專利名稱：性病混合感染pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術，特別是同步檢測性病混合感染的聚合酶鏈式反應試劑盒，簡稱性病混合感染PCR檢測試劑盒。
背景技術：
性傳播疾病(性病)是一類主要通過已感染與未感染者之間的性接觸而傳播的疾病。在我國性病已成為上升幅度最快的傳染病之一，性病的發病率、發現的性病病原體的種類及與其他傳染病有關的問題不斷增加，性病的頻發也顯著加快了艾滋病的傳播速度。目前已發現的可經性途徑傳播的病原體已由原來的4種擴展為現今的20余種，包括細菌、真菌、病毒、衣原體、支原體、螺旋體、寄生蟲等7大類。據估計，大約有50％的性病感染者無癥狀，若診斷延誤或治療不及時不僅會成為重要的傳染源，加速性病的傳播，而且會導致并發癥和后遺癥的發生，造成慢性炎癥、不孕不育甚至癌變等。隨著性病的增多，混合感染的問題也越來越嚴重，混合感染通常以一種性病臨床表現和癥狀比較典型，而其他一種或幾種性病的癥狀較隱匿，極易造成漏診漏治。
采取強有力的行為干預措施積極預防病原體的傳播是阻斷傳染病發生與流行的有效手段，而快速準確地甄別病原體攜帶者是實施有效的預防和治療的前提，對于降低性病尤其是艾滋病在我國的流行具有積極意義。傳統上，性病病原學診斷方法包括培養法和非培養法。培養法敏感、特異，是某些性病篩查的標準方法，但培養法耗時長、對標本的采集與運送都有較高的要求、且某些病原體難以或尚不能進行體外培養(如人乳頭瘤病毒)。非培養法(如涂片鏡檢、血清學試驗等)方便，但敏感性低，對于癥狀不明顯或無癥狀感染者難以檢出。聚合酶鏈式反應(PCR)技術結合了培養法與非培養法的優點具有更高的敏感性與特異性，能夠進行感染早期或無癥狀感染等病原體載量較低的檢測；標本采集方便，可使用非侵入性標本(如患者自取的陰道或外陰標本、尿液等)；對標本運送條件要求不高；檢測快速。目前國內已開發出來的PGR檢測試劑盒均為一病一盒，不利于混合感染性病的篩查。
發明內容
本發明的目的旨在克服現有技術的不足而提供一種檢測快速、對標本運送條件要求不高、標本采集方便、具有更高敏感性與特異性，對多種STD病原體進行同步檢測的性病混合感染PCR檢測試劑盒。
本發明的目的是這樣實現的一種性病混合感染PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括預處理液、擴增管和陽性模板，所述的陽性模板在血液型擴增管中為含乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、梅毒螺旋體、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒或其中任意組合或單種病原體的特定基因序列的質粒載體；在分泌液型擴增管中為含白色念珠菌、解脲支原體、淋球菌、沙眼衣原體或其中任意組合或單種病原體的特定基因序列的質粒載體。
——所述的預處理液為0.1-1.0mol/L氫氧化鈉溶液。
——所述的擴增管分為血液型或/和分泌液型。
——所述的擴增管由DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸、緩沖液、鎂離子、混合引物和水組成。
——所述質粒載體的特定基因序列為以下所列基因或其中任意組合血液型的乙型肝炎病毒S基因、人免疫缺陷病毒gag基因、人乳頭瘤病毒主要農殼蛋白L1基因、梅毒螺旋體TP0574基因、人巨細胞病毒UL123基因、單純皰疹病毒UL30基因；分泌液型的白色念珠菌自主復制序列、解脲支原體脲酶復合體ureB基因ureC基因、淋球菌B蛋白基因、沙眼衣原體DRP3基因。
——所述的擴增管中的混合引物在血液型中為針對乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、梅毒螺旋體、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒或其中任意組合或單種病原體的特異序列而設計的引物；在分泌液型中為針對白色念珠菌、解脲支原體、淋球菌、沙眼衣原體或其中任意組合或單種病原體的特異序列而設計的引物。
——所述的混合引物為以下所列核苷酸或含其中核苷酸序列，N代表4種任意脫氧核苷三磷酸；(1)血液型乙型肝炎病毒5’-NNNNNCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGANNNNN-3’5’-NNNNNTAGGGTTTAAATGTATACCCAAAGNNNNN-3’人免疫缺陷病毒5’-NNNNNAGAGGATCCAGGGGCAAATGGTANNNNN-3’5’-NNNNNTCCCGGTACCTGTCATGCTGTCANNNNN-3’人乳頭瘤病毒5’-NNNNNGTGGGGGAACCTGTGCCTGATNNNNN-3’5’-NNNNNTGTACCATTTGGGGGAGGCGANNNNN-3’梅毒螺旋體5’-NNNNNTTAGTAACGCTTGGGTCAGTCNNNNN-3’5’-NNNNNTTGTTGGTTGTAGGCTGTGGCNNNNN-3’人巨細胞病毒5’-NNNNNAGCCATTGGTGGTCTTAGGGANNNNN-3’5’-NNNNNTTGGGCTAACTATGCAGAGCANNNNN-3’單純皰疹病毒5’-NNNNNCCACCTGACGGTGTATTACAANNNNN-3’5’-NNNNNGCGCGACCGTCTCCTCTACCTNNNNN-3’
(2)分泌液型白色念珠菌5’-NNNNNTAGCGATGAGGTAGTGCAAGNNNNN-3’5’-NNNNNGCTGCAGCTACGATTGTTAGNNNNN-3’解脲支原體5’-NNNNNTCCAGGTAAATTAGTACCAGGNNNNN-3’5’-NNNNNTCTCCTAATCTAACGCTATCANNNNN-3’淋球菌5’-NNNNNGCTACGCATACCCGCGTTGCTNNNNN-3’5’-NNNNNCGAAGACCTTCGAGCAGACATNNNNN-3’沙眼衣原體5’-NNNNNAGCACTCCAATTTCTGACTGTNNNNN-3’5’-NNNNNTCGATGATTTGAGCGTGTGTANNNNN-3’本發明是一種對10種性病病原體——乙型肝炎病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)即艾滋病病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、梅毒螺旋體(TP)、人巨細胞病毒(HCMV)、單純庖疹病毒(HSV)、白色念珠菌(CA)、解脲支原體(UU)、淋球菌(NG)、沙眼衣原體(CT)實現同步檢測的聯合PCR檢測試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理-擴增-電泳檢測結果。試劑盒的擴增管分為血液型(檢測乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、梅毒螺旋體、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒)和分泌液型(檢測白色念珠菌、解脲支原體、淋球菌、沙眼衣原體)兩種，將10種性病病原體基因引物及PCR反應體系所需的試劑按血液型和分泌液型預先加入擴增管中，一人一份，無需分裝，使用者只需將預處理后的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，從而避免操作過程中可能出現的交叉污染，簡單快速地完成檢測工作。本試劑盒對多種性病病原體進行同步檢測，適合性病混合感染的篩查，單份樣本一次反應即可檢測多種病原體，克服了目前國內性病檢測試劑盒尚不齊全，一病一盒的弊病。試劑盒靈敏性高，適合感染早期及無癥狀感染者的檢測。試劑盒使用簡單、檢測快速，對于較大范圍的感染人群或高危人群的普查以及傳染源的檢測均具有較高的使用價值。
試劑盒中的引物針對每種病原體的特異序列而設計，擴增產物特異性強，10種病原體擴增產物分子量大小呈梯度變化，清晰可辨。試劑盒還設有無感染的陽性模板，擴增產物對照檢測，結果一目了然。
圖2是本發明擴增管的分配制表。
圖1是本發明性病樣本的PCR產物分析圖。
在圖1中M為陽性分子量標準；1-4為不同樣本擴增產物。
具體實施例方式
實施例1引物序列的設計
1)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)S(HBsAg)基因(155bp-835bp)及其上、下游部分序列56bp-841bp，片段長度786bp。
上游引物5’-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGA-3’下游引物5’-TAGGGTTTAAATGTATACCCAAAG-3’2)人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1)gag基因(790bp-2295bp)1216bp-1841bp，片段長度626bp。
上游引物5’-AGAGGATCCAGGGGCAAATGGTA-3’下游引物5’-TCCCGGTACCTGTCATGCTGTCA-3’3)白色念珠菌(Candida albicans)自主復制序列27bp-710bp，片段長度684bp。
上游引物5’-TAGCGATGAGGTAGTGCAAG-3’下游引物5’-GCTGCAGCTACGATTGTTAG-3’4)解脲支原體(Ureaplasma urealyticum)脲酶復合體ureB基因(495-869bp)和ureC基因(908bp-2704bp)521bp-981bp，片段長度461bp。
上游引物5’-TCCAGGTAAATTAGTACCAGG-3’下游引物5’-TCTCCTAATCTAACGCTATCA-3’5)人乳頭瘤病毒(human papillomavirus type 6b)主要衣殼蛋白L1基因(5789bp-7291bp)6575bp-7012bp，片段長度438bp。
上游引物5’-GTGGGGGAACCTGTGCCTGAT-3’下游引物5’-TGTACCATTTGGGGGAGGCGA-3’6)淋球菌(Neisseria gonorrheae)pJD1質粒；B蛋白基因(2912bp-3553bp)3141bp-3531bp，片段長度391bp。
上游引物5’-GCTACGCATACCCGCGTTGCT-3’下游引物5’-CGAAGACCTTCGAGCAGACAT-3’7)梅毒螺旋體(Treponema pallidum)TP0574基因(12870bp-14174bp)13810bp-14132bp，片段長度323bp。
上游引物5’-TTAGTAACGCTTGGGTCAGTC-3’下游引物5’-TTGTTGGTTGTAGGCTGTGGC-3’8)人巨細胞病毒(human cytomegalovirus)UL123基因外顯子4(171006bp-172225bp)171800bp-172045bp，片段長度246bp。
上游引物5’-AGCCATTGGTGGTCTTAGGGA-3’下游引物5’-TTGGGCTAACTATGCAGAGCA-3’
9)沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)pLGV440隱蔽性質粒；DRP3基因(2225bp-3580bp)2544bp-2763bp，片段長度220bp。
上游引物5’-AGCACTCCAATTTCTGACTGT-3’下游引物5’-TCGATGATTTGAGCGTGTGTA-3’10)單純皰疹病毒(herpes simplex virus 2)UL30(DNA聚合酶)基因(63265bp-66987bp)66429bp-66544bp，片段長度116bp。
上游引物5’-CCACCTGACGGTGTATTACAA-3’下游引物5’-GCGCGACCGTCTCCTCTACCT-3’實施例2擴增管的組分配制擴增反應混合液的總體積為23μL，其組成如表1。
實施例3樣品預處理與基因擴增將棉拭子放入500μl生理鹽水中攪動，然后以12000r/min離心3min，棄上清，沉淀加入50μl預處理液，混勻，煮沸10min，12000r/min離心5min，取2μL上清添加至擴增反應管內，啟動擴增反應。反應條件如下93℃3分鐘變性；93℃45秒，55℃45秒，72℃1分鐘共35個循環；72℃5分鐘延伸。
實施例4結果檢測直接從反應后的擴增管中取10μL加樣，在含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠上電泳(5V/cm，40分鐘)，于紫外儀上觀察，對照陽性分子量標準，若相應位置上出現條帶則為該病原體陽性，如圖1由圖1可見樣本3未檢出病原體感染；樣本1擴增產物條帶大小為220bp，為沙眼衣原體(CT)單一感染；樣本2與4兩條擴增產物條帶大小分別為391和220bp，為淋球菌(NG)與沙眼衣原體雙重感染。
權利要求
1.一種性病混合感染PCR檢測試劑盒，其特征在于該檢測試劑盒包括預處理液、擴增管和陽性模板，所述的陽性模板在血液型擴增管中為含乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、梅毒螺旋體、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒或其中任意組合或單種病原體的特定基因序列的質粒載體；在分泌液型擴增管中為含白色念珠菌、解脲支原體、淋球菌、沙眼衣原體或其中任意組合或單種病原體的特定基因序列的質粒載體。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的預處理液為0.1-1.0mol/L氫氧化鈉溶液。
3.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的擴增管分為血液型或/和分泌液型。
4.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的擴增管由DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸、緩沖液、鎂離子、混合引物和水組成。
5.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述質粒載體的特定基因序列為以下所列基因或其中任意組合血液型的乙型肝炎病毒S基因、人免疫缺陷病毒gag基因、人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因、梅毒螺旋體TP0574基因、人巨細胞病毒UL123基因、單純皰疹病毒UL30基因；分泌液型的白色念珠菌自主復制序列、解脲支原體脲酶復合體ureB基因ureC基因、淋球菌B蛋白基因、沙眼衣原體DRP3基因。
6.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于擴增管中的混合引物在血液型中為針對乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、梅毒螺旋體、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒或其中任意組合或單種病原體的特異序列而設計的引物；在分泌液型中為針對白色念珠菌、解脲支原體、淋球菌、沙眼衣原體或其中任意組合或單種病原體的特異序列而設計的引物。
7.根據權利要求4和6所述的檢測試劑盒，其特征在于混合引物為以下所列核苷酸或含其中核苷酸序列，N代表4種任意脫氧核苷三磷酸；(1)血液型乙型肝炎病毒5’-NNNNNCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGANNNNN-3’5’-NNNNNTAGGGTTTAAATGTATACCCAAAGNNNNN-3’人免疫缺陷病毒5’-NNNNNAGAGGATCCAGGGGCAAATGGTANNNNN-3’5’-NNNNNTCCCGGTACCTGTCATGCTGTCANNNNN-3’人乳頭瘤病毒5’-NNNNNGTGGGGGAACCTGTGCCTGATNNNNN-3’5’-NNNNNTGTACCATTTGGGGGAGGCGANNNNN-3’梅毒螺旋體5’-NNNNNTTAGTAACGCTTGGGTCAGTCNNNNN-3’5’-NNNNNTTGTTGGTTGTAGGCTGTGGCNNNNN-3’人巨細胞病毒5’-NNNNNAGCCATTGGTGGTCTTAGGGANNNNN-3’5’-NNNNNTTGGGCTAACTATGCAGAGCANNNNN-3’單純皰疹病毒5’-NNNNNCCACCTGACGGTGTATTACAANNNNN-3’5’-NNNNNGCGCGACCGTCTCCTCTACCTNNNNN-3’(2)分泌液型白色念珠菌5’-NNNNNTAGCGATGAGGTAGTGCAAGNNNNN-3’5’-NNNNNGCTGCAGCTACGATTGTTAGNNNNN-3’解脲支原體5’-NNNNNTCCAGGTAAATTAGTACCAGGNNNNN-3’5’-NNNNNTCTCCTAATCTAACGCTATCANNNNN-3’淋球菌5’-NNNNNGCTACGCATACCCGCGTTGCTNNNNN-3’5’-NNNNNCGAAGACCTTCGAGCAGACATNNNNN-3’沙眼衣原體5’-NNNNNAGCACTCCAATTTCTGACTGTNNNNN-3’5’-NNNNNTCGATGATTTGAGCGTGTGTANNNNN-3’
全文摘要
本發明提供一種同步檢測10種性病病原體——乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒即艾滋病病毒、人乳頭瘤病毒、梅毒螺旋體、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒、白色念珠菌、解脲支原體、淋球菌、沙眼衣原體的同步檢測PCR試劑盒。試劑盒的擴增管分為血液型和分泌液型兩種，使用者只需將預處理后的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速地完成檢測工作。試劑盒能準確檢測早期感染、潛伏感染、未知病原體和癥狀不明顯的泌尿、生殖系統感染；且集成度高，一次可以檢測10種性病病原體，適于混合感染的篩查；樣本需要量小(微升級)，樣本種類可為血液或生殖器(道)分泌液，成本低，敏感性高，操作簡便，可杜絕交叉污染，適用于海關檢疫、流行監測、醫院篩查等。
文檔編號C12Q1/68GK1865451SQ200510036099
公開日2006年11月22日 申請日期2005年7月26日 優先權日2005年7月26日
發明者曾慶平, 馮麗玲, 楊瑞儀, 符林春 申請人:廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所