專利名稱：煙草扭脈病毒檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種快速、靈敏、特異檢測煙草扭脈病毒(TVDV)的方法，屬植物保護領域。
背景技術：
煙草叢頂病是近年來在全世界一些煙區頻繁爆發的一種毀滅性煙草病害。煙草叢頂病由煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒復合侵染引起。煙草叢頂病癥狀表現為葉片出現淡褐色壞死斑，隨后的新生葉片逐漸變小變圓并褪綠或黃化，植株矮縮。雖然煙草扭脈病毒單獨侵染煙株無明顯癥狀，但煙草扭脈病毒可以幫助煙草叢頂病毒進行蚜傳，加重煙草叢頂病毒的危害。
指示植物法、電鏡技術、酶聯免疫技術和分子生物學技術是常用的檢測病毒的方法。因為對煙草扭脈病毒的生物學特性了解很少，未有煙草扭脈病毒的指示植物報道，無法用指示植物對煙草扭脈病毒進行檢測。煙草扭脈病毒為球形粒體，主要分布在植株的韌皮部，且含量很少，很難在電鏡下觀察到。雖然煙草扭脈病毒可編碼外殼蛋白，但還沒有關于煙草扭脈病毒血清制備的報道，所以目前還不能利用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測。現在應用最為廣泛的檢測煙草叢頂病的方法是，利用總核酸提取檢測與煙草叢頂病相關的小分子RNA，但該方法不能檢測煙草扭脈病毒。因此要依賴傳統方法檢測煙草扭脈病毒比較困難。
發明內容
本發明克服了現有技術中的缺點，提供了一種快速、靈敏、特異地檢測煙草扭脈病毒的方法。
本發明的具體步驟是1、引物設計根據已報道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(序列號為AJ575129)設計了擴增煙草扭脈病毒外殼蛋白的特異性引物TVCPF/TVCPR，擴增的目的核酸帶大小為620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存備用；3、RT-PCR擴增(1)反轉錄合成cDNA取提取的總RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預變性4min，94℃變性1min、54-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-38次循環，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測取5μL PCR產物經0.8％-1.5％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在感染煙草扭脈病毒的煙株中擴增到620bp的核酸帶。
其中所述的退火溫度54-60℃，也可以是57-59℃；所述的循環數30-38次，也可以是31-33次；所述的瓊脂糖凝膠濃度0.8％-1.5％，也可以是1.1％-1.4％。
本發明的有益效果根據煙草扭脈病毒核苷酸序列設計的特異性引物TVCPF/TVCPR，提取植株組織的總RNA后，采用RT-PCR的方法，檢測煙草扭脈病毒。克服了不能用指示植物法、電鏡技術、酶聯免疫技術和總核酸提取法檢測煙草扭脈病毒缺點，能夠方便、特異、靈敏的檢測煙草扭脈病毒。
說明書附圖
圖1是感染煙草扭脈病毒的電泳檢測圖。
具體實施例方式實例一以已知的感染煙草扭脈病毒的煙株為檢測材料，并以健康材料為陰性對照。
1、引物設計根據已報道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(序列號為AJ575129)設計了擴增煙草扭脈病毒外殼蛋白的特異性引物TVCPF/TVCPR，擴增的目的核酸帶大小為620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存備用；3、RT-PCR擴增(1)反轉錄合成cDNA取提取的總RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預變性4min，94℃變性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，共30次循環，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測取5μL PCR產物經0.8％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在感染煙草扭脈病毒的煙株中擴增到620bp的核酸帶，而健康煙株中無擴增核酸帶。
實例二以已知的感染煙草扭脈病毒的煙株為檢測材料，并以健康材料為陰性對照。
1、引物設計根據已報道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(序列號為AJ575129)設計了擴增煙草扭脈病毒外殼蛋白的特異性引物TVCPF/TVCPR，擴增的目的核酸帶大小為620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存備用；3、RT-PCR擴增(1)反轉錄合成cDNA取提取的總RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預變性4min，94℃變性1min、60℃退火1min、72℃延伸2min，共38次循環，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測取5μL PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在感染煙草扭脈病毒的煙株中擴增到620bp的核酸帶，而健康煙株中無擴增核酸帶。
實例三以已知的感染煙草扭脈病毒的煙株為檢測材料，并以健康材料為陰性對照。
1、引物設計根據已報道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(序列號為AJ575129)設計了擴增煙草扭脈病毒外殼蛋白的特異性引物TVCPF/TVCPR，擴增的目的核酸帶大小為620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存備用；
3、RT-PCR擴增(1)反轉錄合成cDNA取提取的總RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預變性4min，94℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min，共36次循環，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測取5μL PCR產物經1％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在感染煙草扭脈病毒的煙株中擴增到620bp的核酸帶，而健康煙株中無擴增核酸帶。
權利要求
1.一種煙草扭脈病毒檢測方法，它包括以下步驟(1)引物設計根據已報道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(序列號為AJ575129)設計了擴增煙草扭脈病毒外殼蛋白的特異性引物TVCPF/TVCPR，擴增的目的核酸帶大小為620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG -3′TVCPR 5′-CTATITGGGGTFGTGCAATFGC -3′(2)總RNA提取①稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；②在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；③12,000rpm離心10min；④上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；⑤12,000rpm離心10min；⑥棄上清，沉淀用1mL70％乙醇洗滌，干燥10min；⑦沉淀用40μLDEPC處理水懸浮，-20℃保存備用；(3)RT-PCR擴增①反轉錄合成cDNA取提取的總RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入以下試劑
輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；②PCR擴增在PCR管中加入以下試劑
輕彈管壁混勻稍離心后94℃預變性4min，94℃變性1min、54-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-38次循環，最后72℃延伸10min；(4)電泳檢測取5μL PCR產物經0.8％-1.5％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在感染煙草扭脈病毒的煙株中擴增到620bp的條帶。
2.根據權利要求1所述的煙草扭脈病毒檢測方法，其特征在于PCR擴增中的退火溫度為57-59℃。
3.根據權利要求1所述的煙草扭脈病毒檢測方法，其特征在于PCR擴增中的循環數為31-33次。
4.根據權利要求1所述的煙草扭脈病毒檢測方法，其特征在于電泳檢測時所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.1％-1.4％。
全文摘要
本發明提供一種煙草扭脈病毒檢測方法，屬植物保護領域。根據煙草扭脈病毒核苷酸序列設計的特異性引物TVCPF/TVCPR，提取植株組織的總RNA后，采用RT－PCR的方法，檢測煙草扭脈病毒。該發明能有效克服指示植物法、電鏡技術、酶聯免疫技術和總核酸提取法的缺點，方便、特異、靈敏的檢測煙草扭脈病毒。
文檔編號C12Q1/68GK1827779SQ20051004873
公開日2006年9月6日 申請日期2005年12月22日 優先權日2005年12月22日
發明者李凡, 王鈺麗, 陳海如, 孫健, 蔡紅, 吳建宇, 秦西云, 孔寶華, 蘭平秀, 楊金廣 申請人:云南農業大學