專利名稱：：二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制備方法
技術領域：
：本發明涉及二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的高效率的制備方法。
背景技術：
：下述式(I)表示的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸中，例如由于P、P、二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)或其鹽具有促進排痰的作用，因此是作為祛痰藥或肺炎治療藥有待于開發的化合物，P、2，-脫氧胞苷5，-)P、尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)或其鹽是P2Y2和/或P2Y4。票呤受體的選擇性激動劑，因此是作為慢性支氣管炎、副鼻腔炎等的治療藥有待于開發的化合物。e2『6hh匕$式中，W和W表示氫原子或羥基，B'和BZ表示嘧咬石威基，W和R2以及Bi和BZ各自可以相同也可以不同，n表示1~4的整數。作為上述二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成方法，例如當為Up4U時，以尿苷5，-單磷酸(UMP)作為起始原料，使用氯磷酸二苯酯(DPC)等活化劑和焦磷酸(PPi)等磷酸化劑來合成，但目標化合物的合成收率極低、為約10°/。，根本無法成為實際應用的方法(專利文獻l)。因此，作為改善這些方法的嘗試，正在研究經由核苷5，-環狀三磷酸的方法。具體而言，有人報道了使尿苷5，-環狀三磷酸與UMP反應制備Up4U的方法(非專利文獻l)、使腺苷5，-環狀三磷酸與腺苷5，-單磷酸G=to6士6反應制備P、P氣二(腺苷5，-)四磷酸的方法(非專利文獻2)。專利文獻l:W099/5155非專利文獻l:Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,11(2001)，157-160非專利文獻2:OrganicLetters,第8巻，No.lO，2075-2077(2006)
發明內容發明所要解決的課題有報道稱，使尿苷5，-環狀三磷酸與UMP反應制備Up4U的方法可以以32。/。的收率合成Up4U(非專利文獻l)。但是，在該反應條件下要求高達40。C的反應溫度，在該加熱條件下生成大量的除目標物以外的副產物，因此存在著非常難以純化的問題。特別是在加熱下進行如dCp4U等非對稱型的二(嘧。定核苷5，-)多磷酸的合成時，同時還副生結構與目標物酷似的對照型Up4U，在各種純化條件下幾乎都不能分離。由此可知在核苦5，-環狀三磷酸與核苷5，-單磷酸的反應中，在不會使副產物增加的室溫左右的溫度下實施反應至關重要。但是，在室溫左右實施該反應時，如后述實施例中詳述的那樣，無法重現該收率，所得Up4U的合成收率極低，為10°/。以下。另一方面，在報道了使腺苷5，-環狀三磷酸與腺苷5，-單磷獲應得到P、P氣二(腺香5，-)四磷酸的方法的文獻中，暗示了該方法可適用于各種二(核香5，-)多磷酸的主旨，但是用于合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸時的具體數據則完全沒有顯示。另外，該方法使用保護了羥基和氨基的核苷酸作為原料化合物，因此在合成目標化合物之后必需將該保護基進行脫保護，結果，使操作變得復雜，同時也成為收率下降的原因之一。另外，反應中使用的試劑類必須大大過剩地使用，在成本上也不利。更重要的是，在我們進行的將該方法應用于合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的追加試驗中，如后述所示，存在著目標化合物的合成收率低、絕對不能滿足要求的問題。4解決課題的方法
技術領域：
：本發明人等為了解決上述問題反復進行了深入研究，結果發現通過使嘧啶核苷5，-環狀三磷酸和嘧啶核苷酸在特定的金屬鹽、特別是4美鹽的存在下反應，即使在室溫下，與公知的方法相比也可以顯著提高目標物二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成收率，從而完成了本發明。因此本
發明內容如下。〔1〕二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的制備方法，其特征在于使用縮合劑將嘧咬核苷5，-三磷酸轉化成嘧咬核苷5，-環狀三磷酸，接著在選自鎂、錳和鐵的金屬鹽的存在下，使得到的嘧咬核苦5，-環狀三磷酸與嘧啶核苷酸反應。〔2〕上述〔1〕所述的制備方法，其中二(嗜啶核苷5，-)多磷酸為下述式(I)表示的化合物(I)式中，W和I^表示氫原子或羥基，Bt和B"表示嘧啶堿基，1^和112以及B^口bZ各自可以相同也可以不同，n表示l4的整數。〔3〕上述〔1〕所述的制備方法，其中縮合劑為碳化二亞胺類。〔4〕上述〔1〕所述的制備方法，其中金屬鹽為鎂鹽。〔5〕上述〔1〕所述的制備方法，該方法在1530。C的溫度條件下反應。〔6〕上述〔1〕所述的制備方法，該方法是使用尿普5，-三磷酸(UTP)和尿苷5，-單磷酸(UMP)來制備P',pt二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)。〔7〕上述〔1〕所述的制備方法，該方法是使用尿苦5，-三磷酸(UTP)和尿苷5，-二磷酸(UDP)來制備P',pS-二(尿苷5，-)五磷酸(Up5U)。〔8〕上述〔1〕所述的制備方法，該方法是使用尿苷5，-三磷酸(UTP)和2，-脫氧胞苷5，-單磷酸(dCMP)來制備P、2，-脫氧胞苦5，-)P、尿普5，-)四磷酸(dCp4U)。〔9〕上述〔1〕所述的制備方法，該方法是使用2，-脫氧胞苷5，-三磷酸(dCTP)和尿苷5，-單磷酸(UMP)來制備P、2，-脫氧胞苷5，-)P、尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)。發明效果本發明的合成方法，其最大優點在于將嘧啶核苷5，-三磷酸轉化成嘧啶核苷5，-環狀三磷酸之后，使得到的嘧啶核苷5，-環狀三磷酸與嗜啶核苷酸反應時，在選自鎂、錳和鐵的金屬鹽、特別是鎂鹽的存在下進行反應。即，根據以往的方法，在嘧咬核苦5，-環狀三磷酸與嘧啶核苷酸的反應中，釆用完全不存在金屬鹽(非專利文獻l)或在鋅鹽的存在下進行反應的方法(非專利文獻2)。但是，在本發明人等的研究中明確在經由核苷5，-環狀三磷酸的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成中，在不存在金屬鹽的非專利文獻l的方法中，二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成收率極低，且反應溫度還較高、達到40。C，生成大量的目標物以外的副產物，因此還存在純化極其困難的問題。另外，在鋅鹽的存在下反應的非專利文獻2的方法雖然是適于合成P、P氣二(腺苷5，-)四磷酸的方法，但在本發明人等的研究中可知該方法不適于合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸，其合成收率未必高。在這樣的狀況下，在非專利文獻2中，本發明人等首次發現被指出不比鋅鹽有效的鎂鹽，完全意外地在二(嗜啶核苦5，-)多磷酸的合成中極其有效。即，根據本發明的方法，以非保護的核苷酸類作為起始原料，利用不需進行保護、脫保護步驟的簡便操作方法，可以以遠遠高于現有方法的合成收率(50.5~94.3%)合成目標化合物，并且由于6反應溫度為室溫左右和溫和的反應條件，因此具有副產物也少、純化容易的優點，是適合于工業上大量合成二(嘧啶核香5，-)多磷酸的方法。實施發明的最佳方式如上所述，本發明方法如下使用縮合劑將嘧啶核苷5，-三磷酸轉化成嘧啶核苷5，-環狀三磷酸，接著在選自鎂、錳及鐵的金屬鹽的存在下，使得到的嘧啶核苷5，-環狀三磷酸與嘧"定核苦酸反應，合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸。作為用于將嘧啶核苷5，-三磷酸轉化成嘧啶核苷5，-環狀三磷酸的縮合劑，可以使用二環己基碳化二亞胺(DCQ、水溶性碳化二亞胺(WSC)、二異丙基碳化二亞胺(DIPC)等碳化二亞胺類；羰基二咪唑(CDI)、氯磷酸二苯酯(DPC)等磷酰卣化物；曱苯磺酰氯等磺酰卣化物等公知的縮合劑，特別優選碳化二亞胺類。反應根據所使用的縮合劑而不同，例如可以通過在二曱基曱酰胺(DMF)、二曱基乙酰胺(DMA)、曱酰胺(FA)、吡啶、二嚼烷、二曱基亞石風等的單獨或混合溶劑中，相對于1摩爾的嘧啶核苷5，-三磷酸(NTP)使用15摩爾的縮合劑，在0。C50。C、優選1530。C下反應110小時左右來實施。更具體而言，使用DIPC作為縮合劑時，可以通過在DMF中，相對于1摩爾的NTP使用15摩爾、優選1.21.4摩爾的DIPC,在0。C50。C、優選2030。C下反應35小時左右來實施。如此操作而得到的嘧啶核苷5，-環狀三磷酸，不用分離、接著在選自鎂、錳和鐵的金屬鹽的存在下與嘧啶核苷酸反應，合成二(嘧啶核苷5'-)多磷酸。作為反應中共存的金屬鹽，只要是選自鎂、錳和鐵的金屬鹽即可，沒有特別限定。具體可以例示氟化鎂、氯化鎂、溴化鎂、碘化鎂、氯化錳、氯化鐵等金屬卣化物；鎂、錳、鐵的硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸、四氟硼酸鹽等金屬無機酸鹽；鎂、錳、鐵的三氟曱磺酸、曱磺酸、曱苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、硬脂酸、枸櫞酸鹽等金屬有機酸鹽等。上述金屬鹽中，從合成收率及容易操作的角度考慮，優選鎂鹽，特別優選氯化鎂。需要說明的是，所使用的金屬鹽可以是無水物也可以是水合物。反應可以如下實施相對于l摩爾的嗜啶核苷5，-環狀三磷酸，添加15摩爾、優選1.01.3摩爾的嘧啶核香酸和15摩爾、優選1.01.3摩爾的金屬鹽，在010(TC、優選153(TC下反應124小時左右。反應后，對于合成目標物的二(嘧吱核苷5，-)多磷酸，可以適當組合通常的核苷酸的分離純化中所使用的方法(例如，重結晶法、離子交換柱層析法、吸附柱層析法、活性炭柱層析法等)進行分離純化，根據需要還可以制成鹽的形式。例如，作為離子交換柱層析法中使用的離子交換樹脂，可以使用堿性陰離子交換樹脂(例如7》六一，4卜IRA402〔口一厶&/、一^社制〕、夕、74才歹PA-312、夕？7*4才^SA-11A〔三菱化學社制〕)、弱堿性陰離子交換樹脂(例如，7乂A—，吖卜IRA67〔口一厶&"一7社制〕、夕？7M才》WA-30〔三菱化學社制〕)、強酸性離子交換樹脂(例如，夕'M7行才》PK-216〔三菱化學社制〕)或弱堿性陰離子交換樹脂(例如，夕'47*4才》WK-30〔三菱化學社制〕)等。作為活性炭，可以使用成形為破碎狀或粒狀的色譜用活性炭，例如可以使用和光純藥工業社、二村化學工業社制等的市售品。另外，重結晶法可如下進行向得到的已純化的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸或其鹽中加入親水性有機溶劑，使晶體析出。使用的親水性有機溶劑可以例示曱醇、乙醇等碳原子數為6以下的醇類；丙酮等酮類；二嗯烷等醚類；乙腈等腈類；二曱基曱酰胺等酰胺類等，特別是可以列舉醇類、優選乙醇。上述本發明方法可適用于二(嘧咬核苷5，-)多磷酸、具體例如有上述式(I)表示的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的制備，并不限于特定化合物的制備。例如可適用于(1)使用尿苦5，-三磷酸(UTP)和尿苦5，-單磷酸(UMP)的P^P氣二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)的合成；(2)使用尿普5，-三磷酸(UTP)和尿苷5，-二磷酸(UDP)的P^p5-二(尿苷5，-)五磷酸(Up5U)的合成；P)使用尿苷S，-三磷酸(UTP)和2，-脫氧胞苷S，-單磷酸(dCMP)的P'-(2，-脫氧胞苷5，-)p4-(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成；(4)使用2，-脫氧胞苷5，-三磷酸(dCTP)和尿苦5，-單磷酸(UMP)的pLp，-脫氧胞苦5'-)p4-(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成等。實施例以下，給出實施例來具體說明本發明，-f旦本發明并不受這些實施例的任何限定。實施例l:金屬鹽對P、P乞二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)的合成收率的效果(1)尿普5，-環狀三磷酸(cUTP)二曱基曱酰胺溶液的制備將5.00g(9.10mmol)尿苷5，-三磷酸(UTP)三鈉溶解于去離子水中，制成50mL溶液，使之通過強陽離子交換柱(pK216-質子型、27cc),與洗滌液合并，用8.7mL(37mmol)三丁胺進行中和。減壓下濃縮該溶液，之后將殘余物用20mL二嗯烷共沸4次。將殘余物溶解于50mL二曱基甲酰胺中，制成0.15M的UTP三丁胺鹽二甲基曱酰胺溶液。向該溶液中加入1535(10.0mmol)二異丙基碳化二亞胺，在室溫下攪拌3小時，制成0.15M的cUTP三丁胺鹽二曱基甲酰胺溶液。(2)尿苷5，-單磷酸(UMP)三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液的制備向4.4mL(9.0mmol)2.05M的UMP水溶液中加入4.4mL(19mmol)三丁胺進行濃縮。殘余物用20mL二噁烷共沸6次，之后溶解于50mL二曱基曱酰胺中，制成0.18M的UMP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液。(3)研究金屬鹽在cUTP與UMP的反應中的效果向上述(1)的500(75.0^mo1)0.15M的cUTP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液中加入上述(2)的500〃L(90.0〃mo1)0.18M的UMP三丁胺鹽二曱基甲酰胺溶液和表1所示的各種金屬鹽的200//L(90.0Amol)0.45M的二曱基甲酰胺溶液，在室溫(25。C)下反應1小時。用HPLC(262nm)分析反應液，求出目標物Up4U的合成收率。其結果見表l。項目號金屬鹽(1.2當量)cUTP(當量)UMP(當量)Up4U合成收率(％)1無水MgCb80.2%2MgCl2-6H2084.0%3Mg(OTf)267.9%4MnCl2-4H2011.272.2%FeCl364.9%6Zn(OTf)224.7%7ZnCl219.1%8一3.8%OTf:三氟甲磺酸由表l的結果可知在由cUTP和UMP合成Up4U的反應中，在金屬鹽未共存的情況下合成收率為3.8°/。(非專利文獻l的方法項目號8);在鋅鹽共存的情況下合成收率為19.1~24.7%(非專利文獻2的方法項目號6~7),相對于此，在選自鐵、錳和鎂的金屬鹽共存的情況下，合成收率顯著提高，達到60%以上；特別是在鎂鹽共存的情況下，可以達到80%以上的合成收率(項目號1~5)。實施例2:Up4U-鈉鹽的合成(1)UTP三丁胺鹽二曱基甲酰胺溶液將l.OOg(1.82mmol)UTP三鈉鹽溶解于13mL去離子水中，使之通過強陽離子交換柱(pK216-質子型、10cc),與洗滌液合并，用1.75mL(7.35mmol)三丁胺進行中和。減壓下濃縮該溶液，之后將殘余物用10mL二噁烷共沸4次。將殘余物溶解于10mL二曱基曱酰胺中，制成0.13310M的UTP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液。(2)UMP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液向1.06mL(2.18mmol)2.05M的UMP水溶液中加入1.06mL(4.46mmol)三丁胺進行濃縮。殘余物用IOmL二嗨烷共沸4次，之后溶解于10mL二甲基曱酰胺中，制成0.184M的UMP三丁胺鹽二曱基甲酰胺溶液。(3)Up4U的合成向上述(1)的UTP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液中加入364〃L(2.37mmol)二異丙基碳化二亞胺，在室溫下攪拌3小時。向其中加入上述(2)的0.18M的UMP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液和將207.5mg(2.179mmol)無水氯化鎂溶解于4.9mL二曱基曱酰胺中的溶液，在室溫下攪拌255分鐘。所得溶液用HPLC(262nm)進行分析，結果可知由UTP以84.2。/。的合成收率生成了目標物Up4U。(4)Up4U的純化、分離向上述(3)的反應溶液中加入6.5mL去離子水，減壓下濃縮。向殘余物中加入25mL去離子水，濾去生成的沉淀，之后合并濾液、洗液，使之通過強陽離子交換柱(pK216-質子型、20cc)。合并通過液、洗液，用三乙胺調節至pH7.5。使該溶液吸附在陰離子交換柱(IRA67-氯化物離子型、40cc)上，用0.15N的鹽酸、去離子水依次清洗，之后將目標物用0.3-0.4M的碳酸氫銨水溶液進行洗脫。減壓下濃縮含有目標物的餾分，之后將殘余物用去離子水進行共沸，冷凍干燥。將所得殘余物溶解于去離子水中，之后使之通過強陽離子交換柱(pK216-鈉型、40cc)，合并洗脫液、洗滌液，減壓下濃縮。將殘余物溶解于去離子水中，之后加入乙醇進行冷卻。過濾收集析出的晶體，得到1.08g(1.23mmol、67.7%)Up4U-鈉鹽。實施例3:P^P、二(尿苷5，-)五磷酸(Up5U)的合成加入500〃L(75.0pmol)0.15M的cUTP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液、584〃L(90.0,mo1)0.154M的尿苦5，-二磷酸(UDP)三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液、200//L(卯.0〃mo1)0.45M的無水氯化鎂二曱基甲酰胺溶液，在室溫下攪拌72小時。所得溶液用HPLC(262nm)進行分析，結果可知由UTP以50.5Q/。的合成收率生成目標物Up5U。實施例4:以2，-脫氧胞苷5，-三磷酸(dCTP)作為起始原料的P、2，-脫氧胞苷5，-)P、(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成向166(16.7/miol)0.144M的dCTP三丁胺鹽二甲基曱酰胺溶液中加入3.4^L(^mol)二異丙基碳化二亞胺，在室溫下攪拌3小時。加入0.18M的UMP三丁胺鹽二曱基曱酰胺溶液、0.45M的無水氯化鎂或氯化鋅二曱基曱酰胺溶液，使達到表2所示的當量數，在室溫下攪拌l小時。所得反應液用HPLC(272nm)進行分析，求出目標物dCp4U的合成收率。其結果見表2。項目號dCTP(當量數)UMP(當量數)金屬鹽(當量數)dCp4U合成收率(％)11.2無水MgCb1.266.0%22.4無水MgCl22.477.2%13.4無水MgCl29.3681.0%41.2ZnCl21.29.580/053.4ZnCl29.3635.0%由表2可知通過在1.22.4當量的氯化鎂存在下，使1.22.4當量的UMP與1當量的dCTP反應l小時，由dCTP以66.077.2Q/o的高合成收率生成dCp4U。另一方面，在氯化鋅的存在下，僅以10°/。以下的低收率合成了目標化合物，即使增加氯化鋅的當量數，收率提高也不明顯。12實施例5:以尿苦5，-三磷酸(UTP)作為起始原料的P-(2，-脫氧胞苷5'-)p4-(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成將0.15M的cUTP三丁胺鹽二甲基曱酰胺溶液、0.15M的2，-脫氧胞苷5，-單磷酸(dCMP)三丁胺鹽曱酰胺溶液、0.45M的氯化鎂六水合物二曱基甲酰胺溶液按照表3所示的量比進行混合，用二曱基曱酰胺進行調整，使總量達到lmL。在室溫下攪拌l小時，之后將所得溶液用HPLC(272nm)進行分析，求出目標物dCp4U的合成收率。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*:根據dCMP計算的dCp4U的合成收率由表3可知通過使dCMP和cUTP在氯化鎂存在下反應l小時，由dCMP定量地生成dCp4U。另外，還確認到在氯化4美未共存時，收率顯著下降。權利要求1.二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制備方法，其特征在于使用縮合劑將嘧啶核苷5’-三磷酸轉化成嘧啶核苷5’-環狀三磷酸，接著在選自鎂、錳和鐵的金屬鹽的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-環狀三磷酸與嘧啶核苷酸反應。2.權利要求l所述的制備方法，其中二(嘧啶核苷5，-)多磷酸為下述式(I)表示的化合物式中，1^和112表示氫原子或羥基；81和82表示嘧。定堿基，1^和112以及B1和82各自可以相同也可以不同；n表示1~4的整數。3.權利要求l所述的制備方法，其中縮合劑為碳化二亞胺類。4.權利要求l所述的制備方法，其中金屬鹽為鎂鹽。5.權利要求l所述的制備方法，該方法是在1530。C的溫度條件下反應。6.權利要求l所述的制備方法，該方法是使用尿苷5，-三磷酸和尿苦5，-單磷酸來制備P)氣二(尿苷5，-)四磷酸。7.權利要求l所述的制備方法，該方法是使用尿苷5，-三磷酸和尿苷5，-二磷酸來制備pi,pS-二(尿苷5，-)五磷酸。8.權利要求l所述的制備方法，該方法是使用尿苷5，-三磷酸和2，-脫氧胞苷5，-單磷酸來制備P、2，-脫氧胞苷5，-)P氣(尿苷5，-)四磷酸。9.權利要求l所述的制備方法，該方法是使用2，-脫氧胞苷5，-三磷酸和尿苷5，-單磷酸來制備P、2，-脫氧胞苷5，-)P、尿苷5，-)四磷酸。全文摘要使用縮合劑將嘧啶核苷5’-三磷酸轉化成嘧啶核苷5’-環狀三磷酸，接著在選自鎂、錳和鐵的金屬鹽的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-環狀三磷酸與嘧啶核苷酸反應，合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸。根據該方法，可以使用非保護的嘧啶核苷5’-磷酸類作為原料，可以以50％以上的合成收率獲得目標物二(嘧啶核苷5’-)多磷酸，因此作為二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的大量合成方法是適合的方法。文檔編號C07H19/10GK101495497SQ20078002864公開日2009年7月29日申請日期2007年7月25日優先權日2006年7月26日發明者向后悟,大澤和臣,山田浩平,巖井優子,早川弘之申請人:Yamasa醬油株式會社