專利名稱：一種重組人內皮抑素表達菌株及可溶性表達方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組人內皮抑素表達菌株及其可溶性表達的方法。
背景技術：
內皮抑素(Endostatin)是1997年O′Reilly等在體外培養的鼠血管內皮細胞瘤(EOMA)的細胞培養液中發現的(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，and Folkman，J.1997.EndostatinAn endogenous inhibitor of angiogenesisand tumor growth.Cell 88，277-285)。它能夠抑制體外牛毛細血管內皮細胞增殖，分子量為20kDa，序列分析顯示其為膠原蛋白18(collagenXVIII)C末端片段。人的內皮抑素分子量為18kDa。由于內皮抑素能抑制血管內皮細胞生長，進而抑制新生血管生長，阻止腫瘤生長和轉移，而且反復使用無耐藥性產生(Boehm，T.，Folkman，J.，Browder，T.，andO’Reilly，M.S.1997.Antiangiogenic therapy of experimental cancer doesnot induce acquired drug resistance.Nature 390，404-407)，因此，引起人們的廣泛關注。國內外的眾多科研人員都在進行基于內皮抑素的基礎和應用研究，希望盡快將其開發成為治療腫瘤的臨床藥物。1999年美國FDA批準了內皮抑素治療腫瘤的I期臨床試驗，2001年此項研究進入II期臨床試驗。目前，國內也已進入II期臨床試驗階段。內皮抑素的適應癥主要有肺癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、纖維瘤和黑色素瘤等，臨床試驗表明，內皮抑素的治療效果具有劑量效應。除了單獨注射內皮抑素進行治療外，內皮抑素與其它藥物(血管抑素)結合使用顯示出更好的療效(王朱逸，王瑤，李永渝，同濟大學學報(醫學版)，24(3)260-262，2003)。
目前，重組人內皮抑素的表達系統主要有畢赤酵母和大腸桿菌。其中，畢赤酵母中主要為分泌表達(Dhanabal，M.，Volk，R.，Ramchandran，R.，Simons，M.，and Sukhatme，V.P.1999.Cloning，expression，and in vitroactivity of human endostatin.Biochem.Biophy Res.Comm.258，345-352)，容易得到具有生物學活性的重組人內皮抑素，但其生產周期較長，工藝復雜，成本較高，產量也不高，而且所表達的外源蛋白容易發生部分降解，如Boehm等在酵母表達系統中成功表達可溶性小鼠內皮抑素，但所獲產物的N端不均一，分析原因可能是酵母中蛋白酶降解所致(Boehm，T.，Pirle-Shephere，S.，Trinh，L.，Shiloach，J.，and Folkman，J.1999.Disruption of the KEX1 gene in Pichia pastoris allows expression offull-length murine and human endostatin.Yeast 15，563-572)。大腸桿菌則具有生長速度快、發酵條件容易控制、外源蛋白表達量較高等優點，但在大腸桿菌中所表達的外源蛋白容易形成包涵體，純化過程中需要進行復性，而復性率往往較低。為了克服上述技術問題，人們試圖從以下兩方面對用大腸桿菌表達系統制備重組人內皮抑素的方法進行改進一是開發和改進重組內皮抑素的純化和復性方法，以便從包涵體中獲得更多的活性蛋白(You，W.K.，So，S.H.，Lee，H.，Park，S.Y.，Yoon，M.R.，Chang，S.I.，Kim，H.K.，Joe，Y.A.，Hong，Y.K.，and Chung，S.I.1999.Purificationand characterization of recombinant murine endostatin in E.coli.Exp.Mol.Med.31，197-202；Violand，B.N.，and Harding，E.I.2003.Method ofproducing mouse and human endostatin.United States Patent 6,653,098)，但是由于包涵體復性的復雜性，內皮抑素的活性回收率往往很低；二是通過改變克隆策略和對表達菌株培養條件的優化，從而增加重組人內皮抑素在大腸桿菌中的可溶性表達量(Xu，R.，Du，P.，Fan，J.J.，Zhang，Q.，Li，T.P.，and Gan R.B.2002.High-level expression and secretion ofrecombinant mouse endostatin by Escherichia coli.Protein Expression Purif24，453-459；朱敏生，智剛，朱年春，智強，陳曉明，重組人內抑素的高效表達方法，CN03155724.4，
公開日2004年4月21日)。中國專利申請CN03155724公開了一種使人內皮抑素基因在大腸桿菌中高效表達的方法，該方法在不改變內皮抑素氨基酸序列的前提下，突變了N端4個氨基酸殘基的編碼序列，選用大腸桿菌喜用密碼子，將該突變后的重組人內皮抑素基因克隆入表達載體，并采用乳糖誘導重組人內皮抑素的表達，表達量可達菌體總蛋白的40％，但是表達產物以包涵體形式存在，仍然要經過復雜的變復性過程才能獲得有活性的人內皮抑素。外源蛋白不能在工程菌中可溶性高效表達與其本身結構特征、表達載體及宿主菌有關，同時與誘導表達的工藝條件也有關系。
因此，本領域迫切需要提供一種能夠可溶性高效表達重組人內皮抑素的表達菌株和培養該菌株以使重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法。
發明內容
基于上述本領域技術上的需要，本發明人對多個表達載體和宿主菌進行了廣泛的研究。作為結果，本發明人最終提供了一種可溶性高效表達重組人內皮抑素的表達菌株。另一方面，本發明人對該表達菌株的培養及表達條件也進行了廣泛的研究，提供了培養該菌株使重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法。
因此，本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種重組人內皮抑素的表達菌株，它高效表達可溶性重組人內皮抑素，以克服現有技術中存在的重組人內皮抑素以包涵體形式表達的缺陷。
本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種可溶性高效表達重組人內皮抑素的方法，以克服現有技術中存在的重組人內皮抑素以包涵體形式表達、純化須經變復性的缺陷。
為此，本發明的構思如下對表達載體和宿主菌進行選擇，構建一種重組人內皮抑素的大腸桿菌表達菌株，繼而對誘導表達方法進行選擇，使重組人內皮抑素在大腸桿菌中可溶性表達量和總表達量同時增加。
本發明提供了一種重組人內皮抑素的表達載體pET-Endo，該載體含有人內皮抑素基因(Endo)，它插入載體pET43.1a。
所述的表達載體pET-Endo的構建根據人內皮抑素基因序列(SEQ ID NO1)合成兩段引物(引物一5′-GCATAGCCATCGTGATTTC-3′(SEQ ID NO2)，引物二5′-CGGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCAT-3′(SEQ ID NO3))，以質粒pMD-Endo為模板，通過PCR方法擴增人內皮抑素基因。將PCR產物和載體pET43.1a(購自Novagen公司)分別用PshAI和BamHI酶切后，使用TaKaRa DNA連接試劑盒(TaKaRa DNA Ligation Kit)(TaKaRa公司，cat.NoD6022)進行連接，將Endo基因插入載體pET43.1a的PshAI和BamHI之間。
利用本領域公知的技術，例如可以通過人工合成人內皮抑素的基因序列或者用RT-PCR方法克隆人內皮抑素基因，如用中國專利申請CN03155724公開的方法克隆人內皮抑素基因，將其插入質粒載體pMD(pMD18-T載體。TaKaRa公司，cat.NoD504A)，即可得到載體pMD-Endo，人內皮抑素基因插入質粒載體pMD的步驟按照廠家提供的說明書進行。
上述PCR和酶切的方法在本領域是已知的，連接反應按照廠家說明書進行。
另一方面，本發明提供了一種重組人內皮抑素的表達菌株，它含有表達載體pET-Endo。優選地，該表達菌株的宿主菌為大腸桿菌。更優選地，為大腸桿菌Origami(DE3)(Novagen公司，cat.No70617-3)。
該表達菌株的制備方法，包括將上述表達載體pET-Endo轉化宿主菌的步驟。
將表達載體轉化宿主菌的方法在本領域是已知的，例如高壓電穿孔轉化法或者熱激轉化感受態細胞法。宿主菌感受態細胞的制備按照《分子克隆試驗指南》(第二版)的方法制備。
由于培養和誘導表達條件對重組人內皮抑素的表達有顯著影響，因此本發明還提供了重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法，該方法通過培養上述表達菌株實現。
在本發明的中，提供了一種重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法，該方法包括培養上述表達菌株的步驟，誘導溫度為25-30℃。優選地，誘導溫度為25℃。
本發明提供了一種重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法，該方法通過培養上述表達菌株實現，誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的終濃度為0.1-1.0mmol/L。優選地，IPTG的終濃度為0.1-0.5mmol/L。
在本發明的另一實施例中，提供了一種重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法，該方法通過培養上述表達菌株，用IPTG誘導人內皮抑素表達，誘導時間為6-19hr。優選地，誘導時間為6-10hr。
優選地，本發明重組人內皮抑素可溶性高效表達的方法為培養上述表達菌株，誘導溫度25-30℃、IPTG的終濃度為0.1-0.5mmol/L，誘導時間6-10hr。
在本發明中“可溶性表達”的意思是人內皮抑素或融合人內皮抑素以溶解的形式存在于細胞質中或者分泌于細胞周質。上述人內皮抑素的表達方法中，人內皮抑素以融合蛋白的形式存在于細胞質中。
檢測表達蛋白的方法在本領域是公知的，例如用SDS-PAGE檢測目標蛋白的表達收獲菌體，破碎菌體，然后全菌破碎液、離心后上清(可溶性表達)和沉淀(即包涵體)分別進行SDS-PAGE，用凝膠自動掃描密度定量分析表達量和可溶性表達產物的比例。也可以用免疫印跡法(Western Blotting)檢測人內皮抑素的表達。
利用本發明的表達菌株，人內皮抑素融合蛋白占菌體總蛋白的50％左右(圖2)，可溶性表達量占總表達量的40％左右(圖3)，而現有技術中人內皮抑素是以包涵體形式表達的，沒有可溶性表達或者可溶性表達非常低。在發明人一個實施例中，將人內皮抑素基因(Endo)克隆到大腸桿菌表達載體pGEX-4T-1上，構建了表達質粒pGEX-Endo，然后將其轉入大腸桿菌表達宿主Origami(DE3)中，得到重組菌株Origami(pGEX-Endo)。與本發明的表達菌株平行試驗顯示，人內皮抑素在大腸桿菌中Origami(pGEX-Endo)以包涵體形式表達(附圖4)。顯而易見，本發明提供的表達菌株有顯著技術效果。這是因為本發明采用的表達載體pET43.1a的多克隆位點上游存在一個可溶性很強的Nus蛋白，將人內皮抑素基因插入到多克隆位點，構建的表達載體pET-Endo表達Nus-人內皮抑素融合蛋白，有效地增加人內皮抑素在細胞質中的可溶性。另外，載體pET-Endo中還含有一個His-Tag，這有利于人內皮抑素的純化。
優選地，本發明選擇了大腸桿菌Origami(DE3)作為表達載體pET-Endo的宿主菌，該菌株帶有谷胱甘肽還原酶(gor)和硫氧還蛋白還原酶(trxB)雙突變，有利于外源蛋白在細胞質中二硫健的形成，增加外源蛋白的可溶性。
根據本發明提供的重組人內皮抑素的表達方法，在總表達量提高的同時，可溶性重組人內皮抑素的表達均可達到總表達量的40％-80％。特別優選地，總表達量達菌體蛋白的47％，同時可溶性表達達89％。
因而，本發明提供的重組人內皮抑素表達菌株及其表達方法，有效解決了現有技術中存在的人內皮抑素以包涵體形式表達的技術缺陷，有利于重組人內皮抑素的純化。
另外，本發明構建表達載體的方法也可以用于其他種屬內皮抑素，例如鼠內皮抑素或其他外源蛋白的可溶性表達。
附圖1PCR產物瓊脂糖電泳檢測圖。泳道M為DL2000 DNA分子量標準，單位bp；泳道1為PCR產物。
附圖2大腸桿菌E.coli(pET-Endo)全蛋白SDS-PAGE電泳圖。1.E.coli(pET-43.1a)(未誘導)；2.E.coli(pET43.1a)(IPTG誘導)；3.E.coli(pET-Endo)(未誘導)4.E.coli(pET-Endo)(IPTG誘導)；M.蛋白分子量標準。
附圖3大腸桿菌E.coli(pET-Endo)破菌蛋白SDS-PAGE電泳圖。1.E.coli(pET43.1a)(上清)；2.E.coli(pET-Endo)(上清)；3.E.coli(pET-Endo)(包涵體)；4.E.coli(pET-Endo)(包涵體)；M.蛋白分子量標準。
附圖4大腸桿菌Origami(pGEX-Endo)表達系統全蛋白SDS-PAGE電泳圖。1Origami(pGEX-4T-1)(IPTG誘導)；2Origami(pGEX-4T-1)(未誘導)；3.Origami(pGEX-Endo)(IPTG誘導)；3.Origami(pGEX-Endo)(IPTG誘導)；4Origami(pGEX-Endo)(誘導前)；5Origami(pGEX-Endo)(包涵體)；6Origami(pGEX-Endo)(上清)；7Origami(pGEX-4T-1)(上清)；8Origami(pGEX-4T-1)(包涵體t)；M蛋白質分子量標準。
附圖5重組人內皮抑素在大腸桿菌中的可溶性高效表達結果SDS-PAGE電泳圖。M.蛋白分子量標準；1.E.coli(pET-Endo)(上清)；2.E.coli(pET-Endo)(包涵體)。
以下結合具體實施方式
進一步闡明本發明，但應理解，這些實施例都僅僅是說明性的，不以任何形式限制本發明的范圍。在下述各實施例中，未指明具體條件的試驗方法，按照本領域公知的常規試驗方法進行，或者按照廠商所建議的操作說明進行。
具體實施例方式
實施例1 重組人內皮抑素表達質粒pET-Endo的構建根據人內皮抑素的基因序列，合成N端和C端引物序列，其引物序列如下引物15′-GCATAGCCATCGTGATTTC-3′(SEQ ID NO2)和引物25′-CGGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCAT-3′(SEQ ID NO3)以質粒pMD-Endo為模板，用以上兩條引物，通過PCR方法擴增人內皮抑素基因，經瓊脂糖電泳分析，擴增片段約550bp(圖1)，與預計的相吻合。將PCR片段和載體pET43.1a分別用PshAI和BamHI酶切后，使用TaKaRa DNA連接試劑盒(TaKaRa DNA Ligation Kit)進行連接，獲得重組人內皮抑素表達載體pET-Endo。
將上述載體用熱激法轉化至大腸桿菌Top10(商業菌株)感受態細胞中。操作如下取一管大腸桿菌Top10感受態細胞(含100μl菌液)，在冰上融化，將上述連接液全部加入融化的大腸桿菌Top10感受態細胞中，冰上放置30min，42℃水浴熱激90s，冰上放置2～3min，加入900μl LB培養基(LB培養基的組成是1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物和1％(w/v)NaCl)，轉移至37℃搖床中250r/min振蕩培養1hr，然后涂布于含100mg/L氨芐青霉素LB平板上，37℃過夜培養；第二天挑選單克隆，轉接在含100mg/L氨芐青霉素的LB培養液中，37℃過夜振蕩培養后，提取質粒，酶切鑒定后，對核苷酸序列進行測序，結果證實核苷酸序列和氨基酸序列的閱讀框架完全正確。證明上述表達載體是正確的。
實施例2重組人內皮抑素表達菌株的構建與表達將重組質粒pET-Endo用熱激法轉化至大腸桿菌Origami(DE3)感受態中(操作同實施例1)。第二天挑選單克隆，轉接在含100mg/L氨芐青霉素的LB培養液中，37℃過夜振蕩培養后，提取質粒，酶切鑒定后進行誘導表達。將含表達質粒的單克隆菌E.coli Origami-Endo在LB培養基中(含100mg/L氨芐青霉素)，37℃培養至OD600為0.5左右，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導表達6h，離心收集菌體，經超聲破菌后，分別對全菌、上清及沉淀(包涵體)蛋白進行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分離膠濃度為12％(w/v)。結果顯示在分子量80kDa左右有一條明顯的表達帶，與預期的分子量相一致，經凝膠自動掃描密度定量分析，表達的融合蛋白占菌體總蛋白的50％左右(圖2)，可溶性表達量占總表達量的40％左右(圖3)。這表明構建的表達菌株能夠可溶性高效表達重組人內皮抑素。
將人內皮抑素基因(Endo)克隆到大腸桿菌表達載體pGEX-4T-1上，構建了表達質粒pGEX-Endo，然后將其轉入大腸桿菌表達宿主Origami(DE3)中，得到重組菌株Origami(pGEX-Endo)。與上述同樣條件誘導表達及檢測，結果表明該重組菌株中所表達的人內皮抑素為包涵體(圖4)。
實施例3溫度對重組人內皮抑素可溶性表達的影響將表達菌株E.coli Origami-Endo接種于5ml、含100mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB培養液中。在細菌培養箱中，37℃，250r/min震蕩培養15h，然后將菌液以1∶100比例轉接于含100mg/L Amp的LB培養液中，37℃，250r/min震蕩培養3～4h，使菌液OD600在0.5左右，向菌液中加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG進行誘導表達，誘導溫度分別為25℃、30℃和37℃，誘導表達6h后，收集菌體，經超聲破菌后，分別對上清和沉淀(包涵體)蛋白進行SDS-PAGE分析，檢測重組人內皮抑素可溶性表達效果。經凝膠自動掃描密度定量分析，在25℃、30℃和37℃下誘導，表達的融合蛋白分別占菌體總蛋白的26％、32％和2％，可溶性表達量占總表達量的80％、41％和6％。這表明誘導溫度25℃-30℃，表達菌株重組人內皮抑素的可溶性表達量達總表達量的40％以上。
實施例4誘導劑濃度對重組人內皮抑素可溶性表達的影響將表達菌株E.coli Origami-Endo接種于5ml、含100mg/L Amp的LB培養液中。在細菌培養箱中，37℃，250r/min震蕩培養15h，然后將菌液以1∶100比例轉接于含100mg/L Amp的LB培養液中，37℃，250r/min震蕩培養3～4h，使菌液OD600在0.5左右，向菌液中加入終濃度分別為0.1mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/L的IPTG進行誘導表達，誘導溫度分別為30℃，誘導表達6h后，收集菌體，經超聲破菌后，分別對上清和沉淀(包涵體)蛋白進行SDS-PAGE分析，檢測重組人內皮抑素可溶性表達效果。經凝膠自動掃描密度定量分析，在0.1mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L IPTG濃度下，表達的融合蛋白分別占菌體總蛋白的40％、43％和45％，可溶性表達量分別占總表達量的88％、85％和74％。
實施例5誘導時間對重組人內皮抑素可溶性表達的影響將表達菌株E.coli Origami-Endo接種于5ml、含100mg/L Amp的LB培養液中。在細菌培養箱中，37℃，250r/min震蕩培養15h，然后將菌液以1∶100比例轉接于含100mg/L Amp的LB培養液中，37℃，250r/min震蕩培養3～4h，使菌液OD600在0.5左右，向菌液中加入終濃度分別為0.1mmol/L的IPTG進行誘導表達，誘導溫度分別為25℃，誘導表達時間分別為6h、8h、10h和19h后，收集菌體，經超聲破菌后，分別對上清和沉淀(包涵體)蛋白進行SDS-PAGE分析，檢測重組人內皮抑素可溶性表達效果。經凝膠自動掃描密度定量分析，在6h、8h、10h和19h的誘導表達時間下，表達的融合蛋白分別占菌體總蛋白的54％、46％、43％和31％，可溶性表達量分別占總表達量的84％、87％、88％和55％。
實施例6重組人內皮抑素的可溶性高效表達將表達菌株E.coli Origami-Endo接種于5ml、含100mg/L Amp的LB培養液中。在細菌培養箱中，37℃，250r/min震蕩培養15h，然后將菌液以1∶100比例轉接于含100mg/L Amp的LB培養液中，37℃，250r/min震蕩培養3～4h，使菌液OD600在0.5左右，向菌液中加入終濃度分別為0.1mmol/L的IPTG進行誘導表達，誘導溫度為25℃，誘導表達時間為10h后，收集菌體，經超聲破菌后，分別對上清和沉淀(包涵體)蛋白進行SDS-PAGE分析，檢測重組人內皮抑素可溶性表達效果，經凝膠自動掃描密度定量分析，表達的融合蛋白占菌體總蛋白的47％，可溶性表達量占總表達量的89％左右(圖5)。
序列表<110>山東東阿阿膠股份有限公司，華東理工大學<120>一種重組人內皮抑素表達菌株及可溶性表達方法<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>552<212>DNA<213>人種(human sp.)<220>
<221>gene<222>(1)..(552)<400>1catactcatc aggactttca gccagtgctc cacctggtgg cactgaacac ccccctgtct 60ggaggcatgc gtggtatccg tggagcagat ttccagtgct tccagcaagc ccgagccgtg120gggctgtcgg gcaccttccg ggctttcctg tcctctaggc tgcaggatct ctatagcatc180gtgcgccgtg ctgaccgggg gtctgtgccc atcgtcaacc tgaaggacga ggtgctatct240cccagctggg actccctgtt ttctggctcc cagggtcaac tgcaacccgg ggcccgcatc300ttttcttttg acggcagaga tgtcctgaga cacccagcct ggccgcagaa gagcgtatgg360cacggctcgg accccagtgg gcggaggctg atggagagtt actgtgagac atggcgaact420gaaactactg gggctacagg tcaggcctcc tccctgctgt caggcaggct cctggaacag480aaagctgcga gctgccacaa cagctacatc gtcctgtgca ttgagaatag cttcatgacc540
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<223>引物<400>3cgggatccct acttggaggc agtcat 2權利要求
1.一種重組人內皮抑素的表達載體，其特征在于，該載體由人內皮抑素基因插入載體pET43.1a得到。
2.一種重組人內皮抑素的表達菌株，其特征在于，該菌株含有如權利要求1所述的表達載體。
3.如權利要求2所述所述的表達菌株，其特征在于，宿主菌為大腸桿菌OrigamiDE3。
4.制備如權利要求2或3所述的表達菌株的方法，其特征在于，包括如下步驟將人內皮抑素基因插入載體pET43.1a構建表達載體和將該表達載體轉化宿主菌。
5.如權利要求4所述的制備重組人內皮抑素表達菌株的方法，其特征在于，根據人內皮抑素基因合成兩段引物SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，以質粒pMD-Endo為模板，通過PCR方法擴增人內皮抑素基因，將PCR產物和載體pET43.1a分別用PshAI和BamHI酶切后，DNA連接酶連接，將Endo基因插入載體pET43.1a的PshAI和BamHI之間；將連接產物轉化宿主菌。
6.一種重組人內皮抑素的可溶性表達方法，包括培養如權利要求2或3所述的表達菌株，其特征在于，誘導溫度為25-30℃。
7.一種重組人內皮抑素的可溶性表達方法，包括培養如權利要求2或3所述的表達菌株，其特征在于，用終濃度為0.1-1.0mmol/L的IPTG誘導表達。
8.如權利要求7所述的表達方法，其特征在于，用終濃度為0.1-0.5mmol/L的IPTG誘導表達。
9.如權利要求6所述的表達方法，其特征在于，用終濃度為0.1-0.5mmol/L的IPTG誘導表達。
10.如權利要求3所述的制備表達菌株的方法在制備其他重組蛋白可溶性表達菌株中的用途。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組人內皮抑素表達菌株及其可溶性表達方法。本發明提供了一種重組人內皮抑素的表達菌株和可溶性表達的方法。該菌株含有表達載體pET－Endo，該表達載體由人內皮抑素基因插入載體pET43.1a獲得。培養該表達菌株，用終濃度0.1～1.0mmol/L的IPTG誘導，誘導溫度25～30℃，誘導時間6～10h，外源蛋白可溶性表達量可達到總表達量的80％以上，總表達量為菌體總蛋白的50％左右。因而本發明克服了人內皮抑素以包涵體形式表達的缺陷。本發明可用于重組人內皮抑素的制備及其它重組蛋白的可溶性表達。
文檔編號C12N15/70GK1724671SQ200510027530
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月4日 優先權日2005年7月4日
發明者杜翠紅, 張元興, 龐甲佩, 尤金花, 章安 申請人:山東東阿阿膠股份有限公司, 華東理工大學