專利名稱：中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及葡萄常規雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖及基因克隆的方法與技術，特別涉及抗中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列及應用。
背景技術：
葡萄白粉病(Uncinula necator Schw.Burr.)是危害歐洲葡萄最為嚴重的真菌病害之一，遍布于世界各葡萄產區。對于白粉病的防治，早期以化學防治為主，但是，化學防治不僅增加生產成本，造成環境污染，還可能引起葡萄病害生理小種的變異及病原菌的抗藥性，同時降低葡萄及其加工產品的產量和品質。科學研究和生產實踐證明，利用植物自身抗病性，培育抗病、優質葡萄新品種是最經濟有效的措施之一。歐洲葡萄抗病能力差，美洲葡萄種及其品種抗病性強，但果實的“狐”味及其顯性遺傳的特點，又限制了其進一步應用；圓葉葡萄與歐洲葡萄雜交效率低。中國是葡萄屬植物重要的起源地之一，我國的野生葡萄資源不僅抗病，而且和歐洲葡萄雜交親和性好，可以有效地將抗病基因與歐洲葡萄品質性狀相結合，因而將中國野生葡萄白粉病抗性基因與歐洲葡萄品種優良品質基因有效結合，培育抗病優良葡萄新品種和創造新型葡萄種質是生產實踐中急需解決的實際問題。
植物能對特定的病原微生物進行識別并產生抗性，這是由抗病基因決定的。基因對基因假說認為，抗病基因是病原微生物致病基因的受體，能與致病因子復合物通過一系列信號傳導起始抗病反應，如發生過敏性反應、細胞壁增厚、壞死斑的出現以及防衛基因的表達等。抗病基因根據編碼的蛋白質結構上的異同，可以將除Hm1外的其他基因分為4大類，即含有核苷酸結合位點(NBS)和富含亮氨酸重復(LRR)的胞內受體蛋白基因；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)基因；含有胞外LRR結構的跨膜受體蛋白基因以及同時含有胞外LRR和胞內STK結構的跨膜受體蛋白基因，這些不同植物來源的抗病基因在結構上的保守性暗示了利用同源序列法分離抗病基因的潛在可能性。而基于同源序列的基因分離方法目前已逐漸受到重視，其中小麥抗葉銹病基因Lr10的分離是利用同源序列法進行抗病基因分離的首次成功報道。
發明內容
本發明的目的在于，提供中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因基因序列及其應用。
本發明是在對中國葡萄屬野生種進行抗病性鑒定，獲得刺葡萄(V.davidiiFoex)福建-4、塘尾2個株系抗病種質的基礎上，采用同源序列克隆法分離葡萄抗白粉病候選基因片段，進行序列同源性分析，為進一步利用cDNA末端快速擴增技術獲得抗病基因全長序列奠定基礎。
為了實現上述目的，本發明首次采用抗病基因同源序列技術進行中國葡萄屬野生種抗白粉病(Uncinula necator Schw.Burr.)候選基因克隆，獲得了抗白粉病候選基因DNA片段3個，其大小分別為507bp、513bp、513bp。以該核苷酸序列為基礎，可以進行抗白粉病基因標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗白粉病基因的探針；可以根據這些片段在中國野生葡萄與歐洲葡萄雜種后代中的分離情況，進行中國野生葡萄抗白粉病基因定位與作圖；可以根據這些片段設計特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術(Rapidamplification of cDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中國葡萄野生種抗白粉病基因，為通過基因工程改良葡萄品種的抗病性奠定基礎。
圖1是中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病特異DNA片段的獲得圖譜，其中M1.100bp DNA ladder，1、7、13引物為F1R1，2、8、14引物為F1R2，3、9、15引物為F1R3，4、10、16引物為F2R1，5、11、17引物為F2R2，6、12、18引物為F2R3；1-6.福建-4，7-12.塘尾，13-18.寧強-6；M.DNA Marker DGL2000；圖2是中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)福建-4抗白粉病候選基因序列；圖3是中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)刺葡萄塘尾(3)抗白粉病候選基因序列；圖4是中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)刺葡萄塘尾(5)抗白粉病候選基因序列；圖5是特異DNA片段在刺葡萄塘尾X歐洲葡萄粉紅玫瑰雜交后代中的分離情況圖譜，其中M.DNA Marker DGL 2000，1.塘尾，2-19.塘尾X粉紅玫瑰雜交后代。
以下結合發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
本發明獲得的中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)福建-4、塘尾2個株系共3個抗白粉病候選基因序列具體操作步驟如下A.采用改進的CTAB法(西北植物學報，王西平等，2003，23(3)473-476)提取中國葡萄屬野生種刺葡萄福建-4、塘尾2個株系葉片基因組DNA。
B.根據抗病基因N、L6及RPS2位于P-環(P-loop)上的GVGKTT，及位于基因弱疏水區上的GLPLAL保守結構域設計簡并PCR引物F1.5‘GGD GTD GGN AAR ACW AC 3’，F2.5‘GGT GGG GTT GGGAAG ACA AAG 3’與R1.5‘GAG GGC TAA AGG AAG GCC 3’，R2.5‘AGNGCY AAN GGY AAN CC 3’，R3.5‘CAA CGC TAG TGG CAA TCC 3’，共組成6對PCR引物進行擴增。這些引物由大連Takara公司合成。
在25μl PCR反應體積中加入PCR buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 0.5μl，模板DNA 100ng，引物11.5μl，引物21.5μl，Taq DNA聚合酶1U(5U/μl)，用雙蒸水補被齊體積至25μl，加入25.0μl礦物油。PCR擴增程序為94℃ 2min，94℃ 1min；50℃ 1min，72℃ 2min共35個循環；72℃，10min。取反應產物6.0μl跑1.5％瓊脂糖凝膠電泳(5V·cm-1)約40min，6對引物都獲得了擴增產物，其中引物對F1R3獲得了一條長度約為500bp的DNA特異帶(圖1)。
C.用DNA膠回收試劑盒將獲得的這一條約500bp左右的DNA條帶回收，連接pGEM-T easy載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培養，藍、白斑篩選鑒定挑選白色菌落培養。用UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒回收質粒，用EcoR I酶切鑒定有外源DNA片段插入的陽性克隆。將陽性克隆送大連寶生生物公司測序，測序結果表明獲得刺葡萄DNA特異片段3個(圖2-圖4)，大小分別為507bp、513bp、513bp。
以下是發明人給出的實施例，但不局限于這些實施例。
實施例1以保存于西北農林科技大學葡萄種質資源圃已進行抗白粉病鑒定的中國野生葡萄刺葡萄福建-4、塘尾(賀普超等，中國農業科學，1991；Wang Y etal，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄粉紅玫瑰、白玉霓的種間雜交后代65株及抗病雜種后代自交179株為試材，采用改良的CTAB法提取基因組DNA，根據獲得的抗白粉病候選基因序列設計特異引物，進行PCR擴增，據特異DNA片段在雜種材料中的表現情況(圖5)，對照上述葡萄材料的抗白粉病田間鑒定結果，獲得與葡萄抗白粉病基因緊密連鎖的DNA片段和抗白粉病基因DNA片段。
實施例2用保存于西北農林科技大學葡萄種質資源圃的中國葡萄屬野生種刺葡萄福建-4、塘尾、寧強-6等(賀普超等，中國農業科學，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄優良品種紅地球、皇家秋天雜交，獲得抗白粉病雜種植株。采用改良的CTAB法提取上述葡萄材料基因組DNA，根據實施例1獲得的與抗白粉病基因緊密連鎖的DNA片段設計引物，對上述葡萄材料基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產物出現DNA特異片段的雜種材料，為抗白粉病雜種植株，或者是抗白粉病基因的攜帶者，這些可以用做進一步抗病品種選育的材料和育種種質。
實施例3采用田間自然鑒定、田間接種鑒定對實施例2的葡萄雜種材料進行抗白粉病鑒定，獲得抗病雜種與感病雜種。據實施例2獲得的與抗白粉病基因緊密連鎖的DNA片段設計的引物，對上述葡萄雜種材料進行PCR擴增，據DNA片段在雜種中的擴增與分離情況，結合田間鑒定結果，利用MAPMAKER軟件進行抗白粉病基因定位與作圖，獲得抗病基因連鎖圖譜，為進一步通過圖譜克隆分離抗白粉病基因鑒定基礎。
實施例4將實施例1獲得的中國葡萄屬野生種抗白粉病基因部分DNA片段序列，用DNASTAR軟件設計特異5’RACE引物GSP1與3’RACE引物GSP2，用改進的SDS/酚法(果樹學報，張今今等，2003，20(3)178-181)提取中國葡萄屬野生種刺葡萄福建-4、寧強-6、塘尾葡萄葉片總RNA，逆轉錄分別合成5’RACE與3’RACEcDNA第一鏈。用5’RACE引物GSP1與3’RACE引物GSP2分別進行5’RACE與3’RACE PCR擴增。將5’RACE PCR產物與3’RACE PCR產物分別進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳獲得5’RACE與3’RACE全長序列。分別回收5’RACE與3’RACE全長序列并連接T載體。克隆、測序后，進行序列同源性分析，據5’RACE與3’RACE序列重疊區域合并成完整的cDNA全長序列，從而克隆了中國葡萄屬野生種抗白粉病基因，獲得抗白粉病基因序列，為通過基因工程提高歐洲葡萄品種的抗病性提供基因資源。
基因序列中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)福建-4抗白粉病候選基因序列1GGGGTAGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAATTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTTC TCATTCTAGA CGACGTGTGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACACAAAAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361 AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAATCTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGGCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)塘尾(3)抗白粉病候選基因序列1GGTGTTGGTA AGACTACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121 GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181 GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTAGATGAC241 ATATGGGAGC CGGTAAATCT ATCAGTCTTG GGTGTTCCAG TTCCAAATGA AGAAAATAAG301 TCCAAGCTAG TATTCACAAC CCGATCCGAG GATGTATGCC GCCAAATGGA AGCTCATAAG361 AATATCAAAG TGGAGTGCTT GGCATGGCAG GAATCCTGGG ATTTGTTTCA GAAGAAGGTT421 GGACAAGATA CTCTTGACTC CCATGCAGAA ATCCCCATGC AAGCTGAAAT GGTTGCCAAA481 GAATGTTGCG GATTGCCACT AGCGTTG中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)刺葡萄塘尾(5)抗白粉病候選基因序列1GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGCGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 CGGAAATTGA CAGTCACATT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGCGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361 AATGTTCATA AACTAAACCC TTTATCTAAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGGAATAT GGAAGATCAT CCAAACTTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGGCAAGT GTGGGGGATT GCCACTAGCG TTG
權利要求
1.中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列，其特征在于，包括福建-4、塘尾2個株系共3個中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列，這些中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列分別是刺葡萄福建-4抗白粉病候選基因序列1 GGGGTAGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAATTCAA181AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTTC TCATTCTAGA CGACGTGTGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACACAAAAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAATCTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG刺葡萄塘尾(3)抗白粉病候選基因序列1 GGTGTTGGTA AGACTACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTAGATGAC241ATATGGGAGC CGGTAAATCT ATCAGTCTTG GGTGTTCCAG TTCCAAATGA AGAAAATAAG301TCCAAGCTAG TATTCACAAC CCGATCCGAG GATGTATGCC GCCAAATGGA AGCTCATAAG361AATATCAAAG TGGAGTGCTT GGCATGGCAG GAATCCTGGG ATTTGTTTCA GAAGAAGGTT421GGACAAGATA CTCTTGACTC CCATGCAGAA ATCCCCATGC AAGCTGAAAT GGTTGCCAAA481GAATGTTGCG GATTGCCACT AGCGTTG刺葡萄塘尾(5)抗白粉病候選基因序列1 GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGCGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181CGGAAATTGA CAGTCACATT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGCGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATA AACTAAACCC TTTATCTAAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGGAATAT GGAAGATCAT CCAAACTTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAGT GTGGGGGATT GCCACTAGCG TTG。塘尾(3)抗白粉病候選基因序列1 GGTGTTGGTA AGACTACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTAGATGAC241ATATGGGAGC CGGTAAATCT ATCAGTCTTG GGTGTTCCAG TTCCAAATGA AGAAAATAAG301TCCAAGCTAG TATTCACAAC CCGATCCGAG GATGTATGCC GCCAAATGGA AGCTCATAAG361AATATCAAAG TGGAGTGCTT GGCATGGCAG GAATCCTGGG ATTTGTTTCA GAAGAAGGTT421GGACAAGATA CTCTTGACTC CCATGCAGAA ATCCCCATGC AAGCTGAAAT GGTTGCCAAA481GAATGTTGCG GATTGCCACT AGCGTTG塘尾(5)抗白粉病候選基因序列1 GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGCGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181CGGAAATTGA CAGTCACATT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGCGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATA AACTAAACCC TTTATCTAAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGGAATAT GGAAGATCAT CCAAACTTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAGT GTGGGGGATT GCCACTAGCG TTG。
2.中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列，包括福建-4、塘尾2個株系共3個中國葡萄屬野生種刺葡萄抗白粉病候選基因序列在進行抗白粉病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗白粉病基因的探針，以及抗病基因定位與作圖、克隆中國葡萄屬野生種抗白粉病基因的應用。
全文摘要
本發明涉及葡萄常規雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖及基因克隆的方法與技術。本發明采用抗病基因同源序列法(Resistant geneanalogus，RGAs)獲得中國葡萄屬野生種刺葡萄(V.davidii Foex)福建－4、塘尾2個株系抗白粉病候選基因DNA片段3個，對這些片段克隆測序后，其大小分別為507bp、513bp、513bp。以這些序列為依據，可以進行抗白粉病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗白粉病基因的探針；可以根據這些片段在中國野生葡萄與歐洲葡萄雜種后代中的分離情況，進行抗白粉病基因定位與作圖；也可以根據這些片段設計特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)(Frohman etal，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中國野生葡萄刺葡萄抗白粉病基因，為通過基因工程改良葡萄品種的抗病性奠定基礎。
文檔編號C12N15/82GK1683538SQ200510041759
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優先權日2005年3月7日
發明者王躍進, 王西平 申請人:西北農林科技大學