專利名稱：紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物晚期胚胎富集蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
晚期胚胎發生豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein)是生物體中廣泛存在的一類與滲透調節有關的家族蛋白。研究發現在植物胚胎發育晚期，LEA蛋白表達量十分豐富，D7LEA蛋白在成熟棉花胚細胞中占非細胞器胞質蛋白質的4%，且在環境脅迫如干旱、低溫、鹽脅迫、ABA、紫外輻射和NaHCO3等條件下LEA蛋白mRNA也會大量累積，被認為是在脅迫過程中對植物起保護作用的物質之一。LEA蛋白在細胞中分布廣泛，參與蛋白穩定、分子保護、離子結合和防止氧化及參與細胞膜連接、折疊和穩定等作用。這些是通過體外實驗或軟件預測蛋白結構得到的單個LEA蛋白的功能，對多種LEA蛋白的體內實驗和蛋白之間的相互作用的研究越來越受到關注。不管在植物，動物還是微生物中，LEA蛋白并不是唯一的親水蛋白，還有很多親水糖和與脫水相關的溶質等。因此研究LEA蛋白與它們之間的相互作用也有非常重要的意義。許多研究已經報道，LEA蛋白可以在多種脅迫如干旱、 低溫、鹽脅迫、ABA、紫外輻射和NaHCO3等條件下大量積累從而提高了植物的抗性，因此對未知LEA基因的克隆和表達鑒定也是非常必要的。紫花苜蓿是一種重要的優質高產牧草，對畜牧業的發展起著重要的作用。通過 RACE方法克隆得到MsLEA3-l基因全長，對其編碼蛋白進行分析，探討該基因在提高轉基因植物抗干旱、低溫、鹽脅迫等方面提供一定的支持。MsLEA3-l基因作為一個潛在的抗逆候選基因，其全基因的克隆與功能分析以及對植物的遺傳轉化對于培育高抗逆的植物品種將具有一定的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，來源于紫花苜蓿(Medicago sativa)，是1)具有序列表中序列2所示氨基酸殘基序列的蛋白質；或2)是將序列2所示氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2所示氨基酸殘基序列相同活性的由序列2所示蛋白質衍生的蛋白質。本發明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，其中所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。本發明所提供的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因，是下列DNA分子之一1)其核苷酸序列為序列表中的序列1自5’端第157到第1465位所示；2)編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA分子；3)5’端非編碼區為序列表中序列3，從5’端第397到第805位所示；
4) 3’ RACE產物序列為序列表中序列4，從5’端第419位到第17 位所示；5) 5’ RACE產物序列為序列表中序列5，從5’端第1位到第434位所示；6)與序列表中序列1所示的DNA分子具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。本發明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因，其中所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因如序列表中的序列1所示。本發明還提供了含有所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因的表達載體。本發明還提供了含有所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因的細胞系。本發明還提供了擴增所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因中任一片段的引物。本發明的所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因可用在苜蓿耐鹽分子機制研究中。本發明的所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因可用在植物耐鹽性狀改良中。本發明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因將為苜蓿耐鹽分子機制研究，以及對植物耐鹽性狀的改良打下堅實的基礎，具有重要意義。
圖1為MsLEA3_l基因3' -RACE擴增的片斷。圖2為MsLEA3_l基因5' -RACE擴增的結果。圖3為紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白與其它植物晚期胚胎富集蛋白的同源性分析。圖4為紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白與其他植物晚期胚胎富集蛋白的氨基酸序列進化樹分析。圖5為MsLEA3_l蛋白親水性圖分析。圖6為MsLEA3_l蛋白的二級結構預測。
具體實施例方式實施例1、(一 )紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白編碼基因的獲得紫花苜蓿品種中苜一號(Medicago sativa L. v. zhongmu No. 1)種子在下催芽2d后，在光照培養，每天光照12h，至兩葉一心期開始用250mmol/L NaCl脅迫處理 Oh, 0. 5h, lh, 3h, 6h, 12h, 24h 以備提取總 RNA。RNA提取參照張勁松等人的方法進行(張勁松，等.中國科學，B輯，1995，25 (5) 659 669)，苜蓿葉片在液氮中研碎，懸于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中鈉，5g/l十二烷基肌氨酸，25mmol/L檸檬酸鈉，0. lmol/L^巰基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，再經4mol/LLiCl懸浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸鈉/乙醇沉淀總RNA，最后將RNA溶于水中，貯存于_20°C備用，用0. 8%的瓊脂糖檢測RNA的完整性。通過反向Northern斑點雜交技術，對一個紫花苜蓿鹽誘導抑制消減雜交cDNA文庫進行篩選。獲得一個在鹽誘導條件下表達量上調的克隆。通過測序獲得了 409bp的cDNA 片段。以獲得的cDNA片段序列為基礎，設計用于擴增3’端和5端’特異引物GSP 1 :5，-AAGATAAGGACACCACCACCACT-3，GSP2 :5， -TCAGTGGTGGTGGTGTCCTTATC-3，按照SMART RACE cDNAAmplif ication Kit (Clontech, Cat. no. K1811-1)的方法作 RT-PCR。3，端的擴增的循環參數為94 V變性k，68°C退火IOs，72°C延伸anin，35個循環。產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴出一 1200bp左右的DNA片斷(如圖1所示，圖1中 1:1: MSLEA3-1基因3'末端擴增片斷；M :DN2000DNA分子量標準)。5，端的擴增循環參數為94°C變性5s，72°C延伸;3min，5個循環；94°C變性k， 70°C退火10s，72°C延伸3min，5個循環；94°C變性5s，68°C退火10s，72°C延伸2min，25個循環。產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴出一 500bp左右的DNA片段(如圖2所示，圖2中5 μ 1 巢式PCR產物電泳結果；M :DN2000DNA分子量標準)。產物回收純化，連接，轉化，測序，測序結果MsLEA3-l基因3'末端擴增片斷序列為SEQID Na 4, MsLEA3-l基因5'末端擴增片斷為SEQ ID Na :5。借助DNA拼接軟件contig，獲得該基因的cDNA的完整序列，該序列全長為 1728bp，具有SEQ IDNa :1的DNA序列，157_1465bp為其完整編碼區域，編碼的蛋白含有435 個氨基酸殘基，具有SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列。( 二)紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的功能分析(1)序列比較分析運用BLAST和DNAMAN軟件對紫花苜蓿MsLEA3_l蛋白序列進行比較分析。其氨基酸序列與大豆的種子成熟蛋白的同源性E值為le-108，與已知的其他LEA蛋白也有較強的同源性，圖3顯示與MsLEA3-l蛋白比對E值在Ie-IO以上的氨基酸序列同源比對結果，涂色部分為同源序列。圖4顯示各氨基酸序列的進化樹關系。結果表明紫花苜蓿MsLEA3-l 蛋白與大豆的兩個LEA蛋白同源性最高(AAA91965，CAA80491)，親緣關系最近。從LEA蛋白和多肽的同源比對結果和進化樹分析結果顯示，登錄號為NP 001024042和CAF32327兩個多肽與其他多肽之間序列同源性很低，這主要是由于第3組LEA蛋白序列除了有11個氨基酸的重復結構之外，其序列特異性較高有關。其他7個物種之間LEA蛋白在N端有較高的同源性，而C端同源性較低，事實上這7種LEA蛋白為一類LEA蛋白，都為第3組LE蛋白。(2)表達載體的構建設計引物用于構建植物表達載體LEAl :5，-GCTCTAGAATGGTGATGGCTCCAAGATTGGTT-3‘LEA2 :5， -GCAAGCTTTTAAAGCTCAGGATCTCGGCGTTGTC-3’其中下劃線部分分別表示Hindlll，XbaI酶切位點。提取苜蓿的總RNA，用oligo (dl%8作反轉錄。反轉錄產物用引物LEA1，LEA2進行 PCR，得到含有MsLEA3-l完整開放閱讀框的DNA片段，連接到pMD_18T載體上，獲得重組克隆載體，命名為PMD-LEA。轉化大腸桿菌，并送到華大基因生物公司測序。對于含有正確序列的菌株，搖菌提取質粒，用HindIII和^CbaI分別雙酶切pMD-LEA和pKYLX7載體，回收、純化酶切產物。按照載體插入片段為1 7的比例，取適量線性化載體pKYLX7和MsLEA3-l 的純化片段混合，用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，從而獲得含有MsLEA3-l編碼序列的重組表達載體，命名為PKYLX7-LEA。挑取農桿菌LBA4404單菌落接種到^iil YEB液體培養基(含鏈霉素125ug/ml)中， 振蕩培養過夜。將過夜培養物500ul接種于50ml的YEB液體培養基中，285000g，4°C
離心5min，收集菌體200rmp振蕩培養至0D600為0. 5左右。5000g，4°C離心5min，收集菌體。于冰上加入IOml 0. 15M的Nacl溶液懸浮細胞。5000g，4°C離心5min，收集菌體。加入預冷的Iml 20mMCaCl重懸。取200ul感受態細胞，加入lug pKYLX7_LEA，冰浴30min，液氮中凍Imin0 37°C熱激。加入Iml的YEB液體培養基，28°C振蕩培養4h，IOOOOg離心30s，加入IOOul的YEB重懸細胞。菌液涂布于含有lOOug/mlkan和125ug/ml鏈霉素的YEB固體選擇培養基平板上，培養過夜得到LBA4404-LEA。(3) LBA4404-LEA葉盤法轉化煙草用5 IOmm打孔器制備葉盤外植體；獲得的外植體在LBA4404-LEA菌液中浸泡 8min ；用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉入上鋪一層濾紙的共培養培養基，28°C 暗培養；3d后，將材料轉到含有抗生素的誘導愈傷組織形成及誘芽培養基中進行培養；待抗性芽生長至2-3cm高時轉入生根培養基中誘導生根；待煙草長出根，轉移到花盤中，待種子成熟，收集種子。(4)轉基因陽性植株的篩選制備MS (0.43% MS鹽，3%蔗糖，瓊脂，用KOH調pH至5. 7)選擇培養基。T1代轉基因種子表面消毒(70%乙醇浸泡anin，0. 5%次氯酸鈉浸泡lOmin，無菌水清洗aiiinX 5 次)。平鋪于含相應抗生素(40 μ g/ml Kan和50 μ g/ml的頭孢霉素)的MS選擇培養基中， 密度為100-200粒種子/皿。4°C春化3天，移入生長箱中(22°C恒溫二4小時光照，光強為 30-40 μ mol. m_2. s-1)。7天后挑選轉化體，表現為真葉健康呈深綠色，根伸長至培養基中。將轉化體轉至正常的MS培養基中，10天后轉入土壤。收獲T2代種子，備用觀察，并做生理生化鑒定。(5)轉基因植株耐鹽性的鑒定材料處理當轉基因再生植株高8 10cm、根長4 5cm以上時，移栽到直徑為 12cm花盆內，于溫室中培養。每天每盆加50mLHOagland營養液(pH值為6. 5)，培養30d后， 分別用濃度為100mmol/L、200mmol/L、M0mmol/L和300mmol/L的NaCl溶液脅迫處理，在處理后Od和4d取樣備用。葉片相對含水量先測T2代轉基因植株葉片鮮重Wf，再將葉片浸入蒸餾水中數小時，使葉片吸水成飽和狀態。取出用吸水紙吸取表面的水分，立即放入已知重量的稱瓶中稱重，再放入蒸餾水中一段時間后取出吸干外面水分，再稱重，直至重量不再增加為止。此時即為葉片吸水飽和時的重量Wt，再將樣品烘干，求得組織干重W，從而計算葉片相對含水量(RWC)。相對含水量(RWC)= (fff-ffd)/(Wt) X 100%T2代轉基因植株L2和L8分別比非轉基因植株的相對含水量高10. 0% (P < 0. 05)和8. 5%，T2代轉基因植株L1、L5和L6分別比非轉基因植株高23. 7% (P < 0. 05) ,22. 5% 和21. 5%。實驗結果顯示，外源MsLEA3-l基因的轉入可能阻止了轉基因植株葉片水分損失，提高了植物的保水能力。夕卜滲率取不同處理植株葉片，流水沖洗后再用蒸餾水沖洗3次，吸干；剪成約Icm2的小葉片(或用直徑為Icm的打孔器鉆取小圓片)，注意除掉大葉脈。然后用電子天平稱取3份， 每份1. 0g，放入小燒杯中，準確加入20mL重蒸餾水，振蕩30s，用真空抽氣泵抽氣5次，使細胞中的空氣被抽出，使葉片全部浸入重蒸餾水中，在室溫下靜置池，然后用雷磁DDSJ2308A 型電導儀測定溶液的電導率R，再將其置于沸水浴中煮沸15min，冷卻后測定其電導率R。。外滲率(％ )=處理電導率R/煮沸電導率RtlX 100實驗結果表明，240mmol NaCl脅迫下，T2代轉基因植株和非轉基因植株的差異達到顯著水平，T2代轉基因植株的電導率明顯低于非轉基因植株。丙二醛(MDA)含量采用巴比妥酸(TBA)顯色法，剪取各不同處理的植株葉片中部0. 5g，放入研缽中， 加入5%三氯乙酸(TCA) 2. OmL，少量石英砂研磨，研磨液倒入離心管中。另取3. OmL的TCA 用來清洗研缽，清洗液也倒入離心管中，在3000r/min的離心機中離心lOmin。分別取上清液2mL各3份，各放入IOmL管中，每管中加入2mL 0. 67%硫代巴比妥酸(TBA)，混合后在 100°C水浴中煮沸30min。反應溶液冷卻后在離心機中以3000r/min離心lOmin，最后分別在450，532和600nm處測定上清液的吸光度。按公式C = 6. 45X (A532-A600) -0. 56A450， 計算MDA含量并進行換算。在鹽脅迫下，各株系的MDA含量都增加了，但是T2代轉基因植株的增加量明顯低于對照。說明，外源MsLEA3-l基因起到保護抗氧化系統的作用，提高了轉基因煙草的抗氧化能力。脯氨酸含量根據Bates等人的方法，稱取不同處理的植物葉片各0. 5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取IOmin (提取過程中要經常搖動)，冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液置于帶塞試管中，加入2ml冰醋酸及aiil 2. 5%酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入細1甲苯，搖蕩30秒鐘，靜置片刻，取上層液至IOml離心管中，在3000r/ min離心5min。用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度(A)值。在鹽脅迫下，脯氨酸在T2代轉基因植株中的積累極顯著高于對照。T2代轉基因植株L1、L2和L7中的脯氨酸含量比對照高出4倍，而T2代轉基因植株L3、L4、L5、L6和L8比對照高5倍。綜上所述，外源MsLEA3-l基因可以提高轉基因煙草的抗鹽性。以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
權利要求
1.一種紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，是1)具有序列表中序列2所示氨基酸殘基序列的蛋白質；或2)是將序列2所示氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2所示氨基酸殘基序列相同活性的由序列2所示蛋白質衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其特征在于所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
3.紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因，是下列DNA分子之一1)其核苷酸序列為序列表中的序列1自5’端第157到第1465位所示；2)編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA分子；3)5’端非編碼區為序列表中序列3，從5’端第397到第805位所示；4)3’ RACE產物序列為序列表中序列4，從5’端第419位到第17 位所示；5)5'RACE產物序列為序列表中序列5，從5’端第1位到第434位所示；6)與序列表中序列1所示的DNA分子具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的 DNA分子。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因如序列表中的序列1所示。
5.含有權利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因的表達載體。
6.含有權利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因的細胞系。
7.擴增權利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因中任一片段的引物。
8.權利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因在苜蓿耐鹽分子機制研究中的應用。
9.權利要求3或4所述紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白的編碼基因在植物耐鹽性狀改良中的應用。
全文摘要
本發明公開一種紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白，是具有序列表中序列2所示氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的所示氨基酸殘基序列相同活性的由序列2所示蛋白質衍生的蛋白質。本發明的紫花苜蓿晚期胚胎富集蛋白及其編碼基因將在苜蓿耐鹽分子機制研究、豆科植物耐鹽性狀改良中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/29GK102477087SQ20101055756
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優先權日2010年11月24日
發明者孫彥, 康俊梅, 張鐵軍, 楊青川, 白永琴 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所