專利名稱：胡蘿卜黑腐病的pcr檢測及鑒定優化方法
技術領域：
本發明涉及一種胡蘿卜黑腐病的PCR檢測及鑒定優化方法，屬于農作物病害防治領域。
背景技術：
我國是優質胡蘿卜原料的生產大國。黑龍江、吉林、青海、陜西、內蒙古、新疆、甘肅、寧夏等省區是我國優質胡蘿卜原料的主要產區，資源優勢和技術優勢的結合，將使我國可能成為國際上最大胡蘿卜優質工業原料和胡蘿卜功能食品的加工、出口國。近年來各地胡蘿卜種植面積迅速擴大，由于生產管理不善等因素，胡蘿卜病害逐漸加重。
由真菌Alternaria radicina和A.dauci是胡蘿卜上最重要的種傳、土傳真菌，在全世界胡蘿卜產區都能發現，在大田和儲藏期均可發病，引起葉片黑斑病和根部黑腐病。黑腐病主要特征是在胡蘿卜的葉柄，冠部和根部有壞死斑，在儲藏期發病嚴重，在潮濕的條件下很容易從一個胡蘿卜傳到另一個胡蘿卜上。Alternaria的分生孢子可以在顯微鏡下檢測，但是由于Alternaria radicina的分生孢子在大小和形態上與Alternaria dauci很相似。Alternaria dauci分生孢子單個著生，2個成串的很少見，5-11個橫隔，1個或幾個豎隔或縱隔。Alternaria radicina分生孢子單個著生，少數2個或3個成串，卵圓形，橢圓的，孢子兩端圓形，1-10個橫隔，幾個豎隔或縱隔，但從形態上很難準確鑒定。雖然已有冰凍封閉法和選擇性培養基法，但需7-14天才能判定結果，由于形態太相似，易導致鑒定有誤，況且，一旦病菌量太少就有可能無法鑒定。隨著現代分子生物學技術的發展，特別是PCR技術，為鑒定提供了了準確而又快速的方法。國外開展了這項研究，分別設計了特異性引物ARF25-AAT CAG CGTCAG TAA ACA AAC G-3，ARR35-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3鑒定出現頻率較高的Alternaria radicina和易與該種混淆的Alternaria dauci的特異引物對ADF25-GCA ATC AGC GTC AGT AAC AAC A-3，ADR15-CGC AAG GGG AGA CAAAAA-3。已有的PCR程序無預變性，導致擴增后經常檢測不到產物。
發明內容
本發明克服已有技術中的不足，提供一種操作簡單、結果可靠、效率高的植物病害的快速診斷鑒定方法。
用于檢測胡蘿卜黑腐病菌的PCR方法，其步驟是1胡蘿卜黑腐病菌菌株分離胡蘿卜病樣取病健交界處1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分鐘，再用滅菌水漂洗三次，每次3分鐘，涼干，在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養基25℃培養7天。
2胡蘿卜黑腐病病菌基因組DNA提取采用CTAB法進行(1)供試菌株在PDA液體培養基上25℃，100rpm生長5-7天，菌絲用滅菌的漏斗和濾紙過濾，放在50℃烘箱中烘24小時。
(2)用無菌刀片刮下菌絲放入滅菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。
(3)粉末轉入離心管中，加入750μLDNA提取液(100mM Tris pH8.0，100mMEDTA 250mM Nacl)100μL 10％的SDS，75μL的5mM Nacl，65μL10％CTAB充分混合后放入65℃水浴鍋中30分鐘。
(4)取出離心管于12000rpm離心10分鐘吸取上清液。加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)充分混勻后12000rpm離心10分鐘，吸上清液，重復抽提1-2次。
(5)加入2倍體積的冰無水乙醇，置于4℃冰箱中沉淀，12000rpm離心(6)10分鐘收集DNA沉淀。
(7)用70％乙醇洗滌一次；加入100-200μLTE溶液溶解，-20℃保存。3用于檢測胡蘿卜黑腐病特異性引物引物ARF25-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR35-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3引物稀釋至10um，分裝，-20℃保存。引物ARF2/ARR3在胡蘿卜黑腐病特異性擴增出343bp的產物。
4PCR反應擴增的體系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每個dNTP200um，每個引物1.5um，1.5單位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反應體積。
5PCR反應擴增反程序94℃預變性4min，PCR反應條件按每循環94℃變性2min，70℃40sec退火，72℃1min。擴增共進行35個循環。最后72℃延伸5min，PCR反應產物4℃保存。
6PCR產物鑒定取5μL擴增產物于3％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，脫色，置于UPV紫外成像系統上觀察成像。根據擴增產物的大小來判定結果。
本發明的有益效果對胡蘿卜黑腐病的早期快速診斷和病害防治具有重要的實用價值。本方案中加入了94℃預變性4min，使擴增的靈敏度提高。預變性在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環，模板DNA完全變性對PCR能否成功至關重要。經多次試驗，我們在已有的PCR擴增反應程序中增加了94℃預變性4min，使擴增效率大幅度提高，彌補了原技術的不足。
附圖是引物ARF2/ARR3對胡蘿卜病樣分離菌株進行的優化和未優化PCR擴增結果。
其中1、2、3泳道為胡蘿卜黑腐病菌用未優化PCR程序擴增結果，4、5泳道為胡蘿卜黑腐病菌用優化PCR程序擴增結果，6泳道為50bp DNALadder.7泳道為鐮刀菌菌株(Fusarium solani)。8泳道為陰性對照。
具體實施例方式
實施例一1引物ARF2/ARR3對胡蘿卜病樣分離出的兩種菌株(一種是鐮刀菌屬的菌株，一種是胡蘿卜黑腐病菌株)采用本優化程序進行的PCR擴增結果具體步驟如下1)胡蘿卜黑腐病菌菌株分離胡蘿卜病樣取病健交界處1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分鐘，再用滅菌水漂洗三次，每次3分鐘，涼干，在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養基25℃培養7天。
2)胡蘿卜黑腐病病菌基因組DNA提取采用CTAB法進行3)用于檢測胡蘿卜黑腐病特異性引物引物ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3引物稀釋至10um，分裝，-20℃保存。引物ARF2/ARR3在胡蘿卜黑腐病特異性擴增出343bp的產物。
4)PCR反應擴增的體系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每個dNTP200um，每個引物1.5um，1.5單位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反應體積。
5)PCR反應擴增反程序94℃預變性4min，PCR反應條件按每循環94℃變性2min，70℃40sec退火，72℃1min。擴增共進行35個循環。最后72℃延伸5min，PCR反應產物4℃保存。
6)PCR產物鑒定取5μL擴增產物于3％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，脫色，置于UPV紫外成像系統上觀察成像。根據擴增產物的大小來判定結果。
實施結果利用引物ARF2/ARR3以胡蘿卜病樣分離出的兩種菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，胡蘿卜黑腐病菌株擴增出產物為343bp的條帶，而鐮刀菌菌株沒有擴增出產物。說明鐮刀菌不是引起胡蘿卜黑腐病的病原菌。
2引物ARF2/ARR3對胡蘿卜黑腐病菌采用非優化程序的PCR擴增結果方法同實例優化程序的PCR擴增，不同的是PCR反應擴增程序中沒有94℃，4min的預變性。
實施結果同時利用引物ARF2/ARR3以胡蘿卜黑腐病菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增，結果只有三分之一樣品有擴增結果，三分之二樣品無擴增結果。而且條帶的亮度與PCR反應擴增程序中有94℃，4min的預變性條帶的亮度相比，擴增效果不如后者好。
實施例二利用Alternaria dauci的特異性引物ADF2/ADR1以胡蘿卜黑腐病菌菌株的基因組DNA為模板進行優化與非優化程序PCR擴增方法同實例1，只是采用用Alternaria dauci的特異性引物ADF25-GCA ATC AGC GTC AGT AAC AAC A-3ADR15-CGC AAG GGG AGA CAA AAA-3引物稀釋至10um，分裝，-20℃保存。(由北京三博遠志有限公司合成)實施結果利用Alternaria dauci的特異性引物ADF2/ADR1以胡蘿卜黑腐病菌菌株的基因組DNA為模板進行優化與非優化PCR擴增，均沒有擴增出條帶。說明我國胡蘿卜黑腐病是由真菌Alternaria radicina引起的。
權利要求
1.一種胡蘿卜黑腐病的PCR檢測及鑒定優化方法，包括以下步驟1)胡蘿卜黑腐病菌菌株分離胡蘿卜病樣取病健交界處1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分鐘，再用滅菌水漂洗三次，每次3分鐘，涼干，在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養基25℃培養7天；2)胡蘿卜黑腐病病菌基因組DNA提取采用CTAB法進行；3)胡蘿卜黑腐病病菌的PCR檢測中使用的特異性引物ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-34)PCR的反應體系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每個dNTP200um，每個引物1.5um，1.5單位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反應體積；5)PCR的擴增程序94℃預變性4min，PCR反應條件按每循環94℃變性2min，70℃40sec退火，72℃1min，擴增共進行35個循環，最后72℃延伸5min；6)取5μL擴增產物于3％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，脫色，置于UPV紫外成像系統上觀察，根據343bp擴增產物的有無來判定結果。
全文摘要
本發明用于檢測及鑒定胡蘿卜黑腐病菌的PCR方法，適用于檢測胡蘿卜黑腐病和早期診斷，準確鑒定引起該病的病原(Alternaria radicina)。屬于農作物病害防治領域。該方法根據胡蘿卜黑腐病菌的特異性引物檢測胡蘿卜黑腐病菌，擴增產物大小為343bp。同時，本方法對PCR的擴增程序進行了優化，增加了94℃預變性4min，提高了檢測的靈敏性。是對胡蘿卜黑腐病菌特異性引物檢測方法的補充和改進。
文檔編號C12Q1/68GK1824799SQ200510048769
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月27日 優先權日2005年12月27日
發明者黃瓊, 趙瑩瑩, 王云月, 孫躍先, 焦玉霞 申請人:云南農業大學