圖2:是本發明克隆的^^//基因的部分0\八片段，即序列SEQIDNO:1(斜體字母表示外顯子、下劃線字母表示為弓I物及測序起始序列)。圖3:是用于PCR產物直接測序的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。瓊脂糖膠濃度為1.2%。1一3泳道為PCR產物，長度為336bp;M泳道DNA分子量標記(100bpDNAladder)。圖4:是雞ATAff基因序列表SEQIDNO:1的第131bp處A131-T131的堿基多態性檢測結果。圖5:PCR產物測序的彩峰圖，黑色背景處即為多態位點。具體實施例方式實施例1雞iVM/基因部分DNA序列的擴增及其多態性檢測1、雞WM/基因部分DNA序列的擴增1.1引物設計用雞^VMJ基閑GenBank的DNA序列(登錄號LOC424314)設計引物，序列信息如下正向引物5'-gcgtgg加ggttcagttt-3';反向弓l物5'-tcccaggaagagacatctgc-3'。1.2雞基因組DNA的提取與檢測(1)將胚盤和組織樣剪碎后按照常規方法用PBS磷酸緩沖液(購自上海二醫新生基因科技有限公司，PH=7.2)沖洗，在8000r/min的轉速下4。C離心IO分鐘，棄上清。(2)在離心沉淀中加入1XSET裂解液(SET裂解液配制10mL/L十二烷基硫酸鈉(SDS)，1O腿ol/LEDTA，20咖ol/LTrisHC1pH8.0)500uL混勾,裂解細胞，在8000r/min的轉速下4。C離心10min倒掉上清。(3)重復上一個步驟。(4)在沉淀中加入1XSET500uL和10%十二烷基硫酸鈉(即SDS，購自上海生工生物工程技術有限公司，使終濃度為0.5%)，再加入蛋白酶K(終濃度為50-100ug/mL)，置于55'C水浴鍋消化過夜。(5)上述消化液中加入等體積的平衡酚(pH=8.0)，緩慢顛倒離心管10min，4°C8000r/min離心10min。(6)小心吸取上層含有DNA的上清液移至另一離心管中，再次加入苯酚重復操作(5)。(7)吸取的上清液中加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1),緩慢顛倒離心管lOmin,4°C8000r/min離心10min。(8)吸取上清后加入氯仿/異戊醇(體積比為24:1)，緩慢顛倒離心管10min，與以上相同的條件離心。(9)吸取上清液，加入l/10體積的3MNaAc及2倍體積的無水乙醇，轉動離心管可見白色的絮狀物，即DNA，于-2(TC放置30min。(10)取出冷凍后的樣品，于12000r/min轉速離心5-8min，去掉上層乙醇，加入70%的乙醇lmL洗滌沉淀，同樣的速度離心5-8min。(11)棄去乙醇，在室溫下揮發殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA。(12)充分溶解后的DNA樣可在含有溴化乙錠(EB)的0.8%瓊脂糖膠上電泳檢觀U，同時在DNA濃度測定儀上測定濃度，存放于-2(TC備用。1.3PCR擴增進行PCR擴增反應體系(20nL)為10xBuffer2.0nL，25mMMg2+2.0pL，4pM正向引物、反向引物各1.0nL，lOmMdNTPO.化L,2.5U/nLTaq酶O.化L，500ng/|xLDNAl.OpL,ddH2012.2nL，離心混勻。PCR擴增程序為94'C預熱10min—(94。C變性30sec—60。C退火30sec—72'C延伸30sec)x35—72°C延伸lOmin—15'C10min。PCR反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2PCR-RFLP預檢湖!l2.1PCR產物酶切PCR產物酶切反應體積是10nL，3~5nL的PCR產物中加入2UHinfI，l()xBuffer1.0jiL，用純水補至10fiL，37'C消化4h。2.2丙烯酰胺凝膠電泳預檢測檢測(1)丙烯酰胺凝膠的配制由于本試驗擴增產物片斷較小，所以都用聚丙烯酰胺凝膠進行酶切結果檢測，所用的丙烯酰胺膠聯度為29:1濃度為8%的凝膠。每板膠35mL，配制方法30%丙烯酰胺9.3mL雙蒸水18.42mL5XTBE緩沖液(購自北京原平皓生物技術有限公司)14mL1(P/oAP反應終止液(購自GENMEDSCIENTIFICS，INC.USA大中華區上海分公司)0.23mL四甲基乙二胺(TEMED)(購自北京拜爾迪生物公nl):20uL將以上溶液于小燒杯中混合搖勻。(2)上樣、電泳凝膠聚合后拔出梳子，用注射器吸取1XTBE緩沖液沖洗梳孔，以除去未聚合的膠液，使樣品容易沉降。組裝好電泳設備，用1%的瓊脂糖膠液封閉好玻璃板與電泳槽之間的縫隙，防止電泳緩沖液滲漏。在上下緩沖槽中倒入足量1XTBE電泳緩沖液，用50pL微量進樣器將PCR變性產物緩緩注入梳孔。上樣完畢后開啟電泳儀電源，在U0V-120V恒壓下電泳6-8小時，直至二甲苯氰電泳指示條帶遷移到凝膠底部。(3)凝膠染色電泳完畢，取下玻板，小心地將凝膠從玻板上剝離下來，放入雙蒸水中漂洗一次，然后浸入10%乙醇溶液固定5-10min;用1%硝酸脫色3-8min，然后雙蒸水迅速漂洗一次，0.2%硝酸銀晃動閉光染膠15-25min;染色結束后用雙蒸水快速沖洗凝膠兩次(每次10s),洗去凝膠表面殘留的硝酸銀溶液。在染膠盒中倒入含3%Na2C03和微量甲醛的顯色液，立即快速地晃動膠盒，避免析出的黑色銀顆粒在凝膠表面沉積。顯色液顏色變暗時立即更換新鮮的顯色液。注意觀察顯色情況，目的條帶顯現清晰后立刻將凝膠轉入3%的乙酸溶液，浸泡10min停顯。(4)凝膠成像與電泳條帶分析將目標條帶清晰的凝膠在BIO-RAD凝膠成像系統中進行掃描并保存電泳圖譜。根據電泳條帶判斷基因型。3PCR產物的純化和測序在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mLEpendorff管中，然后用PCR產物純化試劑盒(購自日本TOYOBO公司)純化PCR產物。純化方法為在1.5ml離心管中加入40(HiL吸附液，在凝膠完全溶解之前將其放置在室溫中，且不時進行攪拌，如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或溶膠難以溶解時，放入55'C水浴鍋溫浴5min，加入30nL磁珠，經常用漩渦混合器攪拌，并放置2min(室溫)，然后放入離心機(6000rpm，5sec)，加入600nL洗凈液(用上述試劑盒自帶的冼凈液)，攪拌10sec，離心(6000rpm，5sec)，加入lmL75%無水乙醇，攪拌10sec，瞬時高速離心，徹底去除上清部分(打開微型試管的蓋子，55'C下放置5min,干燥)，加入25nL-100nL蒸餾水，攪拌10sec，放置2min后離心(6000rpm，5sec),回收上清液。上清液中含有回收的目的片段。從兩個品種的樣品中分別挑選幾個有差異帶型的DNA樣品送到上海生工生物工程技術有限公司進行測序。用測序獲得的基因序列進行序列同源性比較，用DNAstar5.01軟件S叫Man和MegAlign工具對測序峰圖進行分析，以鑒定和獲得該DNA序列的突變信息。4PCR-RFLP診斷方法建立PCR-RFLP診斷方法的建立同PCR-RFLP預檢測。實施例2:雞;\^//基因變異對胚胎成活產生的遺傳效應分析死亡雞胚和正常發育雞胚的^VM7基因exon5的^Ww/Z-RFLP基因型和等位基因頻率及其與胚胎死亡的關聯分析如表1所示。在矮腳黃雞中，死亡雞胚中的A和T等位基因頻率分別為0.571和0.429，正常發育雞胚中相應兩個位點的等位基因頻率分別為0.648和0.352,兩組的基因頻率無顯著差異。在竹絲雞中，死亡雞胚中的A和T等位基因頻率分別為0.750和0.250,正常發育雞胚中相應兩個位點的等位基因頻率分別為0.702和0.298，兩組的基因頻率無顯著差異。Logistic回歸分析顯示；在矮腳黃雞中，TT基因型的相對死亡率是AA基因型的3.5倍，差異顯著(P<0.05)，AT基因型相對于AA差異不顯著；在竹絲雞中，^\^//基因6)115的州力//-1^1^多態性對雞胚胎成活沒有影響，差異不顯著。在兩個品種中的試驗結果有一些差別，可能是品種的差異。表1雞NMI外顯子5突變基因型頻率和基因頻率及其與胚胎死亡關聯分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><110>華中農業大學<120>與雞胚胎死亡相關的NMI基因片段克隆及作為分子標記的應用〈130〉<141>2008-10-21〈磨1〈170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211>336<212>DNA<213>雞(Gallusgallus)<220>〈221〉gene<222>(1)..(336)〈223〉<220><221>primer—bind<222>(317)..(336)〈223><220>〈221>primer—bind<222>(1)..(20)〈223〉〈220〉<221>mutation〈222>(131)…(131)<223〉<220〉<221>exon〈222〉(21)..(137)〈223〉<400>1gcgtggttttggttcagtttgaatgggattcttgttgttacagaaaaaacgcaGluTrpAspSerCysCysTyr*ArgLysAsnAla1510gcgggtattcatatetggaaagtcaccetctgagtcttccatgttagt101AlaGlylieHislieTrpLysValThrLeuValPheHisValSer152025gaacaccactttcatttctgccaccttttttttaatctagtatttt147GluHisHisPheHisPheCysHisLeuPhePheAsn3035agaatcaagacagagaacaaacttcaggtaatttatttcataacaggaaaat犯atagta207gtcttgectagaagtgccatttgtatatatatgttta卿gtta卿gtc犯gcagattg267aagtcacagctggtagcagaggtctaactgctaactatattgacttgctgcagatgtctc327ttcctggga33權利要求1、一種與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根據權利要求1所述的基因片段，其特征在于序列表SEQIDNO:l的第131bp處有一個A131-T131的堿基突變，導致預"/Y-RFLP多態性。3、根據權利要求1所述的基因片段，其中克隆所述NMI基因片段的引物對如SEQIDNO:l所示。4、權利要求1所述的與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因片段在雞分子標記輔助選擇中的應用。5、一種篩選與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因分子標記的方法，按照以下步驟用GenBank報道的與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因的DNA序列設計引物；從雞胚胎基因組中提取DNA，PCR擴增，PCR-RFLP進行基因型檢測和分型。全文摘要本發明屬于家禽分子標記制備
技術領域：
，具體涉及一種與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因片段的克隆，以及作為雞分子標記的應用。本發明克隆得到一種與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第131bp處有一個A131-T131的堿基突變，導致HinfI-RFLP多態性。其制備方法是，用GenBank報道的與雞胚胎死亡性狀相關的NMI基因的DNA序列設計引物；從雞胚胎基因組中提取DNA，PCR擴增，PCR-RFLP，進行基因型檢測和分型。文檔編號C12N15/11GK101386850SQ20081019730公開日2009年3月18日申請日期2008年10月21日優先權日2008年10月21日發明者吳俊靜,張淑君,軍方,李文明,楊利國,武防杰,熊家軍,成王申請人:華中農業大學