專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其在防治白粉病的生防制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物農藥領域，主要涉及一株枯草芽孢桿菌和其工業制備方法，本發明還涉及一種防治瓜類、煙草、蔬菜、草莓等經濟作物白粉病的的生防制劑。
背景技術：
白粉病菌的種類多、分布廣，目前在世界上已正式命名的大約有650多種。分屬于3個屬、6個種的真菌都可引起瓜類白粉病。瓜類白粉病主要由單囊殼白粉菌 (Podosphaera xanthii，原名為 Sphaerotheca fuliginea)禾口二3^( )" (Golovinomyces cichoracearum，原名為Erysiphe cichoracearum)引起的，是一種世界性病害，各種栽培條件下均可發生，常年危害，嚴重阻礙了瓜類的綠色生產。白粉病菌生理小種眾多，分化演替快，在不同地區和不同瓜類作物上的分布也不盡相同。迄今為止，單囊殼白粉菌生理小種有 11個，二孢白粉菌生理小種有2個。它具有氣流傳染、潛育期短、再侵染頻繁、流行性強等特點。該病對瓜類生產帶來嚴重的危害，在苗期造成瓜類生長減弱甚至死亡，生育期造成瓜果畸形，導致嚴重的經濟損失。因該病菌是專性寄生菌，這為室內防治該病的研究帶來了很大的困難。在我國，白粉菌G. cichoracearum主要分布在黑龍江、甘肅、青海、新疆、江蘇；而 P. xanthi主要分布在河北、內蒙、遼寧、江蘇、臺灣、廣西、云南、四川等地。目前，在我國一些地區也有瓜類白粉病菌的種類與生理小種鑒定的研究報道，如在杭州地區鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種2 ；在北京地區初步鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種1和2F，優勢生理小種為2F ；在海南三亞地區初步鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種1和2F，優勢生理小種為 2F，而且還可能存在新的生理小種；新疆和甘肅皋蘭地區鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種均為1 ；而長春地區鑒定出單囊殼白粉菌是該地區的主要白粉病菌。兩種白粉菌都是嚴格的專性寄生菌，它們的寄主范圍都很廣，除葫蘆科作物外，還可以侵染其它科的多種植物。兩種菌均具有明顯的寄生專化性，有許多不同的變種和生理小種，非瓜類作物上同屬同種的白粉菌，不一定能侵染瓜類作物。由于白粉病菌的生理小種分化嚴重，且易產生抗藥性。同時，由于農業設施的不斷興起，為白粉病的猖獗傳染提供了更有利的環境條件，該病害造成的經濟損失在逐年增加。在農業生產上，人們主要采用化學農藥防治此病，如杜邦福星乳油，烯哇醇、硫懸浮劑、 多硫懸浮劑、甲基托布津、百菌清、粉必清、綠穎、敵死蟲多抗靈、特富靈、粉銹寧、瑞毒銅、多菌靈、氟硅唑微、仙生、世高等。但現已發現白粉病菌對苯丙咪唑類、有機磷類、羥基嘧啶類、 甲氧基丙稀酸酯類和苯氧基喹啉類產生了抗藥性，很難達到預期的防治效果。化學農藥發展到20世紀60年代，“農藥公害”問題如農藥的高殘留、高抗病蟲害的猖獗發生、天敵生物群落的嚴重破壞及農業生態環境的污染等不斷暴露，且日益嚴重，在國際上引起了轟動，使農藥的發展發生了轉折，引出了生物農藥。生物農藥是指利用生物活體或其代謝產物對害蟲、病菌、雜草、線蟲、鼠類等有害生物進行防治的一類農藥制劑，或者是通過仿生合成具有特異作用的農藥制劑。隨著社會的發展、科技的進步及公眾環保意識的增強，減少使用化學農藥，保護人類生存環境的呼聲日益高漲，研究開發利用生物農藥防治農作物病蟲害，發展成為國內外植物保護科學工作者的重要研究課題之一。生物農藥具有安全、有效、無污染等特點，與保護生態環境和社會協調發展的要求相吻合。因此，近年來我國生物農藥的研究開發也開始呈現出新的局面。生物農藥在病蟲害綜合防治中的地位和作用顯得愈來愈重要。生防菌如賭蚧輪枝菌(Verticilliumlecanii)、哈茨木霉(Truchoderma harziamum)、Tilleiopsis pallescens、Τ· washingtonensis、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、堅強芽孢桿菌(B. firmus)、鏈霉菌 (Streptomycete spp)、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophlus)等對白粉病都有良好的防治效果。但生防菌株對白粉病的防效多數來源于溫室實驗結果，而絕大多數菌株在露天的大田中，由于受到紫外線或其他環境因素的影響，很難對白粉病的有良好的防治效果。瓜類作物在百姓的“菜籃子工程”中占有重要的地位。通過生物防治的方法控制白粉病的發生，對提高瓜類作物的品質、減少化學農藥的使用、促進農業生態系統的和諧發展有著重要的意義。
發明內容
本發明的目的就是為了適應有機農業的發展需求，提供一種枯草芽孢桿菌，可以有效解決現有技術所存在的問題。本發明的另一目的在于提供該枯草芽孢桿菌的工業制備及其應用。本發明的另一目的在于提供含有上述枯草芽孢桿菌的生防制劑。本發明的另一目的在于提供所述生防制劑的使用方法。本發明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京朝陽區北辰西路1號院；保藏編號為 CGMCC No. 4915 ；保藏日期2011 年 05 月 27 日。本發明的菌株為枯草芽孢桿菌FBR1，分離自山東鄒平縣城郊區的黃瓜根際中。該菌株的分離方法是稱根際土 10g，用無菌水進行梯度稀釋至10-6到10-5，取100 μ L涂在 NA固體平板上(NA培養基為牛肉浸膏3g，酵母浸膏lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊膠15g ； 蒸餾水1000. 0ml，pH6. 8-7. O。)，挑去單克隆，并進行純化，最終得到該菌株。該菌株的特征如下(1)在馬鈴薯蔗糖培養基上，生長速度快，12-M個小時可以長滿直徑為9厘米的培養皿，并呈明顯的同心圓狀，菌落呈膿狀，在菌落邊緣有褶皺；( 在LB培養基上，菌落呈膿狀，透明，凸起饅頭狀，表面光滑，不易產生褶皺；菌體呈球棒狀，大小為0. 5-0. 9 X 1. 9-2. 5 微米，鞭毛端生，具有運動性；產生芽孢，芽孢中生，呈橢圓型。( 該菌株在植物葉面定殖能力強，具有殺菌防病的作用；(4)好氧型，革蘭氏染色陽性；可以利用多種單糖或二聚糖， 可水解淀粉、纖維素、酪素及明膠，低于5°C或高于55°C都不能正常生長。本發明還公開了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl的工業生產方法，發酵培養基為玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.8%、碳酸鈣0. 15 %、硫酸鎂0.02%、消泡劑0.005 %、pH 7.0，用水定容；發酵溫度為，通氣量為0. 2v/v/min-0. 4v/v/min，攪拌速度為100-150轉/分鐘，發酵時間為M-36小時。優選的是所述發酵培養基中還包含蔗糖2. 0%。
本發明還公開了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl的工業生產方法，本發明還公開了該枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl在防治農作物白粉病中的應用。優選的是所述農作物為瓜類、蔬菜、煙草或者草莓。優選的是所述白粉病是由單囊殼白粉菌引起的。優選的是所述白粉病是由二孢白粉菌引起的。本發明還公開了一種生防制劑，所述生物制劑含有保藏號為CGMCCNo. 4915的枯草芽孢桿菌FBRl。本發明還公開了上述生物制劑的田間使用方法，將所述生物制劑稀釋0-1000倍。優選的是將所述生防制劑稀釋300-500倍。本發明的可以用于瓜類白粉病生物防治的菌株-FBR1，通過工業發酵得到其活性發酵液，用于大田瓜類白粉病的生物防治，而且治愈效果良好。該發明易于工業化生產、不產生工業三廢、對環境安全，對有機農業發展的有著重要意義。
附圖1示出了本發明菌體在顯微鏡下的形態。本發明菌體的保藏信息如下保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區北辰西路1號院；保藏日期2011年05月27日；保藏編號CGMCCNo. 4915。
具體實施例方式以下實施例僅用于對本發明做進一步的描述，并不是用來限制本發明的范圍。實施例1菌株活化及擴繁將菌株在LB固體培養基(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴繁，得到發酵種子。工業發酵培養基玉米粉1%、黃豆粉！^^、酵母粉化！^^蛋白胨化日^^磷酸二氫鉀 0.8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0.02%、消泡劑0.005%、蔗糖2.0%、pH 7. 0 ；發酵條件發酵溫度為^_35°C、通氣量為0. 4v/v/min，攪拌速度為100轉/分鐘、M小時；在發酵過程中，間隔2個小時取樣1次，測定pH值，觀察菌落形態。在芽孢數達到5%時，添料一次，在芽孢數達到90%時，停止發酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計數板來統計菌體數，每毫升中含有2億個活菌量。所得發酵液即為本發明的生物制劑。實施例2菌株活化及擴繁將菌株在LB固體培養基(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化鈉，pH值7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴繁，得到發酵種子。將發酵種子接種于玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0. 8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0. 02%、消泡劑0. 005%, pH 7. 0 ；發酵條件發酵溫度為、通氣量為0. 2v/v/min,攪拌速度為100轉/分鐘，發酵時間36小時；在發酵過程中，間隔2個小時取樣1次，測定pH值，觀察菌落形態。在芽孢數達到5%時，添料一次，在芽孢數達到90%時，停止發酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計數板來統計菌體數，每毫升中含有2億個活菌量。所得發酵液即為本發明的生物制劑。實施例3菌株活化及擴繁將菌株在LB固體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴繁，得到發酵種子。將發酵種子接種于玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0. 8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0. 01%、消泡劑0. 005%, pH 5. 5 ；發酵條件發酵溫度為30°C、通氣量為0. 2v/v/min，攪拌速度為100轉/分鐘、34小時；在發酵過程中，間隔 2個小時取樣1次，測定pH值，觀察菌落形態。在芽孢數達到5%時，添料一次，在芽孢數達到90%時，停止發酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計數板來統計菌體數，每毫升中含有2億個活菌量。所得發酵液即為本發明的生物制劑。實施例4菌株活化及擴繁將菌株在LB固體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴繁，得到發酵種子。將發酵種子接種于玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.2%、磷酸二氫鉀0. 8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0. 01%、消泡劑0. 005%, pH 7. 0 ；發酵條件發酵溫度為35°C、通氣量為0. 4v/v/min，攪拌速度為150轉/分鐘、36小時；在發酵過程中，間隔 2個小時取樣1次，測定pH值，觀察菌落形態。在芽孢數達到5%時，添料一次，在芽孢數達到90%時，停止發酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計數板來統計菌體數，每毫升中含有2億個活菌量。所得發酵液即為本發明的生物制劑。實施例5菌株活化及擴繁將菌株在LB固體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴繁，得到發酵種子。將發酵種子接種于玉米粉0. 5%、黃豆粉1 %、酵母粉0. 1 %、蛋白胨0. 5%、磷酸二氫鉀0. 3%、碳酸鈣0. 09%、硫酸鎂0. 02%、消泡劑0. 005%, pH 8. 5 ；發酵條件發酵溫度為35°C、通氣量為0. 4v/v/min,攪拌速度為150轉/分鐘、36小時；在發酵過程中，間隔2個小時取樣1次，測定PH值，觀察菌落形態。在芽孢數達到5%時，添料一次，在芽孢數達到90%時，停止發酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計數板來統計菌體數，每毫升中含有2億個活菌量。所得發酵液即為本發明的生物制劑。本發明生防制劑防治白粉病的田間防治效率實驗。1.實驗材料以黃瓜、煙草、草莓白粉病為實驗對象，測定FBRl制備的生物制劑控制白粉病的田間效果。生物制劑中有效活菌數為至少為2X109。2.實驗設計A稀釋100倍，葉面噴施；B稀釋300倍，葉面噴施；C稀釋500倍，葉面噴施；D稀釋800倍，葉面噴施；E稀釋1000倍，葉面噴施；CK清水對照。每個處理噴施100棵植株，重復3次。并間隔7到9天噴施一次。3.數據統計病害分級標準0級無病斑；1級-病斑面積占葉面積的1/4以下；2級-病斑面積占葉面積的 1/4-2/4 ；3級-病斑面積占葉面積的2/4-3/4 ；4級-病斑面積占葉面積的3/4以上。病情指數=[Σ (病級值X該級發病葉數)/(調查總葉數X最高病級值)]X100防治效率的計算公式=[1_(處理的病情指數/對照的病情指數)]X 100以SPSS統計軟件對數據進行分析。4.實驗結果下表是對黃瓜白粉病生防效果的數據
權利要求
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4915。
2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) FBRl在防治農作物白粉病中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征是所述農作物為瓜類、蔬菜、煙草或者草莓。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征是所述白粉病是由單囊殼白粉菌引起的。
5.根據權利要求2所述的應用，其特征是所述白粉病是由二孢白粉菌引起的。
6.一種制造如權利要求1所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的工業方法，其特征在于發酵培養基為玉米粉0. 5-1. 0%、黃豆粉1. 0-1. 5 %、酵母粉0-0. 1 %、蛋白胨0. 2-0. 5 %、磷酸二氫鉀0. 3-0. 8 %、碳酸鈣0. 09-0. 15 %、硫酸鎂0. 01-0. 02 %、消泡劑 0. 005%, PH 5. 5-8. 5，用水定容；發酵溫度為 28_;35°C，通氣量為 0. 2v/v/min_0. 4v/v/min， 攪拌速度為100-150轉/分鐘，發酵時間為24-36小時。
7.如權利要求6所述的工業方法，其特征在于所述發酵培養基中還包含蔗糖 0-2. 0%。
8.—種生防制劑，其特征是所述生防制劑含有保藏號為CGMCC No. 4915的草芽孢桿菌 FBRl。
9.根據權利要求8所述生防制劑的田間使用方法，其特征是將所述生防制劑稀釋 0-1000 倍。
10.根據權利要求9所述的使用方法，其特征是將所述生防制劑稀釋300-500倍。
全文摘要
本發明公開了一株枯草芽孢桿菌及其在防治白粉病的生防制劑中的應用，屬于微生物農藥領域，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBR1，保藏編號CGMCC No.4915；其工業發酵的培養基為玉米粉0.8％、黃豆粉1.5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.5％、磷酸二氫鉀0.8％、碳酸鈣0.15％、硫酸鎂0.02％、消泡劑0.001％、pH 7.0，用水定容；在發酵溫度為28-35℃、通氣量為0.2v/v/min-0.4v/v/min、攪拌速度為100-150轉/分鐘的條件下發酵24-36小時；本發明還公開了一種生防劑，包含所述的枯草芽孢桿菌，可以用于瓜類、蔬菜、煙草及草莓等經濟作物白粉病的防治，替代了化學農藥的噴灑，綠色環保，沒有污染。
文檔編號C12N1/20GK102250814SQ201110203240
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者熊國如, 范成明 申請人:范成明