專利名稱：重組人血管抑素k1－3的制備工藝及其制品在腫瘤治療藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明提供一種重組人血管抑素K1-3的制備工藝，同時還公開了及制品在腫瘤治療藥物中的應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
癌癥是當今世界范圍內的常見病和多發病，目前臨床上常用的抗癌藥多為化療藥物，化療藥物在殺傷癌細胞的同時，對人體正常組織細胞有明顯的毒副作用，尤其是嚴重損傷人體的骨髓造血系統。
1971年Folkman提出腫瘤生長和轉移依賴新生血管生成，因此，阻斷腫瘤新生血管形成就可能阻止腫瘤生長和轉移，抗新生血管療法也成為腫瘤治療的重要手段之一。
血管抑素是1994年O’Reilly等在Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清和尿液中提取得到的內源性血管生成抑制劑。對小鼠血管抑素進行N-端序列分析顯示它與小鼠纖溶酶原(Plasminogen)從第98位氨基酸殘基(這里以起始氨基酸殘基Met為第一位氨基酸殘基，傳統定位方法是以成熟肽鏈中第一個氨基酸殘基Gly19為N-端第一個氨基酸殘基)起始的一段序列相對應(O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，et al.Angiostatina novel angiogenesis inhibitorthat mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79315~328)。依據對血管抑素的N-末端部分氨基酸序列的測定結果分析，認為它至少包括纖溶酶原5個Kringles結構中的前4個，每個Kringle結構由80個左右氨基酸殘基組成(Lerch P G，Riskli E E，LergierW，et al.Localization of individual lysine-binding regions in humanplasminogen and investigations on their complex forming properties.EurJ Biochem，1980，1077~13)。O’Reilly指出，38kDa血管抑素是纖溶酶原內部的一個片段，這是因為(i)對小鼠血管抑素23％的序列進行分析，結果表明它與纖溶酶原相應片段完全一致；(ii)對人纖溶酶原進行限制酶解，其產物(稱天然人血管抑素)在體外具有抑制牛毛細血管內皮細胞(bovinecapillary endothelial cell，BCE)增殖活性，在體內具抑制雞胚尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)血管生成作用。而纖溶酶原則不具備此作用。同時，前者具抑制小鼠Lewis肺癌生長及轉移作用；(iii)抗K1-3抗體能使血管抑素的抗小鼠Lewis肺癌生長及轉移活性完全消除。血管抑素不僅能抑制轉移瘤的生長，還對包括小鼠Lewis肺癌原發瘤及小鼠血管內皮瘤等在內的多種原發瘤的生長也具有抑制作用(O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，etal.Angiostatina novel angiogenesis inhibitor that mediates thesuppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79315~328)。
進一步研究發現重組人纖溶酶原的K1、K2、K3、K1-3、K2-3均能有效抑制BCE細胞增生，呈劑量依賴型，而K4幾乎無此活性。K1-3抑制細胞增生的活性要強于K1-4[Cao Y，Ji RW，Davidson D，et al.Kringle domains of humanangiostatinCharacterization of the antiproliferative activity ofendothelil cells.J Biol Chem，1996，271(46)29461-29467.]血管抑素的出現，不僅促進了人們對腫瘤發生、發展過程中血管生成的理解，還提出了一種新的腫瘤治療策略，即抗血管生成治療。其作用靶點在腫瘤新生血管，與細胞毒性治療(如化療和放療)或免疫治療的作用機理和作用靶點不同。血管抑素是內源性纖溶酶原的裂解產物，一般不太可能引起免疫反應。它特異性地作用于增生內皮細胞，因此不會誘發免疫抑制、骨髓抑制和胃腸道反應。長期注射也不出現體重減輕、活動減少、食欲下降及條件致病菌的感染等[Sim BKL，O’Reilly MS，Liang H，et al.A recombinant human angiostatin protein inhibitsexperimental primary and metastatic cancer.Cancer Res，1997，571329-1334.]。肝、腎功能等亦不會受到影響[Kirsch M，Strasser J，Allende R，et al.Angiostatin suppress malignant glioma growth invivo.Cancer Res，1998，584654-4659.]。腫瘤對化療藥物產生耐藥或對放療不敏感的部分原因是由于腫瘤細胞遺傳的不穩定性和高突變率。而內皮細胞具有相對穩定的遺傳特性，突變率低，所以用血管抑素針對內皮細胞的治療一般不會出現耐藥性。目前臨床應用最大的障礙是不能獲得大量的血管抑素蛋白用于長期治療。
發明內容
本發明公開了一種重組人血管抑素K1-3的制備方法，提供一種重組人血管抑素的高效原核表達系統、最適純化工藝及最佳復性系統，目的是在于使重組人血管抑素能夠高效表達，純化后能正確折疊，從而達到了用原核表達系統以包含體形式高效表達和大批量生產高活性的重組人血管抑素，用于各種腫瘤治療的目的。
本發明的技術解決方案是由基因克隆、工程菌的誘導培養、重組產物的純化和復性過程組成，其步驟如下(1)通過PCR方法從人肝細胞中克隆了人纖溶酶原cDNA中Kringle1-3的cDNA片段，在克隆時對其N-端和C-端序列進行了優選。
(2)將這一cDNA片段克隆入自行設計構建的原核表達載體pHB中，用重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經篩選得到高效表達重組人血管抑素的基因工程重組子。
(3)經發酵培養和誘導表達重組人血管抑素的菌體經超聲裂解、離心洗滌包含體后將其溶解，之后經過陰離子交換層析、調酸稀釋復性、陽離子交換層析、超濾濃縮及凝膠過濾等手段純化而得到人重組血管抑素蛋白質純品。
上述的上述工藝制備的重組人血管抑素K1-3具有以下特性(1)其表達載體為自行設計的原核表達載體，其啟動子為T7。
(2)其表達產物以包含體的形式出現。
(3)其基因工程宿主菌為BL21(DE3)。
(4)其氨基酸序列經過了優化。
(5)有抑制血管生成活性，具體的說能抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖及尿囊膜新生血管的生成，而且能夠抑制荷瘤鼠腫瘤的生長及轉移。
藥物組合物及用途重組人血管抑素K1-3制品在腫瘤治療中的應用，其制品為單制劑制備成生物制品，并根據其可抑制腫瘤新生血管的生成來治療腫瘤。
通常，本發明的重組人血管抑素K1-3可以純化的形式單獨應用或與藥學上適當的載體一起被使用。一般，這些載體包括水或醇/水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質。非腸道載體包括氯化鈉溶液、林格(Ringer’s)葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉以及乳酸林格氏溶液。如有必要保持懸浮液中的復合體，則適當的生理可接受的佐劑可選自如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽的增稠劑。靜脈內載體包括液體和營養補充劑以及電解質補充劑。
本發明的重組人血管抑素K1-3可用作單獨施用的組合物，或用作與其它藥及聯合施用的組合物，這些包括多種腫瘤治療藥物，如環孢菌素、氨甲喋呤、阿霉素或順氯氨鉑以及免疫毒素。藥物組合物可包括多種細胞毒劑或其它試劑與本發明的人血管抑素相聯合的“雞尾酒劑”。
根據本發明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領域普通技術人員普遍知道的任何一種，包括非腸道、靜脈內、肌內、腹腔內給藥，或者也可以通過用導管直接灌注給藥。制劑中還可以包括其它的醫藥活性物質。其它的添加劑，如保護劑、穩定劑、乳化劑、緩釋劑、緩沖劑及類似物。給藥的劑量和頻率依據年齡、性別、病人狀態、同時服用其它藥物、不良反應和臨床醫師考慮到的其它因素而定。
具體制備方法如下(1)通過PCR方法從人胎兒肝臟細胞cDNA文庫中篩選得到人纖溶酶原Kringle結構的1-3cDNA序列。首先設計兩條引物分別為5’-GGGAATTCCATATGAAA(C)GTNTAT(C)CTNTCNGAG(A)TGC(T)AAG(A)ACTGGNAATGG-3’和5’-CTAGTCTAGATTAGGNGTNACNGGNCGNTATCTTACAGTACT--3’，以人胎兒肝臟細胞cDNA文庫為模板，進行PCR擴增，條件為94℃，5分鐘；94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，1分鐘，進行30個循環，之后再72℃延伸10分鐘。得到人血管抑素K1-3的基因片段。
(2)將基因克隆入T-easy質粒中或直接用NdeI和XbaI酶切，電泳回收特異基因片段，再克隆入用同樣內切酶酶切的表達載體pHB質粒中，其中pHB質粒的構建過程如下利用限制性內切酶BglII和AatII雙酶消化pET-3a質粒(美國Novagen公司產品)，獲得一個719個堿基的DNA片段。這一片段含有T7啟動子、終止子、核糖體結合序列及NdeI/BamHI亞克隆位點。將此片段插入pUC19質粒(美國BRL公司產品)，以取代pUC19質粒中的BamHI/AatII酶切片段。由此獲得一種新質粒，稱之為pHB，該質粒具有可使載入的克隆化基因在大腸桿菌中高效表達的特點，其結構見圖1。
(3)將該重組質粒pANGK1-3轉化到BL21(DE3)中，經篩選得到高效基因工程菌株，重組質粒pANGK1-3的結構見圖3。
(4)經發酵誘導表達的菌液，經超聲破碎、離心洗滌包含體、溶解包含體、陰離子交換層析、調酸稀釋復性、超濾濃縮、凝膠過濾層析、超濾濃縮、過濾除菌等手段得到人重組血管抑素蛋白質，其具體過程如下1)收集菌體，70006離心15分鐘，離心棄上清，用菌體洗滌液(Tris-HCl50mM，EDTA 0.01M，NaCl 100mM克，PH8.0)，6000G離心洗滌兩次。加入含0.5％Triton X-100的菌體洗滌液，于4℃超聲裂解菌體，2500-5000G三次離心洗滌得到的包涵體。
2)在包涵體沉淀中按1g/15ml比例加入包涵體溶解液(Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，NaCl 100mM，40mM DTT，8M尿素，PH8.0)溶解液中充分溶解。
3)加入一倍量的碳酸鹽緩沖液(NaHCO3-NaOH 50mM，EDTA 0.01M，pH11，用NaCl將電導調至5-17ms/cm)，將混合液用1N NaOH緩慢調至pH8.8-11.3，除氣后過G-25凝膠過濾柱，去除變性劑，收集第一組分。
4)上述組分過QAE柱，20-45ms/cm清洗，收集52-58ms/cm組分，超濾或稀釋降低鹽濃度，將電導降至6-18ms/cm。
5)過QAE柱，20-38ms/cm清洗，收集45-58ms/cm組分。超濾或稀釋，將溶液電導降至10-25ms/cm，加入終濃度為0.9-1.8mM的GSH。
6)將上述組分加至DEAE陰離子交換介質柱，將柱上口和下口與放入攪拌子的外接瓶連接構成封閉系統，在輸液泵的驅動下形成閉路循環，向外接瓶中用另一臺輸液泵緩慢加入1N HCl，當pH降到10.2-8.2時停止鹽酸供給，補加終濃度為0.2-1.2mM GSSG，室溫放置1小時。繼續緩慢補加鹽酸直至pH值降到7.8后(整個pH下降過程不應小于4小時)，收集外接瓶中的復性產物，將復性液稀釋至電導6-28ms/cm，過DEAE柱，收集穿出部分，用PBS(5mM)進行緩沖液超濾置換并將蛋白濃縮到所需濃度，置室溫4小時。
7)向終產物中加入終濃度為1-5％的甘露醇和1-6％的甘氨酸。0.22μm濾膜過濾除菌，分裝、凍干保存。
本發明所制備的重組人血管抑素K1-3具有抑制人臍靜脈內皮細胞增殖、抑制雞胚尿囊膜毛細血管生成及抑制腫瘤生長及轉移作用。
(1)純化的人血管抑素蛋白加入到體外培養的原代人臍靜脈內皮細胞中，同時以生理鹽水作為陰性對照，以5-FU為陽性對照，72小時后，用MTT法測定細胞活力，從而判斷血管抑素對毛細血管內皮細胞增殖活性的影響。結果顯示血管抑素對臍靜脈內皮細胞具有明顯的增殖抑制活性(結果見圖5)。
(2)將純化的人血管抑素蛋白滴于濾紙片上，放于培養三天的雞胚尿囊膜毛細血管新生區，48小時候觀察純化的人血管抑素蛋白對雞胚尿囊膜血管生成的影響。結果表明血管抑素組對雞胚新生血管的生成有明顯的抑制作用(結果見圖6)。
(3)將純化得到的人重組人血管抑素蛋白分高(3mg/kg)、中(1mg/kg)、低劑量(0.3mg/kg)注射到Lewis肺癌實體瘤模型小鼠體內，每日一次，同時設生理鹽水組作為陰性對照，設CTX組作為陽性對照，21天后處死動物，測量瘤體積變化及轉移瘤大小并進行病理學檢查，觀察重組人血管抑素的抗腫瘤作用及抗轉移活性。結果表明大、中、小劑量血管抑素的抑瘤率分別為86.0％、75.7％、66.1％。血管抑素組與生理鹽水組比較瘤體積重量具有顯著性差異(P＜0.001)。肺轉移結節計數結果表明給予血管抑素的動物肺組織表面轉移結節明顯減少，與生理鹽水組比較具有顯著性差異(P＜0.001)。
表1血管抑素的抗腫瘤效果
**表示與0.9％NaCl組相比有顯著差異，p＜0.001ΔΔ表示與CTX組相比有顯著差異，p＜0.001Δ表示與CTX組相比有明顯差異，p＜0.05本發明與現有技術相比具有如下優點(1)重組人血管抑素蛋白用于治療腫瘤優于現有的抗腫瘤藥物，因為現有的藥物均有其不可避免的毒副作用，而血管抑素因是人纖溶酶原的一部分，是人體內正常存在的分子，只是含量較少，所以用其治療人體腫瘤不會產生超敏反應。
(2)本發明在對天然人血管抑素的生成機制、分子特性和生物學活性進行深入系統研究的基礎上，對重組人血管抑素的蛋白氨基酸序列進行了優選，從而為保證重組人血管抑素的原核高效表達和高活性奠定了基礎條件。同時自行設計構建了重組人血管抑素的原核高效表達系統，利用這一表達系統實現了重組人血管抑素的高效表達，使重組人血管抑素的表達量達到了工程菌可溶性蛋白的50％以上。
(3)本發明在制備工藝技術上的創新主要表現在以下三個方面--其一是發酵工藝的建立和優化。通過調整培養液配方和發酵條件，探索建立了利用此表達系統制備重組人血管抑素的最適發酵工藝，使每升發酵液重組人血管抑素的含量高達5克。其二是純化工藝的建立和優化。根據重組人血管抑素的分子特性，經過系統研究建立了重組人血管抑素的最適純化工藝，利用這一純化工藝條件，在保證重組人血管抑素純度達到99.9％以上的前提下，使其收率達到了26-30％。其三是復性工藝的建立和優化。血管抑素的分子結構相當復雜，其內部含有多個Kringle結構，要實現復性實現其分子的正確折疊相當困難，這是一個在此之前國際上始終未能解決的技術難題。本發明根據血管抑素分子結構特點，設計了一套獨特的復性工藝條件，實現了重組人血管抑素的正確折疊，使其具有了與天然血管抑素相同的生物學活性，從而解決了這一國際性技術難題。
(4)本發明所制備的重組人血管抑素可明顯抑制人血管內皮細胞的增殖。
(5)本發明所制備的重組人血管抑素可明顯抑制雞胚尿囊膜新生毛細血管的生成。
(6)本發明所制備的重組人血管抑素可特異抑制腫瘤新生血管的生成，從而抑制腫瘤的生長及轉移，而對其它臟器沒有影響，我們的實驗已證實這種結論。
圖1原核表達載體pHB的結構示意2重組人血管抑素K1-3的優選氨基酸序列圖3重組質粒pANGK1-3的結構示意4重組人血管抑素基因K1-3表達產物的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜。
圖5重組人血管抑素對人臍靜脈內皮細胞的增殖抑制作用圖6重組人血管抑素對雞胚新生毛細血管生成的抑制作用A對照雞胚尿囊膜毛細血管網B，C添加本發明血管抑素的雞胚尿囊膜毛細血管網
具體實施例方式為了便于理解本發明，特列舉以下實施例。其作用應被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。
實施例1原核表達載體pHB的構建利用限制性內切酶BglII和AatII雙酶消化pET-3a質粒(美國Novagen公司產品)，獲得一個719個堿基的DNA片段。這一片段含有T7啟動子、終止子、核糖體結合序列及NdeI/BamHI亞克隆位點。將此片段插入pUC19質粒(美國BRL公司產品)，以取代pUC19質粒中的BamHI/AatII酶切片段。由此獲得一種新質粒，稱之為pHB，該質粒具有可使載入的克隆化基因在大腸桿菌中高效表達的特點，其結構見圖1。
實施例2人血管抑素基因的克隆及表達本發明的制備工藝主要是經過基因克隆、細菌發酵培養、提取、純化等過程而得到的制品，其步驟如下1.通過PCR方法從人胎兒肝細胞cDNA文庫中篩選而得到人血管抑素基因即纖溶酶原Kringle結構的1-3cDNA。首先制備兩條引物分別為5’-GGGAATTCCATATGAACGTATATCTATCGGAGTGTAAGACTGGGAATGG-3’和5’-CTAGTCTAGATTAGGAGTGACTGGACGCTATCTTACAGTACT--3’，以1μl人胎兒肝臟細胞cDNA為模板，加入上述兩種引物各2μl，濃度為每毫升10nM，加入8μl 2.5mMdNTP、5μl 10×PCR緩沖液，1μl Taq DNA聚合酶。PCR條件為94℃，5分鐘；94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，1分鐘，進行30個循環，之后再72℃延伸10分鐘。用15％瓊脂糖凝膠電泳分離得到人血管抑素K1-3基因片段。
(2)將該基因片段克隆入T-easy質粒中，方法按promega TA克隆試劑盒方法進行。4℃連接過夜，轉化大腸桿菌，在涂有X-gal和IPTG的板上進行藍白篩選，將白色菌落擴增、提取質粒，并進行測序，將篩選得到的陽性重組質粒用NdeI和XbaI酶切并回收基因片段，同時將pHB用NdeI和XbaI酶切，并回收質粒，將回收的片段和質粒進行連接，然后轉化BL21(DE3)，篩選陽性克隆。
(3)將測序正確的陽性克隆菌株擴增培養，并克隆化篩選高效基因工程菌株。將工程菌加入發酵罐中培養，當OD值達到0.4-0.6時，加入終濃度為1mM的IPTG繼續培養4小時。收集菌體，超聲破碎后用10％SDS-PAGE電泳鑒定表達情況。結果見圖4，圖中1，2純化的人血管抑素；3包含體；4重組質粒轉化工程菌用IPTG誘導；5重組質粒轉化工程菌未用IPTG誘導；6蛋白質分子量標尺。
實施例3血管抑素的純化、變性及復性(1)將表達人血管抑素的基因工程菌菌體超聲波破碎后，7000G離心15分鐘，棄上清，用菌體洗滌液(Tris-HCl 50mM，EDTA 0.01M，NaCl 100mM，pH8.0)洗滌兩次，加入含0.5％Triton X-100的菌體洗滌液，于4℃超聲裂解菌體，2500-5000G三次離心洗滌得到的包含體。
(2)在包含體沉淀中加入包含體溶解液(Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，NaCl100mM，40mM DTT，8M尿素，pH8.0)使包含體充分溶解。
(3)加入一倍量的碳酸鹽緩沖液(NaHCO3-NaOH 50mM，EDTA 0.01M，pH11，用NaCl將電導調至6ms/cm)，將混合液用1N NaOH緩慢調至pH9，除氣后過G-25凝膠過濾柱，去除變性劑，收集第一組分。
(4)上述組分過QAE柱，26ms/cm清洗，收集58ms/cm組分，超濾或稀釋降低鹽濃度，將電導降至6ms/cm。
(5)過QAE柱，20ms/cm清洗，收集56ms/cm組分。超濾或稀釋，將溶液電導降至10ms/cm，加入終濃度為1.8mM的GSH。
(6)將上述組分加至DEAE陰離子交換介質柱，將柱上口和下口與放入攪拌子的外接瓶連接構成封閉系統，在輸液泵的驅動下形成閉路循環，向外接瓶中用另一臺輸液泵緩慢加入1N HCl，當pH降到10.1時停止鹽酸供給，補加終濃度為1.0mMGSSG，室溫放置1小時。繼續緩慢補加鹽酸直至pH值降到7.8后(整個pH下降過程不應小于4小時)，收集外接瓶中的復性產物，將復性液稀釋至電導25ms/cm，過DEAE柱，收集穿出部分，用PBS(5mM)進行緩沖液超濾置換并將蛋白濃縮到所需濃度，置室溫4小時。
(7)向終產物中加入終濃度為1％的甘露醇和6％的甘氨酸。0.22μm濾膜過濾除菌，分裝、凍干保存。
實驗例1人血管抑素對體外培養的人臍靜脈內皮細胞的增殖抑制活性體外培養人臍帶內皮細胞，用10％FCS的DMEM培養基培養，待其生長良好時，用0.25％的胰酶消化后接種到96孔培養板，每孔100μl，濃度為2×105，次日加入人血管抑素使其終濃度為10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml 320ng/ml、640ng/ml，同時以5-FU為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，繼續培養56小時后摻入MTT(5mg/ml)，每孔5μl，繼續培養4小時，吸出上清，每孔加100μl DMSO，振蕩后用酶標儀測定OD570值。
實驗例2人血管抑素對雞胚尿囊膜毛細血管生成的抑制作用將種雞蛋置于38℃孵箱培養，3天后剝開蛋殼，并小心撕開尿囊膜，將純化的人血管抑素蛋白50μg/ml，10μl滴于濾紙片上，放于培養三天的雞胚尿囊膜毛細血管新生區，同時用PBS為對照，48小時候觀察純化的人血管抑素蛋白對雞胚尿囊膜血管生成的影響。
實驗例3重組人血管抑素對荷瘤鼠腫瘤生長的抑制作用將純化得到的人重組人血管抑素蛋白分高(3mg/kg)、中(1mg/kg)、低劑量(0.3mg/kg)注射到Lewis肺癌實體瘤模型小鼠體內，同時以CTX為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，每日一次，21天后處死動物，測量瘤體積變化及轉移瘤大小并進行病理學檢查，觀察重組人血管抑素的抗腫瘤作用及抗轉移活性。
權利要求
1.一種制備重組人血管抑素K1-3的制備工藝，該工藝是由基因克隆、工程菌的誘導培養、重組產物的純化和復性過程組成，其步驟如下(1)通過PCR方法從人肝細胞中克隆了人纖溶酶原cDNA中Kringle1-3的cDNA片段，在克隆時對其N-端和C-端序列進行了優選。(2)將這一cDNA片段克隆入自行設計構建的原核表達載體pHB中，用重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經篩選得到高效表達重組人血管抑素的基因工程重組子。(3)經發酵培養和誘導表達重組人血管抑素的菌體經超聲裂解、離心洗滌包含體后將其溶解，之后經過陰離子交換層析、調酸稀釋復性、陽離子交換層析、超濾濃縮及凝膠過濾等手段純化而得到人重組血管抑素蛋白質純品。
2.根據權利要求1所述的重組人血管抑素具有以下特性(1)其表達載體為自行設計的原核表達載體，其啟動子為T7。(2)其表達產物以包含體的形式出現。(3)其基因工程宿主菌為BL21(DE3)。(4)其氨基酸序列經過了優化(5)有抑制血管生成活性，具體的說能抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖及尿囊膜新生血管的生成，而且能夠抑制荷瘤鼠腫瘤的生長及轉移。
3.權利要求1所述的重組人血管抑素制品在腫瘤治療中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種人血管抑素K1－3的制備方法及其制品在抗腫瘤治療中的應用。本發明在對天然人血管抑素的生成機制、分子特性和生物學活性進行深入系統研究的基礎上，對重組人血管抑素的蛋白氨基酸序列進行了優選，并自行設計構建了重組人血管抑素的原核高效表達系統，使血管抑素K1－3的表達量達到工程菌可溶性蛋白的50％以上，同時建立了最適的純化及復性工藝，使重組人血管抑素的純度達99.9％以上并能正確折疊。由此獲得的重組人血管抑素K1－3能抑制腫瘤新生血管的生成，并對多種腫瘤具有治療作用。
文檔編號C12N15/58GK1824775SQ20051001659
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月25日 優先權日2005年2月25日
發明者李玉新, 烏垠, 鮑永利, 王秀紅, 孟祥穎, 易靜雯, 黃百渠, 郝水 申請人:東北師范大學遺傳與細胞研究所